UPLC-MS/MS 法同時測定養(yǎng)血軟堅膠囊中17 種成分的含量

劉永銘，劉樹森，熊軼喆，王 翔，吳玉云，劉 瑾，潘凌云，杜國慶，詹紅生?

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院石氏傷科醫(yī)學(xué)中心，上海 200021； 2.上海市中醫(yī)藥研究院骨傷科研究所，上海 201203； 3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076； 4.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200021； 5.上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實驗中心，上海 201203）

養(yǎng)血軟堅膠囊是全國名中醫(yī)、著名骨傷科專家石印玉教授研制的經(jīng)驗方［1-2］，由白芍、秦艽、甘草、全蝎、蜈蚣、牡蠣組成，具有養(yǎng)血活血、軟堅通絡(luò)功效，臨床上用于治療骨關(guān)節(jié)炎及疼痛，可有效改善疼痛性膝骨關(guān)節(jié)炎患者臨床癥狀，與其他相關(guān)藥物相比療效類似，但成本更低，安全性更高，有著進一步開發(fā)的價值［3-12］。

目前，養(yǎng)血軟堅膠囊中全蝎、蜈蚣顯微鑒別及鈣、鋅、鎂含量測定已有簡便快速的手段［13-14］，但該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅以馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷為指標(biāo)成分，難以全面反映其內(nèi)在質(zhì)量［15］。因此，本實驗參考2020 年版《中國藥典》 及文獻［16-21］，建立UPLC-MS/MS 法同時測定養(yǎng)血軟堅膠囊中中芹糖甘草苷、芍藥內(nèi)酯苷、獐牙菜苦苷、沒食子酸甲酯、苯甲酰芍藥苷、獐牙菜苷、6′-Oβ-D-葡萄糖基龍膽苦苷、異甘草素、馬錢苷酸、甘草素、沒食子酸、芍藥苷、氧化芍藥苷、龍膽苦苷、甘草酸、異甘草苷、甘草苷的含量，以期保證該制劑安全性和有效性，可為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定和后續(xù)藥動學(xué)、藥效學(xué)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 API Triple Quad 6500 三重四級桿線性離子阱質(zhì)譜儀，配置電噴霧離子化源（美國AB SCIEX 公司）； Acquity 超高效液相色譜系統(tǒng)（美國Waters 公司）； XSE105 電子分析天平 （瑞士Mettler-Toledo 公司）； E100H 超聲波清洗儀（德國Elma 公司）； 高速冷凍離心機（美國Scilogex 公司）； Milli-Q 型超純水系統(tǒng)（美國Milipore 公司）。

1.2 試劑與藥物 芹糖甘草苷 （ 批號J14HB188614，純度99.7%）、芍藥內(nèi)酯苷（批號O31GB166251，純度98.2%）、獐牙菜苦苷（批號M31HB181437，純度99.8%）、沒食子酸甲酯（批號AN1127SA14，純度99.3%）、苯甲酰芍藥苷（批號O10HB197203，純度98.9%）、獐牙菜苷（批號S24HB196112，純度99.8%）、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷 （批號 D01HB202760，純度99.7%）、異甘草素 （批號S26GB162199，純度98.4%）、馬錢苷酸 （批號M07HB177364，純度98.2%）、甘草素 （批號 C26A10Q87040，純度99.4%）、沒食子酸 （批號J05GB1537040，純度99.9%）、芍藥苷 （批號 M28GB143089，純度98.1%）、氧化芍藥苷（批號N26GB169459，純度99.2%）、龍膽苦苷（批號Y29A11Q112202，純度99.5%）、甘草酸 （批號Y02J11L113432，純度98.5%）、異甘草苷 （批號N16GB168197，純度98.2%）、甘草苷 （批號Z07J12X136344，純度98.9%） 對照品均購自上海源葉生物科技有限公司。養(yǎng)血軟堅膠囊共5 批（批號210903、220401、220402、220403、220801），由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院藥劑科提供，上海雷允上藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。甲醇、乙腈均為色譜純，購自西格瑪奧德里奇（上海） 貿(mào)易有限公司； 甲酸、乙酸銨均為色譜純，購自上海阿拉丁生化科技有限公司； 水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）； 流動相2 mmol/L 乙酸銨（含0.1%甲酸） （A） -乙腈（B），梯度洗脫，程序見表1； 體積流量0.3 mL/min； 柱溫40 ℃； 進樣量2 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），負離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM） 模式； 離子源噴霧電壓－4.5 kV； 氣簾氣241.3 kPa； 碰撞氣48.3 kPa；溫度550 ℃； 霧化氣413.7 kPa； 輔助氣413.7 kPa，其他參數(shù)見表2。

表2 各成分質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.3 對照品溶液制備 精密稱取對照品適量，甲醇溶解，置于5 mL 棕色量瓶中，制成1 mg/mL 貯備液，精密吸取適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得。

2.4 供試品溶液制備 精密稱取本品粉末0.35 g，置于50 mL 錐形瓶中，加入25 mL 甲醇超聲提取30 min，甲醇補足減失的質(zhì)量，3 000 r/min 離心5 min，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得（取續(xù)濾液約1 mL，甲醇稀釋10 倍后用于進樣，進樣量為2 μL）。

2.5 專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品溶液各10 μL，在“2.1” “2.2” 項條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，供試品溶液色譜圖中各成分在對照品溶液色譜圖相應(yīng)位置處有色譜峰，兩者光譜特征一致，并且各色譜峰之間無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分UPLC-MS/MS 色譜圖Fig.1 UPLC-MS/MS chromatograms of various constituents

