黑果枸杞花色苷的提取、純化及降解動力學研究

連 敏，高藝瑋，年 新，王夢澤

（寧夏大學食品科學與工程學院，寧夏銀川 750021）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum）是西北地區(qū)特有的耐鹽抗旱茄科枸杞[1]，屬多棘刺生灌木的一種荒漠植物[2-4]。富含花色苷、多糖、維生素E、β-胡蘿卜素等多種抗氧化物質，具有緩解非酒精性脂肪肝，保護皮質神經(jīng)元、改善阿爾茨海默病，延緩衰老及滋補肝腎等功效[5-6]?；ㄉ兆鳛楹诠坭降闹饕πС煞郑浜繛?.14～21.79 mg/g[7-9]，花色苷具有強抗氧化性、抑制炎癥[10]、預防心血管疾病、抗腫瘤[11]、預防糖尿病和明目等功效[12-14]。

國內(nèi)外對黑果枸杞花色苷的提取研究主要集中以傳統(tǒng)干果為原料，通過溶劑[15]、微波輔助[16]、超聲波輔助及超臨界流體進行提取，其中溶劑提取是最常規(guī)的方法[17-19]，而在花色苷純化及降解方面報道較少?；ㄉ赵诤诠坭絺鹘y(tǒng)干果干燥過程中氧化降解較高、活性較低[20]，且單一的溶劑提取效率低，花色苷不能完全釋放、提取時間長[21]。因此，本文以凍干黑果枸杞為原料，通過單因素、正交試驗得到花色苷提取最佳工藝，研究了大孔樹脂對黑果枸杞花色苷靜態(tài)、動態(tài)吸附解吸特性及純化效果，并對花色苷在不同溫度、pH 條件下降解動力學進行了探討，旨在為黑果枸杞花色苷開發(fā)利用提供理論依據(jù)，促進西北優(yōu)勢特色植物資源高值化利用與鄉(xiāng)村振興。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凍干黑果枸杞（以鮮果為原料）寧夏森淼科技集團；無水乙醇 分析純，廣東光華科技股份有限公司；乙酸鈉、氯化鉀 分析純，上海阿拉丁生物科技股份有限公司；AB-8、D101、HDP100、X5、D130、DA201 大孔樹脂 天津光復精細化工研究院。

DXF-10D 型超微粉碎機 廣州市大祥電子機械設備有限公司；JA 2003 型電子分析天平 上海菁海儀器有限公司；DF-2 型磁力攪拌器 常州諾基儀器有限公司；754PC 型紫外-可見分光光度計 上海箐華科技儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料預處理 選取大小均一、品質優(yōu)良的鮮果凍干黑果枸杞，采用超微粉碎研磨成粉，過40 目篩，-80 ℃避光保存，使用前密封恢復至室溫。

1.2.2 黑果枸杞花色苷提取工藝 準確按照一定料液比稱取黑果枸杞粉于錐形瓶中，以乙醇溶液為提取劑，設置超聲功率300 W，在一定的超聲溫度下提取一定時間，得到黑果枸杞總花色苷的提取液。

1.2.3 單因素實驗設計 準確稱取黑果枸杞粉于錐形瓶中，采用乙醇溶液為提取劑，以黑果枸杞花色苷的含量為參考指標。以料液比1:20 g/mL、乙醇濃度60%、pH3、提取時間2 h 為固定值，研究了料液比（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25 g/mL），乙醇溶液的體積分數(shù)（20%、40%、60%、80%、90%），pH（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0），提取時間（1.5、2、2.5、3、3.5 h）。

1.2.4 正交試驗 根據(jù)單因素實驗結果，以黑果枸杞花色苷含量為考察指標，選取四個影響因素3 水平設計正交試驗L9（34）對黑果枸杞花色苷提取工藝進行優(yōu)化，正交因素水平設計如表1 所示。

表1 正交試驗設計Table 1 Orthogonal experimental design

1.2.5 總花色苷提取量的測定 取0.2 mL 的提取產(chǎn)物，分別用pH1.0 氯化鉀溶液與pH4.5 醋酸鈉緩沖溶液稀釋，室溫避光靜置適當時間，得pH1.0 和pH4.5供試品溶液，在510 nm 和700 nm 處測定吸光值，采用pH 示差法計算花色苷提取量[22]：

