乳酸鈉共代謝對銅綠假單胞菌NY3 降解四溴雙酚A 的促進機理

張 琪,聶紅云,2*,郭鏑妮,陳麗嬌,聶麥茜,2,王 磊,2,王 蕾 (.西安建筑科技大學環(huán)境與市政工程學院,陜西 西安 70055；2.膜分離重點研究室,陜西 西安 70055；.陜西省環(huán)境監(jiān)測中心站,陜西 西安 70054)

四溴雙酚A(TBBPA)是使用最廣泛的溴代阻燃劑,作為一類化學助劑廣泛應(yīng)用于電子產(chǎn)品、塑料制品以及家具中[1-2].由于TBBPA 的大量生產(chǎn)與使用,使其釋放到環(huán)境中,污染了水、空氣和土壤,嚴重威脅人類健康和生態(tài)安全[3].快速有效地去除環(huán)境中的TBBPA 成為研究熱點.

生物法降解有機污染物簡單、高效、無二次污染,因此,常用生物法降解 TBBPA[4].已報道的TBBPA 降解菌株中,僅有少數(shù),如蒼白桿菌[5]能以TBBPA 為唯一碳源對其進行降解,多數(shù)微生物降解TBBPA 時需要其他碳源作為共代謝碳源[6].作為共代謝碳源的物質(zhì)包括葡萄糖、丙酮酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉、檸檬酸鈉、乙醇等電子供體[7],但僅葡萄糖作為共代謝碳源的促進機理研究較深入[5],其他共代謝碳源對TBBPA 降解的促進機理尚不明確.

基于此,本研究選擇乳酸鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉等小分子酸鈉鹽為共代謝碳源,以無共代謝碳源體系為對照,從代謝活性組分角度,研究了乳酸鈉共代謝作用對NY3菌降解TBBPA 的促進作用及其機理,旨在為TBBPA 污染的微生物控制技術(shù)提供參考.

1 材料與方法

1.1 菌種來源

從陜西污染土壤中分離純化的銅綠假單胞菌NY3(NCBI 登錄號為GU377209)

1.2 試劑及培養(yǎng)基

牛肉膏培養(yǎng)基:根據(jù)參考文獻[8]制備.組成為NaCl 5g/L、蛋白胨10g/L,牛肉膏3g/L,調(diào)pH 值至7.8,121℃滅菌30min,備用.

無機鹽(MSM)培養(yǎng)基:根據(jù)參考文獻[9]制備.組成為NH4NO31g,磷酸鹽緩沖液25mL, MgSO4·7H2O(1mol/L)0.5mL,CaCl2·2H2O(1mol/L)0.1mL, 微量元素1mL,加純水定容至1L,121℃滅菌30min,備用.

磷 酸 鹽 緩 沖 液 :NaH2PO4·2H2O:42.9g;K2HPO4·3H2O:42.9g,蒸餾水定容至1L,用NaOH 顆粒調(diào)pH 值至8.0.

微量元素:根據(jù)參考文獻[10]制備.主要組成有ZnSO4·7H2O 0.148g;MnSO4·H2O 0.258g; NiSO4·6H2O 0.022g;CoCl2·6H2O 0.024g;CuCl2·2H2O 0.013g;H3BO30.062g;Na2MoO4·2H2O 0.10g; FeSO4·7H2O 4.5g,加純水定容至1L.

TBBPA 溶液的制備:稱取0.8g 的TBBPA 于燒杯中,加純水至80mL,用NaOH 溶液溶解至澄清,定容至100mL.

1.3 實驗方法

1.3.1 NY3 菌種子液的制備 在無菌條件下,用接種環(huán)勾取平板上的NY3 菌單菌落于牛肉膏培養(yǎng)基中,置于31.5 ℃,(150±10) r/min 的恒溫水浴搖床中震蕩約16h,至其OD600nm約為(1.60±0.5),備用.

