基于GEO基因芯片聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)探討參苓脾喜湯治療慢性胃炎、胃黏膜上皮內(nèi)瘤變、胃早期癌作用機(jī)制

張玉佩，唐偉，2

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230000；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)附屬六安市中醫(yī)院，安徽 六安 237000

胃黏膜上皮內(nèi)瘤變（gastric intraepithelial neoplasia，GIN）是一種以細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)與其起源的正常胃黏膜組織存在不同程度不典型性為特征的病理學(xué)改變，屬于胃癌前病變，相當(dāng)于胃黏膜異型增生[1-2]。研究表明，GIN 與膽汁逆流、幽門螺桿菌（Hp）感染、飲食因素、免疫紊亂及患者年齡等因素有關(guān)[3-4]。GIN作為胃癌的癌前病變，其診斷及治療是防控胃癌的關(guān)鍵，也是胃癌二級預(yù)防的重點(diǎn)[1]。胃早期癌（early gastric cancer，EGC）指癌組織僅局限于黏膜層及黏膜下層，不論是否有區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。EGC患者手術(shù)（或內(nèi)鏡下切除）后5年生存率可達(dá)90%～95%[5]。但EGC多無典型臨床癥狀，大多數(shù)患者就診時已處于中晚期。Correa等[6-7]提出腸型胃癌的過程為“正常胃黏膜→慢性炎癥→萎縮性胃炎→腸化生→GIN→EGC→進(jìn)展期胃癌（Correa模式）”。GIN和EGC處于Correa模式的中間階段，早期識別并盡早有效干預(yù)，可有效提高患者生存質(zhì)量、改善預(yù)后。

參苓脾喜湯為唐偉教授在經(jīng)典名方參苓白術(shù)散基礎(chǔ)上化裁而成，其用于慢性胃炎（chronic gastritis，CG）、GIN及EGC的輔助治療療效較好。目前關(guān)于參苓脾喜湯防治CG、GIN、EGC的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制尚不明確。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)篩選CG、GIN、EGC轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵差異基因及靶點(diǎn)，從而闡明參苓脾喜湯防治CG、GIN、EGC炎癌轉(zhuǎn)變的潛在作用機(jī)制，以更好地發(fā)揮中醫(yī)藥治療GIN及EGC的作用，為后續(xù)相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 疾病靶點(diǎn)獲取

在GEO（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）數(shù)據(jù)庫中檢索“Early-stage gastric cancer”，篩選同時含有CG、GIN、EGC 患者的樣本，轉(zhuǎn)錄組芯片數(shù)據(jù)集GSE130823符合要求，獲取該芯片表達(dá)矩陣文件。其中，CG、GIN、EGC分別納入47個、31個（胃低級別上皮瘤變17個、胃高級別上皮瘤變14個）、16個單樣本數(shù)據(jù)。應(yīng)用R4.1.1 limma包計算CG、GIN及EGC之間的差異表達(dá)基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05、|log2FC|＞1.0，P＜0.05 的基因中，若log2FC＞1.0，則為上調(diào)基因，log2FC＜-1.0，則為下調(diào)基因，將處理后數(shù)據(jù)導(dǎo)入R4.1.1繪制火山圖。

1.2 參苓脾喜湯活性成分及靶點(diǎn)獲取

在TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫中檢索黨參、茯苓、白術(shù)、陳皮、蓮子肉、山藥、紫蘇梗、砂仁、豆蔻、薏苡仁、麥芽的活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件進(jìn)行篩選，通過以上數(shù)據(jù)庫獲取活性成分作用靶點(diǎn)。

1.3 交集靶點(diǎn)篩選及蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用R4.1.1 ggvenn 包將藥物作用靶點(diǎn)、CG、GIN、EGC 疾病靶點(diǎn)和差異表達(dá)基因取交集，導(dǎo)入STRING（https://cn.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”，隱藏?zé)o關(guān)靶點(diǎn)，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。利用Cytoscape3.9.1軟件繪制交集靶點(diǎn)蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，利用CytoNCA插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，以度中心性?倍中位值，介度中心性、接近中心性、特征向量中心性、局部邊連通性均大于中位值，篩選核心靶點(diǎn)。