式中：TAC 表示總花色苷提取量（Total anthocyanin content，TAC），A（吸光值）=（Aλmax-A700nm）pH1.0-（Aλmax-A700nm）pH4.5；Mw（分子量）=449.2 g/mol，以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計；DF（稀釋因子）=20；?（摩爾消光系數(shù)）=26900 L/（mol·cm），以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷計；L（比色皿光徑長度）=1 cm；V：提取產(chǎn)物體積；m：提取樣品質量。

1.2.6 大孔樹脂吸附、解吸試驗

1.2.6.1 樹脂預處理 使用前，將大孔樹脂用無水乙醇溶液浸泡24 h，然后用無水乙醇溶液洗滌，直至流出液清澈。之后用去離子水洗滌樹脂至乙醇被取代，備用。

1.2.6.2 大孔樹脂的篩選 在錐形瓶中加入經(jīng)過預處理的樹脂（D130、D101、HPD100、AB-8、X5、DA201）各2 g，再向其中加入50 mL 用去離子水稀釋2 倍的黑果枸杞花色苷粗提液，于25 ℃、110 r/min的恒溫振蕩器中振蕩24 h，充分吸附后，將樹脂濾出，將濾出的樹脂用蒸餾水沖洗后，加入20 mL 乙醇溶液（80%）置于恒溫振蕩器上于25 ℃、110 r/min 下振蕩24 h，充分解吸后，將樹脂濾出，用pH 示差法，采用以下公式計算其吸附量和解吸量[23]。

1.2.6.3 AB-8 樹脂吸附上樣濃度 準確稱取2 g 經(jīng)過處理的樹脂于錐形瓶中，并向其加入同體積不同濃度的花色苷溶液（10、20、50、100、200、250 mg/100 g），于25 ℃、110 r/min 下恒溫振蕩3 h，測定其吸附量，吸附量最大值為AB-8 吸附的最佳上樣濃度[24]。

1.2.6.4 AB-8 樹脂洗脫乙醇濃度 將吸附飽和后的AB-8 大孔樹脂抽濾后置于100 mL 錐形瓶中，分別用40 mL 不同濃度的乙醇溶液（50%、60%、70%、80%、90%）進行洗脫，置于恒溫振蕩器，于25 ℃、110 r/min 振蕩24 h，充分解吸后過濾，測定其解吸量，選擇最佳乙醇濃度[25]。

1.2.6.5 AB-8 樹脂上樣溶液流速 將2 mg/mL 花色苷溶液分別采用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min 的流速等體積上樣，通過測定其吸附量來選擇最佳的上樣花色苷濃度[26]。

1.2.6.6 AB-8 樹脂上樣體積的確定 以2 mg/mL花色苷溶液，上樣溶液流速為2 mL/min，上樣體積為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 BV 時，并分別測定其流出液吸光度值。當流出液花色苷吸光度值為上樣液吸光度的1/10 時，此時樹脂達到吸附飽和，溶液發(fā)生泄漏，以此確定最佳的上樣體積[27]。

1.2.6.7 AB-8 樹脂乙醇溶液洗脫流速 將80%的乙醇濃度分別用1、2、3、4、5 mL/min 的流速對已吸附飽和的樹脂進行洗脫，每10 mL 接一次樣，收集流出液及洗脫液，測定其花色苷濃度，選擇最佳的洗脫流速[28]。

1.2.7 pH 和溫度對黑果枸杞花色苷降解動力學的研究 分別取5 份不同pH（3、4、5、6、7）的純化黑果枸杞花色苷溶液于離心管中密封，并將其在不同溫度（40、50、60、70、80 ℃）下水浴6 h。每個1 h 取樣一次，冰水浴，測定5 組花色苷含量，每組三次平行。