1.3.2 共代謝碳源對NY3 菌降解TBBPA 的影響按照1.2 的方法配制無機鹽培養(yǎng)基,無菌環(huán)境下分別添加乳酸鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉,使體系的濃度均為1g/L,再添加TBBPA 溶液使其濃度為50mg/L,接入20%的NY3 菌種子液組成降解體系(設(shè)置平行樣),以不添加有機酸鈉鹽作為對照組,以不添加有機酸鈉鹽且以20%無菌水替代NY3 菌種子液的接種體系作為空白組.在31.5 ℃,150r/min 的恒溫水浴搖床中進行搖瓶實驗.降解120h 后,測定體系的剩余TBBPA 峰面積、OD600nm、pH 值等指標,并計算TBBPA 的降解率.

1.3.3 乳酸鈉共代謝對NY3菌降解TBBPA 的活性物定域 無菌環(huán)境下配制NY3 菌接種量為20%,TBBPA 濃度為50mg/L,乳酸鈉濃度為1g/L 的NY3菌生長體系,使其在31.5℃ ,150r/min 的恒溫搖床中進行搖瓶實驗,收集48h 后添加乳酸鈉的NY3 菌降解體系.

靜息細胞的制備:將培養(yǎng)好的NY3 菌降解體系在3750r/min、4℃條件下無菌離心10min,收集菌體,用無機鹽洗滌3 次,獲得NY3 菌靜息細胞,并用等體積的無機鹽重懸獲得靜息細胞菌懸液,備用.

無菌胞外液的制備:將培養(yǎng)好的NY3 菌降解體系無菌離心10min(10000r/min、4 ℃), 棄菌體細胞,收集上清液,并用0.22μm的水相濾膜過濾,得到NY3菌無菌胞外液.

靜息細胞和無菌胞外液對TBBPA 的降解:分別取菌懸液和無菌胞外液各10mL,添加TBBPA 溶液使其濃度為50mg/L,于31.5 ℃,150r/min 的恒溫水浴搖床中進行搖瓶實驗,降解8h 后,測定體系的剩余TBBPA 峰面積,計算TBBPA 降解率.

蛋白酶K 對無菌胞外液降解TBBPA 的影響:在10mL 的含l g/L 乳酸鈉的無菌胞外液中添加200U 的蛋白酶 K,與不加蛋白酶 K 做對比,于31.5℃,150r/min 的恒溫水浴搖床中進行搖瓶實驗,于8h 后測定體系的剩余TBBPA 峰面積,并計算TBBPA 降解率.

1.3.4 NY3 菌乳酸鈉共代謝降解TBBPA 體系的ROS 檢測 按照1.3.3 制備NY3 菌乳酸鈉共代謝降解TBBPA 體系,并制備無菌胞外液,定期取樣,測定胞外液中的過氧化氫、超氧負離子自由基和羥基自由基等ROS.

1.4 分析方法

1.4.1 NY3 菌生長量的測定 取待測樣品5mL,用分光光度計在波長600nm 處測定吸光度.

1.4.2 pH 值的測定 取待測樣品5mL,用PHS-3C型的pH 計測定.

1.4.3 TBBPA 濃度測定 樣品前處理:取發(fā)酵好的待測樣品,調(diào)pH 值至2 進行酸化,加入6mL 三氯甲烷進行萃取,重復萃取3 次,合并有機相,放置通風櫥揮發(fā)干后,加入1mL 乙酸乙酯溶解,過0.22μm 有機濾膜,制成樣品.

TBBPA 濃度采用氣相色譜法測定,具體條件如下:用PE 680FID 檢測器測定剩余TBBPA 的峰面積.色譜條件根據(jù)參考文獻[11]設(shè)置:檢測條件為進樣口溫度300 ℃,分流比20:1.檢測器溫度:300℃ ,氫氣流量45mL/min,空氣流量450mL/min.程序升溫,初始105 ℃,保留2min,再以20℃/min 升溫至160 ℃,保留4min,以20℃/min 升溫至240 ℃,保留4min,最后以20℃/min 升溫至280℃保留7min.進樣量為1μL.TBBPA 降解率公的計算式如下:

式中:R為TBBPA 降解率,S0為空白組TBBPA 峰面積;St為實驗組剩余TBBPA 峰面積.

