TGF-β1 在膝關節(jié)骨性關節(jié)炎患者中的表達△

王聰聰，魏文濤，邵泓鑫，王加英，徐云*

（1.濰坊市人民醫(yī)院關節(jié)外科，山東濰坊 261041；2.濰坊市第二人民醫(yī)院，山東濰坊 261041）

膝關節(jié)骨性關節(jié)炎（knee osteoarthritis,KOA）是一種膝關節(jié)軟骨退行性疾病，KOA 的主要特征包括關節(jié)軟骨組織的漸進性失活，滑膜組織炎癥，軟骨下骨硬化和關節(jié)邊緣的骨贅形成并最終損害關節(jié)活動性［1］。KOA 發(fā)展的危險因素有年齡、環(huán)境、關節(jié)發(fā)育不良和損傷以及遺傳變異，但目前尚未完全了解該疾病的根本病因及加速因素。目前對膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的治療仍以減輕疼痛為主，而無法根治其軟骨損傷［2］。

三十多年前，在人類血小板中發(fā)現(xiàn)了TGF-β，并發(fā)現(xiàn)它在促進組織修復和再生方面具有潛在作用［3］。過去三十年的深入研究表明，TGF-β 相關細胞因子對細胞過程具有多種影響［4］。其作用是通過調節(jié)許多信號轉導途徑，最終改變基因表達。然而TGF-β 信號通路的功能障礙與許多人類疾病相關。目前研究發(fā)現(xiàn)在中日兩國的女性中，TGF-β1 信號區(qū)（T29 至C）的多態(tài)性和脊柱骨贅形成相關［5，6］。在Camuri-Engelmann 病中也發(fā)現(xiàn)了6～7 個TGF-β1 基因突變，導致TGF-β1 活性升高，患者有長骨硬化［7］。作者假設TGF-β1 的表達與膝關節(jié)骨性關節(jié)炎疾病存在相關性，對KOA 患者與非KOA 患者膝組織和血液TGF-β 進行檢測，現(xiàn)將結果報告如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料

KOA 組：2021 年1 月—2022 年6 月在本院經過術前檢查確診為KOA 并行全膝關節(jié)置換術的患者。其中，男16 例，女14 例；年齡59～72 歲，平均（64.3±4.1）歲。K-L 分級III 8 例、IV 級22 例。

對照組：2021 年1 月—2022 年6 月因非KOA疾病入院并住院患者共30 例。其中，男18 例，女12 例；年齡22～37 歲，平均（29.6±6.8）歲。此外，正常軟骨、軟骨下骨、滑膜組織標本13 份，取自前交叉韌帶急性損傷行韌帶重建及髁間窩成形術患者。男8 例，女4 例；年齡20～39 歲，平均（30.4±7.9）歲。

本研究相關人體組織標本均在簽訂知情同意書后采集，本研究已獲濰坊市人民醫(yī)院倫理委員批準。

1.2 檢測方法

血清TGF-β1 檢測：所有患者空腹12 h 后抽血2 ml，離心后取上層血清在-20℃冰箱內保存。按ELISA 法試劑說明書標準流程進行檢測。

術中獲得的軟骨、軟骨下骨、滑膜組織，固定、脫鈣、脫水、透明、浸泡、包埋。烘烤石蠟切片30 min 后使用二甲苯脫蠟，蒸餾水、緩沖液清洗。在玻片上滴加I 抗后4℃孵育12 h。用緩沖液沖洗3 次并且每次滴加II 抗后孵育1 h。沖洗玻片3 次，每次3 min，經二氨基聯(lián)苯胺法分別染色后顯色，觀察免疫組化染色結果并記錄。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用KS 檢驗檢測數(shù)據(jù)正態(tài)性，使用兩獨立樣本t檢驗。使用SPSS 軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結 果

2.1 血清TGF-β1 檢測結果

ELISA 法測定TGF-β1，KOA 組（1 929.1±76.8）pg/ml，對照組為（1 611.4±105.9）pg/ml。分析數(shù)據(jù)提示呈正態(tài)分布且方差齊，行兩獨立樣本t檢驗。兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P=0.022）。KOA 組血清中TGF-β1 的含量明顯升高。

