基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討芪術(shù)肺纖湯治療特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制Δ

張雯靜,王秋銘,李 萌,劉世剛,高 揚(yáng),李 輝,李國勤

(中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院呼吸科,北京100053)

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是以進(jìn)行性肺纖維化為特征的間質(zhì)性肺炎,臨床多表現(xiàn)為喘息氣短、干咳和活動后呼吸困難等,常伴有不可逆的肺功能喪失,病因不明,預(yù)后不良[1]。IPF患者確診后的中位生存期僅有3～5年,發(fā)病率隨年齡增長而升高[2]。目前,西醫(yī)主要采用抗纖維化藥物、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等延緩疾病進(jìn)展,不良反應(yīng)大[3-4]。中醫(yī)辨證施治IPF,可有效改善臨床癥狀,提高患者生活質(zhì)量。李國勤教授為我院首都名中醫(yī),對中醫(yī)辨治IPF有獨(dú)到見解,李教授認(rèn)為IPF患者以氣虛絡(luò)痹為基本病機(jī),本在肺脾不足,宗氣虧虛,結(jié)局為久病及腎,痰瘀阻滯肺絡(luò)貫穿始終,治療應(yīng)以補(bǔ)氣通絡(luò)為主[5-6]。芪術(shù)肺纖湯是李教授多年治療IPF的經(jīng)驗(yàn)所集,由黃芪、紅景天、苦杏仁、黨參、全蝎、莪術(shù)、黃精和巴戟天8味藥組成,具有補(bǔ)益肺脾腎、化瘀祛痰的功效。前期臨床研究結(jié)果證明,芪術(shù)肺纖湯可改善并延緩IPF患者的肺功能損害,減輕喘息咳痰等癥狀,增加運(yùn)動耐量,改善患者生活質(zhì)量[7-8]。但至今其藥理作用機(jī)制尚未完全闡明,因此,從分子角度探索芪術(shù)肺纖湯治療IPF的藥理作用機(jī)制是非常必要的。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)分析芪術(shù)肺纖湯治療IPF的作用機(jī)制,以期為臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 獲取芪術(shù)肺纖湯活性成分及靶點(diǎn)

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索芪術(shù)肺纖湯活性成分及靶點(diǎn),利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理;對于未檢索到的全蝎和紅景天,采用BATMAN數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)、中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/)和本草組鑒數(shù)據(jù)庫(http://herb.ac.cn/)獲取活性成分后合并去重,通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取對應(yīng)的Canonical SMILES號上傳至Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://swisstargetprediction.ch/),研究物種選取“Homo sapiens”,條件設(shè)為“Probability>0”進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測,剔除無化學(xué)結(jié)構(gòu)和無靶點(diǎn)者,將所有數(shù)據(jù)合并即為芪術(shù)肺纖湯的活性成分及靶點(diǎn)。

1.2 獲取IPF疾病靶點(diǎn)

以“Idiopathic Pulmonary Fibrosis”為關(guān)鍵詞,“Homo Sapiens”為目標(biāo)物種,檢索GeneCards(https://genealacart.genecards.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)、人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(OMIM,https://omim.org/)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/),獲取IPF疾病靶點(diǎn)。

1.3 獲取芪術(shù)肺纖湯治療IPF的核心靶點(diǎn)及PPI網(wǎng)絡(luò)圖

利用Venny 2.1.0在線軟件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將芪術(shù)肺纖湯與IPF靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖,導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org),以“Homo Sapiens”為物種獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)關(guān)系,以“≥2倍的度值中位數(shù)”為條件利用Cytoscape軟件(https://cytoscape.org/download.html)篩選得到芪術(shù)肺纖湯治療IPF的核心靶點(diǎn),繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 建立中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

篩選前30位核心靶點(diǎn)及對應(yīng)成分,以節(jié)點(diǎn)表示中藥成分、靶點(diǎn)、藥物、方劑和疾病,邊表示節(jié)點(diǎn)之間的相互關(guān)系,導(dǎo)入Cytoscape軟件,構(gòu)建中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病圖。

1.5 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)和Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)對交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,分別篩選P值排序居前10位的GO-生物過程(BP)、GO-分子功能(MF)和GO-細(xì)胞組成(CC)富集結(jié)果及排序居前20位的KEGG富集結(jié)果,采用微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)制成柱狀圖進(jìn)行可視化。