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3” 項下對照品溶液適量，逐級稀釋，在“2.1” “2.2” 項條件下進樣測定。以對照品峰面積（Y） 對其質(zhì)量濃度（X） 進行回歸，結(jié)果見表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度試驗 精密吸取“2.3” 項下對照品溶液2 μL，在“2.1” “2.2” 項條件下進樣測定6次，測得芹糖甘草苷、芍藥內(nèi)酯苷、獐牙菜苦苷、沒食子酸甲酯、苯甲酰芍藥苷、獐牙菜苷、6′-Oβ-D-葡萄糖基龍膽苦苷、異甘草素、馬錢苷酸、甘草素、沒食子酸、芍藥苷、氧化芍藥苷、龍膽苦苷、甘草酸、異甘草苷、甘草苷峰面積RSD 分別為0.92%、1.67%、1.52%、1.68%、1.93%、1.51%、1.96%、1.67%、1.08%、1.43%、0.87%、1.95%、1.86%、1.75%、1.42%、1.82%、1.03%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.4” 項下供試品溶液適量，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” “2.2” 項條件下進樣測定，測得芹糖甘草苷、芍藥內(nèi)酯苷、獐牙菜苦苷、沒食子酸甲酯、苯甲酰芍藥苷、獐牙菜苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、異甘草素、馬錢苷酸、甘草素、沒食子酸、芍藥苷、氧化芍藥苷、龍膽苦苷、甘草酸、異甘草苷、甘草苷峰面積RSD 分別為 1.46%、3.30%、0.70%、3.16%、1.64%、2.69%、3.83%、1.91%、1.48%、2.34%、1.26%、3.40%、2.79%、1.75%、1.92%、2.07%、2.45%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗 取同一份本品，按“2.4” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” “2.2”項條件下進樣測定，測得芹糖甘草苷、芍藥內(nèi)酯苷、獐牙菜苦苷、沒食子酸甲酯、苯甲酰芍藥苷、獐牙菜苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、異甘草素、馬錢苷酸、甘草素、沒食子酸、芍藥苷、氧化芍藥苷、龍膽苦苷、甘草酸、異甘草苷、甘草苷峰面積RSD 分別為1.08%、2.50%、2.64%、1.18%、2.32%、2.18%、1.95%、2.29%、2.00%、2.38%、2.35%、1.73%、1.50%、2.88%、2.44%、1.73%、1.52%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的本品（批號220801） 6 份，每份約0.175 g，精密稱定，加入“2.3” 項下對照品溶液適量，按“2.4” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” “2.2” 項條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，芹糖甘草苷、芍藥內(nèi)酯苷、獐牙菜苦苷、沒食子酸甲酯、苯甲酰芍藥苷、獐牙菜苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、異甘草素、馬錢苷酸、甘草素、沒食子酸、芍藥苷、氧化芍藥苷、龍膽苦苷、甘草酸、異甘草苷、甘草苷平均加樣回收率分別為100.43%、93.79%、93.90%、98.03%、92.87%、103.59%、98.45%、103.39%、97.64%、103.32%、101.38%、91.33%、94.81%、99.44%、104.03%、95.85%、93.76%，RSD分別為2.43%%、3.50%、2.65%、1.91%、2.82%、2.21%、3.06%、2.69%、1.58%、1.92%、1.66%、2.38%、3.40%、2.47%、2.51%、1.68%、2.41%。

2.11 樣品含量測定 取5 批樣品，按“2.4” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” “2.2” 項條件下進樣測定，計算含量，結(jié)果見表4。

表4 各成分含量測定結(jié)果（mg/g，n＝5）Tab.4 Results for content determination of various constituents （mg/g，n＝5）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 養(yǎng)血軟堅復(fù)方在臨床上存在膠囊、片劑2 種劑型，但后者工藝研究尚未成熟，使用過程中逐漸被淘汰，目前大多應(yīng)用前者［22］。本實驗首先比較了不同提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇、甲醇），發(fā)現(xiàn)甲醇提取時各成分含量最高，再比較了不同提取時間（15、30、45 min），發(fā)現(xiàn)與提取15 min 時相比，提取30 min 時各成分含量更高，并且提取30、45 min 時無明顯差異，最終確定甲醇超聲提取30 min 作為供試品溶液制備方法。

3.2 流動相選擇 本實驗分別考察了水-甲醇、水-乙腈、0.1% 甲酸-乙腈、2 mmol/L 乙酸銨（含0.1% 甲酸） -乙腈，發(fā)現(xiàn)2 mmol/L 乙酸銨（含0.1%甲酸） -乙腈能顯著提高各成分色譜峰與雜質(zhì)峰之間的分離度，并且峰形更優(yōu)，最終確定其作為流動相。

4 結(jié)論

本實驗建立UPLC-MS/MS 法同時測定養(yǎng)血軟堅膠囊中芹糖甘草苷、芍藥內(nèi)酯苷、獐牙菜苦苷、沒食子酸甲酯、苯甲酰芍藥苷、獐牙菜苷、6′-Oβ-D-葡萄糖基龍膽苦苷、異甘草素、馬錢苷酸、甘草素、沒食子酸、芍藥苷、氧化芍藥苷、龍膽苦苷、甘草酸、異甘草苷、甘草苷的含量，該方法簡便準(zhǔn)確，可為該制劑全面科學(xué)的質(zhì)量評價提供參考。