假定本實驗中黑果枸杞花色苷的降解符合一級動力學模型。根據(jù)式（4）計算動力學參數(shù)[29]：

式中：C0為溶液的初始花色苷含量，mg/mL；C為溶液加熱t(yī)時間時的花色苷含量，mg/mL；k 為降解速率，h-1；t 為加熱時間，h。

當C/C0=1/2 時，花色苷殘留率為50%，降解半衰期為：

采用Arrhenius 方程求得反應的活化能 Ea：

式中：k 為熱降解反應常數(shù)，h-1；k0為頻率常數(shù)，h-1；R 為氣體常數(shù)8.314 J/（mol·K）；T 為反應溫度，K；Ea為反應活化能，kJ/mol。

花色苷的Z 值和溫度系數(shù)Q10計算如下：

其中：T 為溫度（℃）；b 為線性方程的截距；K 為T ℃下的降解速率，h-1；T1、T2分別代表不同溫度；K1、K2分別為溫度為T1、T2時的反應速率常數(shù)。

通過式（9）、式（10）、式（11）計算焓變ΔH、吉布斯自由能ΔG 和熵變ΔS：

式中：h 為普朗克常數(shù)，6.6262×10-34J/s；kB為玻爾茲曼常數(shù)，1.3806×10-23J/K。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6 軟件進行正交分析，采用數(shù)據(jù)分析軟件Origin 2022 作圖。每組實驗重復3 次，試驗結果用平均值±標準差（±s）表示。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比的確定 不同料液比對花色苷提取量的影響，如圖1a 所示。當料液比為1:20 g/mL 時，花色苷提取量最高，為35.047±0.230 mg/g；料液比為1:5 g/mL 時，花色苷提取量最低。隨著料液比的增加，黑果枸杞花色苷提取量先升高后降低，這是由于花色苷極性較強，料液比增加擴大了料液接觸面積，加速花色苷的溶出。而料液比為1:10 與1:15 g/mL 時，花色苷提取量無顯著差異（P＞0.05）。隨著料液比的繼續(xù)增加，花色苷提取量增幅減小，這是由于相同溫度下，需要加熱的液體量增加，因此物料加熱緩慢，導致花色苷溶出緩慢，提取量降低[30]。

圖1 料液比、乙醇濃度、pH 和提取時間對花色苷提取量的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio,ethanol concentration,pH and extraction time on the amount of anthocyanoside

2.1.2 乙醇濃度的確定 不同乙醇濃度對花色苷提取量的影響，如圖1b 所示。當乙醇濃度從20%升到80%時，花色苷的含量逐漸升高，且乙醇濃度在80%時，花色苷的含量達到最大，為35.907±0.340 mg/g；乙醇濃度從80%到90%變化時，花色苷的含量逐漸降低，這是由于乙醇濃度太高，破壞花色苷結構，導致其含量降低[22]。因此，乙醇濃度為80%為提取花色苷的最佳提取溶劑。

2.1.3 pH 的確定 不同pH 對花色苷提取量的影響，如圖1c 所示。隨著pH 的增大，花色苷提取量逐漸增大，pH 為3 時達到最大，為33.207±0.335 mg/g，繼續(xù)增大pH，花色苷提取率反而有所降低，這是由于隨著pH 的增大，花色苷穩(wěn)定性降低，導致結構發(fā)生改變[31]。

2.1.4 提取時間的確定 不同提取時間對花色苷提取量的影響，如圖1d 所示。隨著提取時間的延長花色苷提取量先增大后減小，當提取時間為2.5 h，其花色苷的提取量達到最大，為35.637±0.316 mg/g。但隨著提取時間的延長，花色苷含量降低，這是由于提取時間過長，導致花色苷氧化降解[32]，因此，2.5 h 作為最佳提取時間。

2.2 正交試驗結果

2.2.1 正交設計試驗結果 正交試驗結果如表2 所示，極差結果表明，影響凍干黑果枸杞花色苷提取量的主次因素順序為：乙醇濃度＞料液比＞提取時間＞pH。由表3 可知，各因素對花色苷提取量表現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.01），綜合指標最優(yōu)組合為A3B1C3D1，即最佳提取條件為料液比1:25 g/mL、乙醇濃度60%、pH4、提取時間2 h。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results