1.6 建立中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病-通路網(wǎng)絡(luò)圖

將前30位核心靶點(diǎn)、活性成分、藥物、方劑、疾病、通路信息導(dǎo)入Cytoscape軟件,構(gòu)建中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病-通路圖。

1.7 分子對接

篩選度值排序居前10位的核心靶點(diǎn),通過反向分子篩選對應(yīng)活性成分,利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取mol2格式的活性成分3 D結(jié)構(gòu),未檢索到3 D結(jié)構(gòu)者通過PubChem數(shù)據(jù)庫獲取sdf格式,通過Open Babel GUI軟件(http://openbabel.org/wiki/Category:Installation)轉(zhuǎn)換為mol2格式;通過PDB蛋白質(zhì)在線數(shù)據(jù)庫(https://www1.rcsb.org/)下載前10位核心靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),使用Autoduck vina軟件(https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/)將靶點(diǎn)和活性成分虛擬對接,使用Pymol軟件(https://pymol.org/2/)進(jìn)行可視化圖形展示。分子虛擬對接結(jié)合能<-17.77 kJ/mol,表示具有一定的結(jié)合活性,<-20.90 kJ/mol表示結(jié)合活性較好,<-29.26 kJ/mol表示結(jié)合效能更佳[9]。

2 結(jié)果

2.1 芪術(shù)肺纖湯活性成分及靶點(diǎn)

共獲得芪術(shù)肺纖湯活性成分445個,對應(yīng)靶點(diǎn)基因4 705個。其中,黃芪活性成分51個,靶點(diǎn)756個;紅景天活性成分25個,靶點(diǎn)616個;苦杏仁活性成分76個,靶點(diǎn)780個;黨參活性成分86個,靶點(diǎn)740個;全蝎活性成分5個,靶點(diǎn)170個;莪術(shù)活性成分60個,靶點(diǎn)507個;黃精活性成分27個,靶點(diǎn)373個;巴戟天活性成分115個,靶點(diǎn)763個。

2.2 IPF疾病靶點(diǎn)

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得3 523個IPF疾病靶點(diǎn),DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲得734個靶點(diǎn),Drugbank數(shù)據(jù)庫獲得39個靶點(diǎn),OMIM數(shù)據(jù)庫獲得13個靶點(diǎn),OMIM genemap數(shù)據(jù)庫獲得347個靶點(diǎn),合并去重后共獲得IPF疾病靶點(diǎn)4 509個。

2.3 芪術(shù)肺纖湯治療IPF的核心靶點(diǎn)

共獲得456個交集靶點(diǎn),篩選后得到101個核心靶點(diǎn),可視化分析得出PPI網(wǎng)絡(luò)圖,見圖1。圖1中,靶點(diǎn)越大、顏色越深,表明節(jié)點(diǎn)度值越大,靶點(diǎn)越重要。度值排序居前10位的靶點(diǎn)有蛋白激酶B1(Akt1)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、人β-肌動蛋白(ACTB)、腫瘤蛋白p53(TP53)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)和表皮生長因子受體(EGFR)。

圖1 芪術(shù)肺纖湯治療IPF核心靶點(diǎn)的PPI圖

2.4 中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病圖

通過Cytoscape軟件構(gòu)建中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖,表明芪術(shù)肺纖湯通過多成分、多靶點(diǎn)發(fā)揮對IPF的治療作用,見圖2。

紅色節(jié)點(diǎn)表示藥物名稱,深藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示方劑名稱,深紫色節(jié)點(diǎn)表示疾病名稱,橘黃色節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn),其余節(jié)點(diǎn)表示各個藥物的活性成分。

2.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

共獲取GO富集結(jié)果1 148個,其中GO-BP、GO-CC和GO-MF分別有735、155和258個;KEGG富集結(jié)果196個。前30位GO富集結(jié)果三合一柱狀圖見圖3;前20位KEGG結(jié)果柱狀圖見圖4。表明芪術(shù)肺纖湯通過多通路治療IPF,且磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)通路可能是涉及的最主要的信號通路,見圖5。因臨床對惡性腫瘤研究廣泛,PI3K-Akt通路又屬癌癥通路和脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路范圍內(nèi),因此,KEGG結(jié)果中雖然癌癥通路和脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路數(shù)量較多,但不具代表意義。

圖3 GO富集分析三合一柱狀圖

圖4 KEGG富集分析前20條通路柱狀圖

綠色矩形為未識別蛋白,紅色矩形為已識別蛋白。

2.6 中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病-通路圖

利用Cytoscape軟件,構(gòu)建中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病-通路網(wǎng)絡(luò)圖,見圖6。