1.4.4 胞外液中ROS 的檢測 過氧化氫(H2O2):采用采用N,N-二乙基對苯二胺(DPD)/辣根過氧化物酶(POD)法測定:配制1g/L 的POD 溶液(超純水溶解)、10g/L 的DPD 溶液(0.05mol/L 的H2SO4溶解)和0.5mol/L pH 值為6 的磷酸鹽緩沖液(PBS).取2.7mL 的胞外提取液于5mL 的離心管中,向其中加入300μL 的PBS、25μL 的POD 溶液和25μL 的DPD溶液,用紫外-可見分光光度計于551nm 處測量其吸光度,體系以不加POD 為空白對照.在測定時需同步制作標準樣品,根據(jù)所測吸光度值與H2O2標準曲線求相應(yīng)H2O2濃度[12].

超氧負離子自由基(?O2-):采用硝基四氮唑藍(NBT)顯色法測定:配制50μmol/L 的NBT 溶液,吸取2mL的胞外提取液于5mL離心管中,加入50μL NBT溶液,避光靜置5min,測其在560nm 處的吸光度值[13].

羥基自由基(?OH):采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定:配制質(zhì)量分數(shù)為1%的TBA 溶液(0.05mol/L 濃度的NaOH 溶解),取2mL 胞外提取液于5mL 離心管中,向其中加入170μL濃度為30mmol/L的2-脫氧-D-核糖,在35℃下反應(yīng)15min.取1mL 混合液加入1mL 的TBA 溶液和1mL 乙酸,沸水浴20min,室溫冷卻后,測其在532nm 處的吸光度[12].

1.4.5 乳酸鈉共代謝體系中NY3 菌胞外小分子物質(zhì)的表征 收集NY3 菌在1g/L 乳酸鈉生長體系中的細胞生長液,取4mL 過固相萃取柱,用甲醇(色譜級)洗脫,于通風櫥揮干,用1mL 甲醇溶解,所得洗脫液用高效液相-離子阱-飛行時間質(zhì)譜(LCMS-ITTOF)分析所含胞外小分子物質(zhì).參考文獻[7]的檢測方法稍作調(diào)整.色譜柱為C18柱(Shimpack XR-ODS,2.2μm intotal porous,2.0mm×250mm),進樣量為10μL.流動相為1%乙酸(體積分數(shù))的超純水和色譜級甲醇,采用梯度洗脫的方式先將甲醇的體積分數(shù)30min 內(nèi)從10%升到50%,在30min～40min 升到100%,在45～60min 降至10%,流速為0.2mL/min.

小分子物質(zhì)的定性通過飛行時間質(zhì)譜與已報道的相關(guān)小分子物質(zhì)的質(zhì)譜圖對比確定.小分子物質(zhì)的濃度以其對應(yīng)色譜圖中的峰面積表示,只作為相對定量分析的依據(jù).

1.4.6 數(shù)據(jù)處理 ROS 的顯著性分析:利用SPSS軟件對ROS 待測樣與對照組做獨立樣本T檢驗,分析兩者的顯著性,P<0.05 說明具有相關(guān)性.(用*表示相關(guān)性強弱,***:P<0.001;**:P<0.01;*:0.01

ROS 與NY3 菌胞外小分子的相關(guān)性分析:利用R 語言矩陣相關(guān)性分析程序?qū)OS 水平與NY3 菌胞外小分子色譜圖對應(yīng)的峰面積做相關(guān)性分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸鈉共代謝對NY3 菌降解TBBPA 的促進作用

按照1.3.2 的實驗方法,在NY3 菌降解TBBPA體系中分別外加乳酸鈉、乙酸鈉和檸檬酸鈉為共代謝碳源,并以無共代謝碳源體系(不添加)為對照,測定不同時間體系的NY3 菌生物量、pH 值和TBBPA降解率,以及120h 降解體系上清液的外觀(圖1).

