經(jīng)電子支氣管鏡下肺泡灌洗液行宏基因組測(cè)序在呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎的應(yīng)用價(jià)值

陳偉光 張晶晶 江春蝦 鄭耿正 胡欣欣 羅時(shí)俊

呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎(ventilator-associated pneumonia,VAP)是患者于機(jī)械通氣48 h 至拔管48 h 期間出現(xiàn)的肺部感染, 屬于具有醫(yī)院獲得性、感染性的常見(jiàn)疾病,治療難度很高, 可導(dǎo)致延遲拔管、脫機(jī)困難等, 進(jìn)而增加患者治療時(shí)間、治療費(fèi)用及死亡率［1］。早期合理恰當(dāng)?shù)脑\斷治療對(duì)VAP 患者預(yù)后改善、死亡率降低具有重要的意義, 因此, 病原體的精準(zhǔn)診斷對(duì)感染性疾病的診斷非常重要［2］。電子支氣管鏡能夠于病變區(qū)域直接取樣本, 防止由于口咽處的微生物污染樣本, 使樣本內(nèi)病原菌分離提升, 經(jīng)電子支氣管鏡下肺泡灌洗液分析VAP 患者的主要病原體, 明確肺炎為何種病原體感染所致［3］。宏基因組二代測(cè)序(metagenomics nextgeneration sequencing, mNGS)具有無(wú)偏倚性、廣覆蓋、快速等優(yōu)點(diǎn), 能覆蓋更廣泛病原體, 可直接從臨床樣品內(nèi)將DNA/RNA 提取出來(lái), 選擇mNGS, 經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比及生物信息學(xué)分析, 且不需要特異性擴(kuò)增, 在診斷疑難感染及急危重癥中尤為適用［4,5］。本次研究通過(guò)探討經(jīng)電子支氣管鏡下肺泡灌洗液行mNGS 在VAP 患者中的應(yīng)用價(jià)值, 希望能夠?yàn)榛颊咛峁?zhǔn)確的臨床診斷及精準(zhǔn)治療依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2022 年1～12 月于深圳市坪山區(qū)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科及呼吸內(nèi)科住院的40 例VAP 患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①VAP 患者為在機(jī)械通氣48 h 之后出現(xiàn)的肺炎, 同機(jī)械通氣之前的相關(guān)檢查(胸部CT、胸片)比較顯示肺內(nèi)出現(xiàn)新炎癥病灶或有浸潤(rùn)性陰影, 同時(shí)具有濕性啰音或肺實(shí)變征, 與相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］相符；②同檢查支氣管鏡的相關(guān)指征相符；③均于知情同意書(shū)中簽名。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期婦女及其家屬拒絕配合的患者；②未使用氣管插管而取得的肺泡灌洗液的患者；③肺部感染與呼吸機(jī)無(wú)關(guān)的感染；④樣本中微生物核酸＜100 copies/ml；⑤有活動(dòng)性肺結(jié)核及新近大咯血者；⑥新型冠狀病毒肺炎感染的患者。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組與mNGS 組, 各20 例。兩組的一般資料比較無(wú)意義(P＞0.05), 具有可比性。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較［n(%), ±s］

表1 兩組一般資料比較［n(%), ±s］

注：兩組比較, P＞0.05

組別例數(shù)性別平均年齡(歲) C 反應(yīng)蛋白(mg/L) 降鈣素原(ng/ml)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(×109/L )男女對(duì)照組2015(75.00)5(25.00)57.47±5.5840.25±3.530.17±0.048.35±1.48 mNGS 組2012(60.00)8(40.00)60.82±6.0340.33±3.460.19±0.038.38±1.59 χ2/t1.0261.8240.0721.7890.062 P 0.3110.0760.9430.0820.951