綠色節(jié)點(diǎn)代表核心靶點(diǎn),橘紅色節(jié)點(diǎn)代表活性成分,粉色節(jié)點(diǎn)代表KEGG通路,藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表藥物,黃色節(jié)點(diǎn)代表方劑,紫色節(jié)點(diǎn)代表疾病。

2.7 分子對接結(jié)果

分子對接結(jié)果顯示,大部分活性成分均能與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合良好,其中以熊果酸、芹菜素、木犀草素、槲皮素與TP53、TNF、Akt1、IL-1β、IL-6、VEGFA結(jié)合能力較強(qiáng),結(jié)合能<-20.90 kJ/mol者見表1,部分結(jié)合能<-29.26 kJ/mol的分子對接結(jié)果可視化見圖7。

表1 芪術(shù)肺纖湯治療IPF的前10位核心靶點(diǎn)與活性成分的分子對接結(jié)果

玫紅色表示活性成分與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合部分;黃色虛線表示連接氫鍵;白色表示殘基名稱。A.TP53-熊果酸;B.TP53-木犀草素;C.VEGFA-熊果酸;D.TNF-熊果酸;E.IL-1β-熊果酸;F.IL-6-熊果酸;G.TNF-芹菜素;H.Akt1-芹菜素;I.IL1β-槲皮素;J.Akt1-木犀草素;K.VEGFA-芹菜素;L.Akt1-山柰酚。