1.4 GO功能和KEGG通路富集分析

利用R4.1.1的cluster profiler R包及Perl語言對所得基因進(jìn)行GO分析，包括細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）和生物過程（BP）。利用cluster profiler R包進(jìn)行KEGG通路富集分析，選取P≤0.05的分析結(jié)果進(jìn)行可視化，并選取GO中BP、CC、MF排名前10位條目及KEGG中排名前30位通路繪制柱狀圖。

1.5 分子對接驗(yàn)證

在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫下載參苓脾喜湯中藥活性成分結(jié)構(gòu)式，在PDB（https://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫下載核心蛋白結(jié)構(gòu)。采用PyMOL1.8.0軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行去水、去磷酸根等操作，利用AutoDock Tools 1.5.7軟件將活性成分與核心蛋白基因文件轉(zhuǎn)換為pdbqt格式并尋找活性口袋，通過Vina插件進(jìn)行分子對接，將輸出的分子對接結(jié)果導(dǎo)入PyMOL軟件以顯示分子對接結(jié)構(gòu)。結(jié)合能＜0 kcal/mol說明配體與受體可自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol及LibDockScore＞100表明兩者可穩(wěn)定對接。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選

在GSE130823數(shù)據(jù)集中篩選出1 115個差異表達(dá)基因，見圖1，其中上調(diào)基因502個、下調(diào)基因613個。

圖1 GSE130823數(shù)據(jù)集中CG、GIN、EGC差異表達(dá)基因火山圖

2.2 參苓脾喜湯活性成分及靶點(diǎn)

篩選出參苓脾喜湯活性成分138種，其中、白術(shù)7種、陳皮5種、黨參21種、豆蔻12種、茯苓15種、蓮子肉11種、麥芽18種、山藥16種、砂仁10種、薏苡仁9種、紫蘇14種，去重后得到119種活性成分。經(jīng)STRING數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化后得到對應(yīng)靶點(diǎn)247個。

2.3 中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)共有60個節(jié)點(diǎn)、159條邊，見圖2。共得到參苓脾喜湯治療CG、GIN、EGC潛在靶點(diǎn)22個，包括CHRM3、AR、ADRB2、DPP4、MTTP、NOS2、EPHB2、 ADRA2A、 SLC6A2、 XDH、 SLC2A4、MMP3、 FOS、 CYP3A4、 PTGER3、 DUOX2、NR1I2、CLDN4、GSTM2、DRD2、DRD5、ALB。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲲@示，度值排名前3位的活性成分依次是槲皮素、豆甾醇、木犀草素。

圖2 參苓脾喜湯治療CG、GIN、EGC中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，包含19個節(jié)點(diǎn)、54條邊。利用CytoNCA插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，得到?jié)點(diǎn)平均度值為5.68，介度中心性為0.079 8。以關(guān)聯(lián)蛋白線條目≥12為核心靶點(diǎn)。篩選后得到ALB、AR、DPP4、CYP3A4共4個核心靶點(diǎn)，見圖3。

2.5 GO功能和KEGG富集分析結(jié)果

將22個交集靶點(diǎn)導(dǎo)入R4.1.1進(jìn)行分析，得到269個GO 條目（見圖4）和30 條KEGG 通路（見圖5）。BP主要涉及腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號通路、對外源性刺激的反應(yīng)、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的調(diào)節(jié)、腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體信號通路等；CC主要涉及肌漿網(wǎng)、肌漿、細(xì)胞基膜、細(xì)胞基部等；MF主要涉及兒茶酚胺結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等。KEGG通路富集主要涉及化學(xué)致癌作用-受體激活、cAMP、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、IL-17、TNF等信號通路。