圖1 小分子有機酸鈉鹽對TBBPA 降解體系中NY3 菌生長特性的影響Fig.1 Effect of small molecule organic acid sodium salt on the growth of Pseudomonas aeruginosa NY3 in the degradation system of TBBPA

由圖1a 可知,與對照組相比,共代謝碳源加入后,NY3 菌的對數(shù)生長期延長,生物量增加.其中乳酸鈉共代謝對NY3 菌生物量的促進作用最大,其次是乙酸鈉,檸檬酸鈉共代謝對NY3 菌生物量促進作用最弱.與之相對應(yīng)的體系pH 值也與對照組存在明顯不同(圖1b).共代謝碳源存在時,體系pH 值隨NY3菌生長時間的延長而升高,當NY3 菌處于對數(shù)生長期時,體系pH 值上升速度快,當NY3 菌處于生長平臺期和死亡期時,體系pH 值上升緩慢或保持穩(wěn)定.3種共代謝碳源中,乳酸鈉共代謝使體系pH 值上升最少,檸檬酸鈉使體系pH 值上升最多.對比圖1a 和圖1b 可知,共代謝碳源對NY3 菌生物量和體系pH 值的促進趨勢相反,這可能是由于pH 值大于9.0 不利于NY3 菌生長.由圖1c 可知,在4h 內(nèi)不同條件體系降解率差別不明顯,但降解48h 時乳酸鈉和乙酸鈉為共代謝碳源體系TBBPA 的降解率明顯高于對照組.尤其是乳酸鈉為共代謝的體系,其48h 的TBBPA降解率已顯著高于對照組120h 的TBBPA 降解率.究其原因,這可能與乳酸鈉和乙酸鈉共代謝體系中長時間保持較高生物量有關(guān),也可能與NY3 菌在不同共代謝體系的胞外分泌物有關(guān).如圖1d 所示,與對照組相比,乳酸鈉和乙酸鈉為共代謝體系的NY3 菌胞外液呈現(xiàn)墨綠色.根據(jù)Huang 等[6]的研究結(jié)果可知,胞外液中的墨綠色可能是NY3 菌分泌的綠膿菌素.降解后期,由于共代謝碳源不足,NY3 菌分泌的過量綠膿菌素產(chǎn)生自毒效應(yīng)引起的生物量降低,這也解釋了乳酸鈉和乙酸鈉共代謝體系的NY3 菌生物量在降解后期為何銳減.綜上可知,當以乳酸鈉為共代謝碳源時,TBBPA 降解體系中NY3 菌迅速生長,分泌大量綠膿菌素類胞外物質(zhì),使TBBPA 降解率顯著高于無共代謝碳源體系.這與萬博等報道的乳酸鈉共代謝能促進NY3 菌對TBBPA 的脫溴效果一致[14].

2.2 乳酸鈉共代謝對NY3 菌降解TBBPA 的活性物定域

當以乳酸鈉為共代謝碳源時, TBBPA 降解體系中NY3 菌生物量和胞外分泌物均不同于無共代謝碳源體系.為定位NY3 菌乳酸鈉共代謝體系TBBPA降解的活性物,按照1.3.3 的實驗方法,在無菌條件下分別獲取靜息細胞和其對應(yīng)無菌胞外液,分別測定其對TBBPA 的降解率(圖2).

圖2 乳酸鈉為共代謝碳源的無菌胞外液對TBBPA 降解率的影響Fig.2 Effect of sodium lactate as co-metabolic carbon source on the degradation rate of TBBPA by the cell-free extracellular fluid