3 討論

IPF為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病名,中醫(yī)一般歸屬為“肺痹”“肺痿”“咳嗽”和“喘證”等范疇。李教授認(rèn)為,“肺痹”多為結(jié)締組織病相關(guān)的間質(zhì)性肺病,而IPF應(yīng)屬中醫(yī)學(xué)“肺痿”范疇[10]。肺氣虧虛,復(fù)感外邪,肺失宣肅而發(fā)咳喘,氣病可及血,血病亦可及氣,正如《素問·調(diào)經(jīng)論》中記載,“血?dú)獠缓?百病乃變化而生”。肺氣虛則肺絡(luò)血行不暢,凝而成瘀,故采用芪術(shù)肺纖湯,以黃芪、紅景天為君,補(bǔ)肺活血、化瘀通絡(luò);瘀血停滯日久津液內(nèi)停,化生痰濁,故臣以莪術(shù)活血祛瘀,全蝎搜風(fēng)剔邪、活血通絡(luò);苦杏仁祛痰止咳、降逆平喘,主入肺經(jīng),引諸藥直達(dá)病所;脾為生痰之源,肺為貯痰之器,肺病日久,致子盜母氣,脾土運(yùn)化失調(diào),水液停積則聚而生痰,故又以黨參為臣補(bǔ)肺健脾、益氣養(yǎng)血,通過健運(yùn)后天之本,也可達(dá)到祛痰益氣的功效;痰瘀虛互結(jié)日久,病勢纏綿,可累及脾腎,更佐以黃精、巴戟天補(bǔ)益肺腎、健脾和胃,祛痰化瘀而不傷正,氣血調(diào)暢則病邪得解;全方補(bǔ)瀉共施,具有化瘀祛痰、補(bǔ)益肺脾腎的功效。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明,黃芪可降低大鼠血清血小板衍生生長因子、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平,下調(diào)肺組織轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β1、Smad3以及TGF-β1 mNRA水平,改善肺纖維化[11];紅景天苷可下調(diào)Ⅰ型膠原蛋白、肌動蛋白和纖連蛋白等,防治TGF-β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞纖維化改變[12];苦杏仁苷可調(diào)控TGF-β/Smad通路,降低Smad2和Smad3磷酸化水平,發(fā)揮抗肺纖維化作用[13];莪術(shù)醇可通過TGF-β1和纖溶酶原激活物抑制劑-1表達(dá),降低羥脯氨酸含量,緩解博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化[14];黨參能抑制慢性阻塞性肺疾病小鼠核因子κB(NF-κB)及相關(guān)炎癥介質(zhì)表達(dá),降低IL-6、IL-1β及IL-8水平[15],并可與活血藥配伍,發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝、減輕炎癥反應(yīng)等作用,來防治肺纖維化[16];文獻(xiàn)報道,蟲類藥如水蛭、蜈蚣和地龍可減少纖維蛋白沉積及炎癥細(xì)胞浸潤等[17],改善IPF患者的臨床癥狀[18],但關(guān)于全蝎治療IPF的藥理作用還有待研究;黃精可顯著降低血清IL-6、TNF-α及C反應(yīng)蛋白含量,減輕肺氣虛炎癥狀態(tài)[19];巴戟天可通過促進(jìn)單核細(xì)胞趨化蛋白-1、IL-8蛋白表達(dá),調(diào)節(jié)免疫,減少機(jī)體有害反應(yīng)[20],但其干預(yù)肺纖維化的藥理研究目前缺乏文獻(xiàn)報道。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選得到熊果酸、芹菜素、木犀草素、槲皮素和山柰酚等為芪術(shù)肺纖湯治療IPF的主要活性成分。研究結(jié)果表明,熊果酸可能通過抑制Toll樣受體4/NF-κB信號通路激活,抑制下游促炎癥細(xì)胞因子表達(dá),減輕肺纖維化[21]。芹菜素可降低肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量及IL-6等炎癥因子含量,改善小鼠肺纖維化病理進(jìn)程[22];木犀草素可抑制炎癥介質(zhì)IL-1β、TGF-β1表達(dá)及NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3炎癥小體活化等,減輕肺部炎癥反應(yīng)及纖維化[23];槲皮素通過抑制大鼠TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4-自噬蛋白信號途徑,激活自噬并減輕肺纖維化病變[24];山柰酚有抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用,可能與抑制氣道和肺實(shí)質(zhì)炎癥反應(yīng)有關(guān)[25],同時能顯著降低TNF-α、IL-6和IL-1β水平,有效減輕肺組織病理學(xué)變化[26]。上述活性成分通過抑制NF-κB信號通路和細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化,降低IL-6、TNF-α等炎癥因子表達(dá)等發(fā)揮治療作用,這在PI3K-Akt信號通路中均有所體現(xiàn)。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果,排序靠前的核心靶點(diǎn)有TP53、Akt1、TNF、1 L-1β、IL-6和VEGFA等,且均與主要活性成分結(jié)合良好,證實(shí)了芪術(shù)肺纖湯治療IPF的臨床療效。研究結(jié)果表明,P53蛋白的激活可誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞衰老,進(jìn)而加快肺纖維化進(jìn)展[27];Akt1可調(diào)節(jié)肺部巨噬細(xì)胞中IL-13的表達(dá),減緩肺纖維化發(fā)展[28];TNF-α能促進(jìn)肺組織細(xì)胞外間質(zhì)分泌及膠原纖維過度增殖,造成肺纖維化病理改變[29];IL-6是M1型巨噬細(xì)胞分泌的多效因子,可促進(jìn)纖維化產(chǎn)生,研究結(jié)果表明,敲除IL-6基因可明顯抑制小鼠TGF-β1表達(dá)上調(diào),發(fā)揮抗肺纖維化作用[30];VEGF可與血管內(nèi)皮特異性受體結(jié)合,促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管新生,而大量無序的新生血管是纖維間隔形成的重要病理過程[31]。

富集分析結(jié)果表明,芪術(shù)肺纖湯主要影響炎癥反應(yīng)、缺氧反應(yīng)和基因表達(dá)正調(diào)控等BP;作用細(xì)胞外間隙、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)等CC;參與血紅素結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等MF;KEGG可能涉及癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-AGE受體信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化和TNF信號通路等,其中PI3K-Akt信號通路可能通過調(diào)控Akt1、TP53、NF-κB、P21和Bcl2等基因,促進(jìn)糖原合成酶激酶3磷酸化,誘導(dǎo)原癌基因Myc的表達(dá),也可能通過調(diào)節(jié)下游衰老相關(guān)蛋白P21的表達(dá),影響細(xì)胞衰老進(jìn)程,PI3K-Akt通路也將成為下一步深入研究的關(guān)注點(diǎn)。分子對接結(jié)果表明,熊果酸、芹菜素、木犀草素、槲皮素與TP53、TNF、Akt1、1 L-1β、IL-6、VEGFA在芪術(shù)肺纖湯治療IPF中發(fā)揮重要作用,可為臨床研究中藥治療IPF提供思路和方向。

綜上所述,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù),揭示了芪術(shù)肺纖湯多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療IPF的作用機(jī)制,可為中醫(yī)藥治療IPF提供線索和證據(jù)支持。但本研究主要是從理論層面探討,后期還將開展實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。