圖4 參苓脾喜湯治療CG、GIN、EGC靶點(diǎn)GO功能富集分析

圖5 參苓脾喜湯治療CG、GIN、EGC靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

2.6 分子對接驗(yàn)證

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合生物信息分析結(jié)果，將參苓脾喜湯中核心活性成分槲皮素、木犀草素、豆甾醇與核心靶點(diǎn)蛋白ALB、AR、DPP4 進(jìn)行分子對接驗(yàn)證（見表1、圖6）。結(jié)合能≤-7 kcal/mol表明結(jié)合良好，可見木犀草素與ALB、AR、DPP4對接良好，槲皮素與ALB、DPP4對接良好，豆甾醇與AR對接良好。

表1 參苓脾喜湯核心活性成分與CG、GIN、EGC核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)果

圖6 參苓脾喜湯核心活性成分與CG、GIN、EGC核心靶點(diǎn)分子對接示意

3 討論

目前對于EGC及GIN的治療，西醫(yī)主要使用根除Hp的三/四聯(lián)療法，運(yùn)用葉酸與抗氧化劑、環(huán)氧化酶2抑制劑、抗膽汁反流等治療藥物及進(jìn)行內(nèi)鏡下黏膜剝離術(shù)（內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)），容易引起機(jī)體耐藥性[8]。中醫(yī)對于CG、GIN、EGC的治療注重未病先防和既病防變，而復(fù)方中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多層次的作用特點(diǎn)，能有效調(diào)節(jié)CG、GIN、EGC病變微環(huán)境，改善臨床癥狀，干預(yù)胃黏膜病理改變，在一定程度上改善CG的異型增生和癌變趨勢[9]。參苓脾喜湯是在參苓白術(shù)散的基礎(chǔ)上以黨參代替人參，加大茯苓、白術(shù)的用量，去桔梗、白扁豆和甘草，加紫蘇梗、陳皮、麥芽、豆蔻加減化裁而成。本方以健脾化濕為主，兼以理氣醒脾和胃。中醫(yī)學(xué)中無“胃上皮瘤變”病名，因其多伴胃脘脹滿、疼痛、納呆等癥，故屬“胃脘痛”“痞滿”范疇。GIN和EGC以脾胃虛弱為本，氣滯、濕熱、血瘀、癌毒等病理因素為標(biāo)，而氣滯濕阻是GIN初期常見病機(jī)[10]，參苓脾喜湯能有效截斷CG、GIN、EGC病機(jī)變化，以阻斷胃黏膜癌變趨勢。

從分子對接結(jié)果來看，參苓脾喜湯排名前3位的活性成分與排名前3位的核心靶點(diǎn)均能有效對接。其中木犀草素與ALB、AR、DPP4對接良好，槲皮素與ALB、DPP4對接良好，豆甾醇與AR對接良好。槲皮素能抗癌、抗炎及抗氧化和清除自由基。祝珊珊等[11]研究表明，槲皮素能通過抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，調(diào)節(jié)p-PI3K和Bcl-2蛋白表達(dá)，起到抗胃癌細(xì)胞活性的作用；喻春紅等[12]研究表明，槲皮素通過抑制干擾素調(diào)節(jié)因子-8/人干擾素-γ軸，降低胃部炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)其胃分泌功能，從而改善Hp感染誘導(dǎo)的慢性萎縮性胃炎。木犀草素具有抗氧化、抗炎、抗菌功效，研究表明，其可通過EGFR、STAT3等通路抑制癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用，還可通過HIF-1α、JAK/STAT等通路抗胃癌細(xì)胞增殖和遷移、誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[13-14]。豆甾醇具有抗炎、抗腫瘤等生物活性[15-16]，其可抑制炎癥模型中炎癥因子白細(xì)胞介素（IL）-1β 和腫瘤壞死因子（TNF）-α 的水平，可能通過調(diào)節(jié)MAPK3 和cAMP/PRKACA等信號通路調(diào)控炎癥細(xì)胞因子水平，從而發(fā)揮抗炎作用[17]，這與KEGG富集分析結(jié)果一致。

PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，ALB、AR、DPP4、CYP3A4在炎癌轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。ALB是編碼白蛋白的基因，其可增強(qiáng)腫瘤特異性，降低藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，并在較長時間內(nèi)保持治療活性劑如藥物濃度[18]。ALB與全身炎癥反應(yīng)和營養(yǎng)狀況密切相關(guān)，參與清除自由基、維持膠體滲透壓[19]。AR基因編碼雄激素受體，是雄激素作用的關(guān)鍵基因，與多種癌癥關(guān)系密切。研究表明，AR可通過刺激CCRK的表達(dá)，促進(jìn)GSK3β和β-catenin磷酸化、EGFR表達(dá)及胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖，從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生與發(fā)展，該基因在食管鱗癌上皮內(nèi)瘤變中呈陽性表達(dá)，且表達(dá)隨異性程度加重而增加[20-21]。DPP4是一種膜結(jié)構(gòu)蛋白酶，可調(diào)節(jié)糖代謝、胰島素分泌、胃腸動力學(xué)等。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DPP4抑制劑可減少腸道炎癥并改善葡萄糖代謝，其可通過CXCR4 刺激誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞惡化[22-23]。CYP3A4是人體內(nèi)一種重要的細(xì)胞色素P450酶，主要在肝臟中表達(dá)，參與藥物代謝和許多內(nèi)源性化合物代謝。研究發(fā)現(xiàn)，CYP3A4的表達(dá)可能與慢性萎縮性胃炎向胃癌的潛在致癌轉(zhuǎn)化有關(guān)[24]。

從KEGG 富集分析結(jié)果來看，參苓脾喜湯防治CG、GIN、EGC 病變主要涉及細(xì)胞增殖、分化與凋亡，炎癥及免疫反應(yīng)通路。較為顯著的信號通路有cAMP、鈣信號通路、IL-17、TNF等。cAMP信號通路是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號傳遞機(jī)制，參與調(diào)控代謝、細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)過程。異常的cAMP/PKA信號傳導(dǎo)與各種類型的人類腫瘤有關(guān)，可能同時具有腫瘤抑制和腫瘤促進(jìn)作用。研究表明，cAMP升高和PKC下調(diào)可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制胃癌細(xì)胞增殖，從而抑制胃癌進(jìn)展[25-26]。鈣信號通路參與真核細(xì)胞跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對細(xì)胞的生存與凋亡起著重要調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，鈣信號通路能介導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)損傷胃上皮細(xì)胞遷移和修復(fù)[27]。TNF是由單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒因子，可介導(dǎo)炎性反應(yīng)、免疫、細(xì)胞凋亡或存活等生物過程，包括TNF-α、TNF-β 等。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在慢性炎性反應(yīng)介導(dǎo)胃癌發(fā)生的過程中發(fā)揮重要作用，且可參與胃癌發(fā)生，癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，及新生血管形成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多個病理過程[28]。IL-17是一類主要由活化CD4+淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的具有促炎作用的細(xì)胞因子，可分泌炎性和造血性細(xì)胞因子，也與自身免疫和腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，胃癌患者血清IL-17明顯升高，且隨著病情進(jìn)展持續(xù)升高[29]。

綜上所述，參苓脾喜湯可通過槲皮素、豆甾醇、木犀草素等成分作用于ALB、AR、DPP4、CYP3A4等基因，調(diào)控cAMP、IL-17、TNF、鈣信號通路等抑制胃癌細(xì)胞的增殖與遷移、誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)，以防治CG、GIN、EGC 病變。研究顯示，CG、GIN、EGC的發(fā)病、轉(zhuǎn)歸受多個靶點(diǎn)、通路共同影響，且參苓脾喜湯阻斷CG、GIN、EGC病變優(yōu)勢顯著。本研究可為中藥復(fù)方防治EGC提供參考依據(jù)，但仍存在不足之處，需要動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究予以驗(yàn)證。