1.2 方法 兩組患者均進(jìn)行綜合干預(yù), 主要包括呼吸機(jī)輔助通氣、腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)支持、抗感染、臟器功能支持等。對(duì)照組應(yīng)用傳統(tǒng)病原微生物檢測(cè), mNGS 組應(yīng)用mNGS, 具體方式如下：①肺泡灌洗液收集及送檢：灌洗肺泡時(shí), 于灌洗肺段的活檢孔內(nèi)注射1～2 ml 的2%利多卡因, 之后把支氣管鏡頂端的楔入段(或亞段)置于支氣管開(kāi)口部分, 把滅菌生理鹽水(37℃)注射于活檢孔, 并負(fù)壓使液體被吸引、回收, 30～50 ml/次, 總量100～250 ml, 經(jīng)電子支氣管鏡下取得肺泡灌洗液樣本2 份, 送醫(yī)院傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)以及廣州華銀健康檢驗(yàn)中心進(jìn)行mNGS。②樣本量：對(duì)照組患者需要肺泡灌洗液樣本≥10 ml, 并需及時(shí)送檢；mNGS 組采集的肺泡灌洗液要＞5 ml, 存于4～20℃的環(huán)境中, 在2 h 之內(nèi)送檢,若送檢不及時(shí), 肺泡灌洗液需存于-20℃的環(huán)境中, 并于24 h 內(nèi)送檢。③mNGS 判定方法［7］：mNGS 技術(shù)通過(guò)高通量測(cè)序及智能算法進(jìn)行分析, 得到疑似病原微生物的種類信息, 特異性序列數(shù), 無(wú)偏向性鑒定微生物。a.陽(yáng)性：按照名古屋大學(xué)(日本)醫(yī)學(xué)院編制的評(píng)估手段, Reads 細(xì)菌＞200, 同時(shí)P1(在全部微生物中的占比)＞0.5；b.致病及定植(微生物)的高通量測(cè)定：結(jié)合臨床, 若合并發(fā)熱、炎癥、痰液性狀轉(zhuǎn)變、影像學(xué)變化, 就屬于致病菌；若未見(jiàn)感染征象, 屬于定植菌。④應(yīng)用抗生素方案：對(duì)照組按照臨床培養(yǎng)結(jié)果決定是否調(diào)整抗生素, mNGS 組陽(yáng)性者按照病原體測(cè)定結(jié)果調(diào)整抗生素(即單一窄譜抗菌藥物), 陰性者持續(xù)經(jīng)驗(yàn)性用藥。

1.3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)比兩組患者的病原體種類檢出率、病原體種類數(shù)檢出率、抗生素使用強(qiáng)度(包括抗生素使用率及使用時(shí)間)、機(jī)械通氣時(shí)間、ICU 住院時(shí)間、MODS 發(fā)生率及兩種檢測(cè)方式對(duì)VAP 的診斷效能。機(jī)械通氣時(shí)間：患者氣管插管至能夠成功拔管的時(shí)間, 患者恢復(fù)自主呼吸, 病情穩(wěn)定, 未出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥, 血?dú)夥治鑫匆?jiàn)代謝性、呼吸性酸堿失衡, 同時(shí)使用呼吸機(jī)輔助的參數(shù)遞減后可以滿足人體呼吸需要,就可拔管。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)；診斷效能采用受試者工作特征曲線(ROC 曲線)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組病原體種類檢出率比較 mNGS 組患者的細(xì)菌檢出率為80.00%, 明顯高于對(duì)照組的20.00%(P＜0.05)；兩組真菌、病毒檢出率比較, 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者病原體種類檢出率比較［n(%)］

2.2 兩組患者病原體種類數(shù)檢出率比較 mNGS 組患者病原體種類數(shù)＞2 種檢出率為30.00%, 明顯高于對(duì)照組的0(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組病原體種類數(shù)檢出比較［n(%)］

2.3 兩種檢測(cè)方式對(duì)VAP 的診斷效能比較 mNGS診斷VAP 的AUC 為0.941, 明顯大于傳統(tǒng)病原微生物檢測(cè)的0.714(P＜0.05)。見(jiàn)表4, 圖1, 圖2。