由圖2 可知,添加乳酸鈉的細胞和胞外上清液均具有降解TBBPA 的能力,降解8h 后,無菌胞外液對TBBPA 的降解率為35.91%,靜息細胞對TBBPA的降解率為38.38%,無菌胞外液與相應(yīng)的NY3 菌靜息細胞對TBBPA 的去除效率幾乎相同.顧晨等[15]研究表明,對于GCW 菌株,參與TBBPA 降解的活性組分分布于胞內(nèi)和胞外,而對于 GCY 菌株,參與TBBPA 降解的活性組分幾乎全在胞外.說明NY3 菌降解TBBPA 的活性物分布與GCW 菌株相同.據(jù)前人研究可知[4],細菌降解TBBPA 的胞內(nèi)活性組分主要與脫溴和礦化相關(guān)的基因及其表達有關(guān),如cyp450,gstB,gstA,HADH,bioC,yrrM,Tam和Ubil等,而與菌細胞對TBBPA 降解率貢獻幾乎相同的胞外活性組分尚不明確,值得深入研究.

2.3 乳酸鈉共代謝對NY3 菌胞外液降解TBBPA的活性組分

在細菌胞外液中,蛋白類物質(zhì)與非蛋白的小分子分泌物共存.為進一步探索乳酸鈉共代謝體系的NY3 菌無菌胞外液中降解TBBPA 的活性組分究竟是蛋白還是非蛋白的小分子分泌物,以NY3 菌無菌胞外液中加入過量蛋白酶K 為實驗組,以未加蛋白酶K 的為對照組,分別測定其對TBBPA 的降解率.由圖3 可知,降解8h 后,對照組中TBBPA 的降解率約為35%,實驗組TBBPA 的降解率約為76%,比對照組提高了40%左右.該結(jié)果說明,乳酸鈉共代謝的NY3 菌無菌胞外液中,蛋白類物質(zhì)在TBBPA 的降解過程中起負面作用,TBBPA 降解的活性組分應(yīng)為非蛋白的小分子分泌物.根據(jù)Huang 等[6]的研究結(jié)果可知,這可能與銅綠假單胞菌分泌的吩嗪類物質(zhì)在有氧條件下形成活性氧有關(guān),因為這類活性氧能夠降解TBBPA.

圖3 胞外蛋白對無菌胞外液對TBBPA 降解的影響Fig.3 Effect of extracellular proteins on the degradation of TBBPA by the cell-free extracellular fluid

2.4 乳酸鈉共代謝對NY3 菌胞外ROS 的影響

研究表明,綠膿菌素類物質(zhì)形成的活性氧包括超氧負離子自由基、羥基自由基和過氧化氫等[16].為驗證NY3 菌乳酸鈉共代謝體系胞外液中活性氧種類與水平,以無共代謝碳源為對照組,以乳酸鈉共代謝體系為實驗組,分別測定其TBBPA 降解過程中胞外液中的超氧負離子自由基、羥基自由基和過氧化氫.

由圖4 可知,在NY3 菌降解TBBPA 的乳酸鈉共代謝體系,超氧負離子自由基、羥基自由基和過氧化氫的水平隨降解時間延長而增加.其中,體系中超氧負離子自由基和過氧化氫的水平在降解8h 后顯著高于對照組,羥基自由基水平在降解24h 后顯著高于對照組.這可能是因為綠膿菌素與胞外物質(zhì)反應(yīng)初步生成的活性氧主要是超氧負離子自由基和過氧化氫,羥基自由基是由生成的過氧化氫和胞外液中金屬離子反應(yīng)生成的[17].

圖4 乳酸鈉共代謝對NY3 菌降解TBBPA 體系ROS 的影響Fig.4 Effect of sodium lactate as co-metabolic carbon source on the ROS level in the the degradation system of TBBPA by Pseudomonas aeruginosa NY3