表3 正交試驗方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal experiment

2.2.2 最優(yōu)提取條件驗證試驗 在最優(yōu)提取工藝條件為料液比1:25 g/mL、乙醇濃度60%、pH4、提取時間2 h 時進行驗證試驗，平行三次，得黑果枸杞中花色苷含量為36.507±0.325 mg/g，相較于正交試驗中最優(yōu)組合所得花色苷提取量更高，表明此條件具有可行性。

2.3 黑果枸杞花色苷的純化

2.3.1 大孔樹脂的篩選 6 種不同大孔樹脂對黑果枸杞花色苷吸附量和解吸量的影響，如圖2 所示，AB-8 樹脂的吸附能力最好，其吸附量為26.933±0.252 mg/g，解吸量為25.200±0.316 mg/g，這是由于AB-8 樹脂極性弱，與黑果枸杞花色苷結構中的弱極性基團結合能力較好[33]。因此，選擇AB-8 樹脂開展凍干黑果枸杞花色苷純化試驗。

2.3.2 AB-8 樹脂吸附上樣濃度 不同花色苷濃度對AB-8 樹脂吸附花色苷的影響，如圖3 所示。在一定范圍內(nèi)，吸附量隨著花色苷濃度增大而增大，當花色苷濃度達到200 mg/100 g 后吸附量趨于穩(wěn)定，這是由于上樣液濃度過大，上樣液會產(chǎn)生絮凝和沉淀，造成樹脂污染和阻塞[34]，其次是花色苷濃度過大，樹脂吸附飽和，多余花色苷流出[33]。因此，200 mg/100 g 是最適合動態(tài)吸附黑果枸杞花青素的樣品濃度。

圖3 花色苷上樣濃度對吸附量的影響Fig.3 Effect of anthocyanin loading concentration on adsorption capacity

2.3.3 AB-8 樹脂洗脫乙醇濃度 乙醇濃度對解吸量的影響，如圖4 所示，隨著乙醇濃度的提高，黑果枸杞花色苷的解吸量不斷增加，當乙醇濃度為80%時，黑果枸杞花色苷的解吸量達到最大。由于洗脫液與花色苷相似相容原理，80%的乙醇極性和黑果枸杞花色苷的極性相似，吸附在AB-8 樹脂上面的花色苷溶解于洗脫液中，進而被洗脫下來[35]，因此，選取濃度為80%的乙醇溶液作為解吸黑果枸杞花色苷的洗脫溶劑。

圖4 乙醇濃度對解吸量的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on desorption capacity

2.3.4 動態(tài)吸附溶液上樣流速的確定 上樣流速對黑果枸杞花色苷吸附效果的影響如圖5 所示。隨著上樣速度的增大，吸附量呈顯著（P＜0.05）的增加趨勢，當上樣流速達到2 mL/min 后，吸附量有明顯下降，根據(jù)實驗結果最終確定上樣流速為2 mL/min。上樣流速是影響大孔樹脂吸附效率的關鍵因素，若上樣速度過快，會使得原花色苷吸附量減少，導致花色苷樣品的浪費；若上樣流速太慢，雖然可以使大孔樹脂充分吸附花色苷，但是耗時較長，影響效率[36]。

圖5 上樣速度對AB-8 樹脂吸附量的影響Fig.5 Effect of loading rate on adsorption capacity of AB-8 resin

2.3.5 上樣體積的確定 上樣體積對吸附量的影響，如圖6 所示。隨著上樣體積的增加，流出液吸光度值呈增加的趨勢，當流出液體積為10 BV 時AB-8大孔樹脂對花色苷的吸附基本達到飽和。當上樣體積為5 BV 時，吸光度值為上樣液吸光度的1/10，認為此時為泄漏點。

圖6 吸附泄露曲線Fig.6 Adsorption leakage curve

2.3.6 動態(tài)洗脫流速的確定 洗脫流速對解吸量的影響，如圖7 所示，當解吸流速為1 mL/min 時，AB-8大孔樹脂對黑果枸杞花色苷的解吸量為24.200±0.400 mg/g，洗脫流速為2 mL/min 時解吸量為24.933±0.321 mg/g。考慮到洗脫流速越小，效率降低，因此，選擇洗脫流速為2 mL/min。