2.2 軟骨組織TGF-β1 免疫組織化學染色

大體形態(tài)觀察見KOA 組軟骨表面粗糙，可見軟骨剝脫；對照組軟骨表面平整。

TGF-β1 免疫組織化學染色TGF-β1 染色陽性表現(xiàn)軟骨或骨陷窩為深棕色染色（圖1a），陰性則為軟骨或骨陷窩無棕色著色（圖1b）。KOA 組強陽性24例，陰性6 例，陽性率為80.0%；對照組陽性4 例，陰性9，陽性率為30.8%。KOA 組的TGF-β1 免疫組織化學染色的陽性率顯著高于對照組（P=0.002）。

圖1 TGF-β1 免疫組織化學染色。1a: 陽性表現(xiàn)為軟骨或骨陷窩為深棕色染色；1b: 軟骨或骨陷窩無棕色著色。Figure 1. Immunohistochemical staining for TGF-β1. 1a: The positive stain presented dark brown staining around the cartilage or bone lacunae;1b:The negative stain demonstrated no coloration around the cartilage or bone lacunae.

3 討 論

KOA 是一種以關節(jié)軟骨損傷的退行性病變，主要表現(xiàn)為膝關節(jié)軟骨變粗糙，部分軟骨剝脫，滑膜變性，軟骨下骨硬化［8，9］。TGF-β 是生長因子大家族，在早期胚胎發(fā)育和出生后生長中起關鍵作用，并調節(jié)不同組織或細胞群中的細胞增殖、分化、凋亡和遷移。即使對于相同的細胞群，在不同的微環(huán)境中，TGF-β 也可以發(fā)揮不同的功能［10，11］。在哺乳動物細胞中，TGF-β 以生物活性形式分泌，必須通過切割該潛伏相關肽結構域來激活TGF-β，以釋放成熟結構域。TGF-β1 通過與TGF-β1R1、TGF-β1R2 結合并激活Smads-（Smad2、Smad3）蛋白最終進入細胞核，通過Smad4、Smad7 蛋白的調控作用，增強或抑制相關基因轉錄從而發(fā)揮生物學作用［12］。

本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1 在KOA 患者中高表達，患者血清及膝關節(jié)相關組織中TGF-β1 均增加，說明可能與關節(jié)軟骨的破壞相關。最近的動物實驗研究結果提供了部分證據(jù)，TGF-β 信號通路與KOA 的發(fā)生和發(fā)展有一定的相關性。在天然小鼠膝關節(jié)中，注射低劑量TGF-β1 可增加關節(jié)軟骨的蛋白多糖含量［13］；然而，小鼠膝關節(jié)中TGF-β1 的過度表達會導致OA樣改變［14］。在轉基因小鼠中，過度表達TGF-β1 導致軟骨下骨結構異常和關節(jié)軟骨退變［15］。

有證據(jù)支持TGF-β 信號通路在早期軟骨發(fā)育和維持后期軟骨內環(huán)境穩(wěn)定中起著關鍵作用［16］。雖然BMP/SMAD1/5/8 途徑可能對軟骨具有有害作用，但TGF-β/SMAD2/3 途徑對軟骨具有雙重作用。故筆者在此提出一個假設，即維持一定的TGF-β 水平可以維持軟骨健康，低于或高于該范圍的任何濃度都可能導致TGF-β 途徑的異常改變，導致軟骨功能異常。本研究發(fā)現(xiàn)人體內高水平的TGF-β1 表達與KOA 具有相關性，下一步將對過低水平的TGF-β1 表達與KOA 的相關性進行研究。同時檢測參與TGF-β 信號通路的下游基因，并設法闡明它們在維持軟骨內環(huán)境穩(wěn)定和KOA 發(fā)展中的作用，為開發(fā)KOA 治療的新治療靶點提供參考。