2.5 NY3 菌乳酸鈉共代謝體系的胞外分泌物

按1.4.5 的實驗方法以固相萃取技術(shù)提取NY3菌乳酸鈉共代謝體系胞外液的小分子分泌物,然后通過LCMS-IT-TOF 對其進行定性分析.由表1 可知,NY3 菌乳酸鈉共代謝體系的胞外液含4 類小分子分泌物,分別為喹諾酮類、吩嗪類、螯鐵蛋白和鼠李糖脂類.依據(jù)MS 和MS/MS 質(zhì)譜特征,以及前人研究結(jié)果推測喹諾酮類和吩嗪類的結(jié)構(gòu)[18],發(fā)現(xiàn)NY3 菌乳酸鈉共代謝體系包含5 種喹諾酮類物質(zhì),分子量分別為242, 274, 260, 286, 396;2 種吩嗪類物質(zhì),分別是綠膿菌素和吩嗪-1-羧酸.根據(jù)MS 和聶麥茜等[19]的研究結(jié)果,發(fā)現(xiàn)NY3菌乳酸鈉共代謝體系分泌6種單鼠李糖脂和2種雙鼠李糖脂.此外,NY3菌乳酸鈉共代謝體系的胞外分泌物還包括一種螯鐵蛋白.

表1 胞外液中的小分子分泌物Table 1 Samll molecular secretions in the extracellular fluid

2.6 NY3 菌乳酸鈉共代謝體系胞外小分子分泌物與ROS 的相關(guān)性分析

將2.5 部分的LCMS-IT-TOF 色譜峰根據(jù)鑒定結(jié)果分為喹諾酮類、吩嗪類、螯鐵蛋白和鼠李糖脂類,分別加和同一類物質(zhì)的峰面積,對其進行相對定量.隨降解時間的變化,NY3 菌乳酸鈉共代謝體系胞外小分子分泌物的水平如圖5a 所示.利用C 語言軟件,分析2.4 部分不同活性氧水平與胞外小分子分泌物的相關(guān)性.

圖5 胞外小分子分泌物與胞外液中 ROS 水平的關(guān)系Fig.5 Relationship of small molecular secretions and level of ROS in the extracellular fluid

由圖5a 可知,吩嗪、螯鐵蛋白和喹諾酮的變化趨勢為逐漸增多,鼠李糖脂的濃度先升高后降低.四種胞外小分子分泌物與活性氧均呈正相關(guān).其中,吩嗪類的濃度與超氧負離子自由基、羥基自由基和過氧化氫水平相關(guān)性均接近于1;喹諾酮類物質(zhì)和超氧負離子自由基的相關(guān)性較高,接近于1,與羥基自由基和過氧化氫的相關(guān)性略低,在0.8 左右;螯鐵蛋白和羥基自由基的相關(guān)性較高,約在0.4 左右,與超氧負離子自由基和過氧化氫的相關(guān)性較弱,約在0.2 左右;鼠李糖脂僅與過氧化氫有很弱的相關(guān)性,與超氧負離子自由基和羥基自由基的相關(guān)性幾乎為0.以上結(jié)果說明,胞外小分子分泌物對活性氧的貢獻次序為吩嗪類>喹諾酮類>螯鐵蛋白>鼠李糖脂類.聶紅云[20]等研究發(fā)現(xiàn),綠膿菌素與胞外的NADH 反應(yīng)生成超氧負離子自由基和過氧化氫,若體系中存在螯鐵蛋白,則進一步反應(yīng)生成羥基自由基.這與本研究分析的相關(guān)性一致.

3 結(jié)論

3.1 乳酸鈉共代謝可明顯提高銅綠假單胞菌NY3以TBBPA 為碳源的細胞增殖量和降解率.當乳酸鈉濃度為1g/L時,銅綠假單胞菌NY3 在48h 對TBBPA的降解率可達到74%.

3.2 乳酸鈉共代謝時,銅綠假單胞菌NY3 的無菌胞外液具有與其細胞相當?shù)腡BBPA 降解能力,其胞外液的降解能力主要與非蛋白的小分子分泌物相關(guān).

3.3 當乳酸鈉共代謝時,銅綠假單胞菌NY3 的無菌胞外液中過氧化氫、超氧負離子自由基和羥基自由基濃度顯著高于無乳酸鈉存在體系.喹諾酮、吩嗪類、螯鐵蛋白和鼠李糖脂的分泌量均與ROS 水平呈正相關(guān),其中吩嗪類濃度與胞外ROS 水平相關(guān)性最高,鼠李糖脂濃度與ROS 水平的相關(guān)性最弱.