圖7 洗脫流速對解吸量的影響Fig.7 Effect of elution velocity on desorption

2.4 不同pH 和溫度下黑果枸杞花色苷降解動力學

由式（4）計算在不同pH 和溫度下黑果枸杞花色苷的降解速率，并進行線性回歸，結果見表4。結果表明，不同pH 和溫度下，純化后黑果枸杞花色苷的降解符合一級動力學反應模型（R2＞0.96）。

表4 黑果枸杞花色苷在不同pH 和溫度下的動力學參數(shù)Table 4 Kinetic parameters of anthocyanins in Lycium barbarum at different pH and temperature

如表4 顯示，相同pH 下，隨著溫度的升高黑果枸杞花色苷的降解速率常數(shù)k 增大，半衰期t1/2隨著溫度的升高而降低，花色苷穩(wěn)定性降低。說明在一定范圍內(nèi)，溫度越低，花色苷結構越穩(wěn)定。相同溫度條件下，花色苷的降解速率隨pH 的增大而加快，pH3.0 時，黑果枸杞花色苷活化能Ea最小，Z 值最大，說明其降解所需能量最大，花色苷最穩(wěn)定。

溫度系數(shù)Q10結果表明，pH3.0 時，Q10隨著溫度的升高而增加，這是由于高溫促進了花色苷的降解速率，在pH4.0～7.0 時，Q10隨著溫度的升高而降低，這是弱酸或中性條件下，由于花色苷結構發(fā)生改變，導致其熱穩(wěn)定性改變[37]。在黑果枸杞加工時，盡可能避免高溫處理。

黑果枸杞花色苷在不同pH 和溫度下的熱力學參數(shù)，如表5 所示，ΔH 代表反應前后的能量勢壘。ΔH 表明花色苷降解反應均為吸熱反應，高溫提供了更多花色苷降解所需的能量，活化絡合物的形成加快，使得達到能量屏障所需的時間減少[38]。相同pH 下，黑果枸杞花色苷熱降解的ΔH 相似，這表明在一定范圍內(nèi)的溫度變化不影響黑果枸杞花色苷降解的能量勢壘。pH 為3 時，ΔH 最大，說明花色苷最穩(wěn)定。

表5 黑果枸杞花色苷在不同pH 和溫度下的熱力學參數(shù)Table 5 Thermodynamic parameters of anthocyanins in Lycium barbarum at different pH and temperature

純化后，黑果枸杞花色苷熱降解的ΔG 在同一pH 不同溫度下變化不大（95.83～106.94 kJ/mol），這表明花色苷熱降解是非自發(fā)的。

ΔS 反映體系中分子的無序化，在同一pH 環(huán)境下，ΔS 變化范圍極為接近，說明溫度對花色苷降解的ΔS 影響較小。pH 為3 時，ΔS 的絕對值的變化范圍明顯低于pH 為5 時的值，說明pH 為3 時，黑果枸杞花色苷最不易被降解。

3 結論

本文以凍干黑果枸杞為原料，確定了黑果枸杞花色苷最佳提取、分離純化工藝，并研究了花色苷降解動力學。最佳提取工藝為料液比1:25（g/mL）、乙醇濃度60%、pH4、提取時間2 h，在此條件下，提取量高達36.507±0.325 mg/g；AB-8 型大孔樹脂純化黑果枸杞花色苷效果最好最佳工藝參數(shù)為上樣液濃度為200 mg/100 g，上樣流速為2 mL/min，洗脫流速為2 mL/min，上樣體積為5 BV；降解動力學結果表明：黑果枸杞花色苷的熱降解符合一級動力學模型，不同pH 下黑果枸杞花色苷熱穩(wěn)定性不同，隨pH 的降低，其穩(wěn)定性加強。本研究在后續(xù)將對黑果枸杞花色苷組分進行定性和定量分析，探索花色苷降解主要組分，通過研究多糖、蛋白等大分子與花色苷單組分的相互作用，以提高花色苷穩(wěn)定性，為黑果枸杞花色苷深度開發(fā)與應用奠定了理論與技術基礎。