圖1 mNGS 檢測(cè)診斷VAP 的ROC 曲線

圖2 傳統(tǒng)病原微生物檢測(cè)診斷VAP 的ROC 曲線

表4 兩種檢測(cè)方式診斷VAP 的ROC 曲線結(jié)果

2.4 兩組患者抗生素使用強(qiáng)度、機(jī)械通氣時(shí)間、ICU住院時(shí)間、MODS 發(fā)生率比較 mNGS 組患者的抗生素使用率55.00%明顯低于對(duì)照組的90.00%, 抗生素使用時(shí)間、機(jī)械通氣時(shí)間、ICU 住院時(shí)間明顯短于對(duì)照組, MODS 發(fā)生率5.00%明顯低于對(duì)照組的30.00%(P＜0.05)。見(jiàn)表5。

3 討論

目前, 對(duì)于VAP 的治療, 臨床上常采用抗生素抗感染、吸痰等對(duì)癥治療, 但抗感染治療需要依據(jù)呼吸道標(biāo)本的病原學(xué)結(jié)果針對(duì)性的選擇抗菌藥物。通常,臨床治療中會(huì)依據(jù)經(jīng)驗(yàn)應(yīng)用抗生素, 然后送痰液(或肺泡灌洗液)標(biāo)本進(jìn)行微生物涂片、培養(yǎng), 依據(jù)結(jié)果判斷抗生素是否需要調(diào)整［8］。因?yàn)槲⑸锍Ｒ?guī)培養(yǎng)陽(yáng)性率較低, 同時(shí)極易受諸多不確定因素干擾, 進(jìn)而造成抗生素濫用、多用。肺泡灌洗液是最為合理的標(biāo)本, 留取標(biāo)本離不開(kāi)支氣管鏡, 目前, 支氣管鏡廣泛應(yīng)用于肺部、氣管支氣管等呼吸系統(tǒng)疾病的診療中, 這一方式能夠從病變位置直接將樣本提取出來(lái), 防止樣本被口咽處存在的微生物污染, 進(jìn)而使樣本內(nèi)病原菌的分離提高［9］。通過(guò)支氣管肺泡灌洗液分析VAP 患者的主要病原體, 明確肺炎為何種病原體感染所致。

mNGS 技術(shù)于辨別病菌(厭氧菌、真菌及部分潛在病原體)、混合性肺部感染診斷以及探索經(jīng)驗(yàn)性抗菌干預(yù)欠敏感患者的致病病原體領(lǐng)域都可發(fā)揮較高的作用［10］。mNGS 不需要培養(yǎng)且沒(méi)有偏好性, 能夠從臨床樣本內(nèi)直接獲得DNA/RNA, 通過(guò)高通量測(cè)序及智能算法進(jìn)行分析, 得到疑似病原微生物的種類信息, 同時(shí)不需要特異性擴(kuò)增, 在診斷疑難感染及急危重癥中尤為適用［11］。伴隨宏基因組檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展, VAP 患者于常規(guī)病原學(xué)的基礎(chǔ)上需及時(shí)開(kāi)展宏基因組檢測(cè),通過(guò)這一方法的陽(yáng)性判定, 同時(shí)聯(lián)合患者實(shí)際狀況開(kāi)展全面分析, 進(jìn)而明確是否為背景菌、定植菌或致病菌［12-15］。相對(duì)傳統(tǒng)病原微生物檢測(cè)方法, mNGS 檢測(cè)方法相對(duì)于常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)具有快速、敏感性高的優(yōu)勢(shì),具備重要的診斷價(jià)值, 可提高患者病原體的檢出率, 特別是對(duì)病毒、真菌及特殊病原體, 于傳統(tǒng)培養(yǎng)中不能檢測(cè)出病原體的患者中, mNGS 能夠有效的檢出, 從而指導(dǎo)抗病原微生物藥物的應(yīng)用, 提升治療效果, 節(jié)約醫(yī)療資源及患者總費(fèi)用［16-19］。且有研究顯示mNGS 在鑒定病原體方面靈敏度較高, 同時(shí)抗生素對(duì)其的干擾較小［20-23］。

本研究顯示, 經(jīng)電子支氣管鏡下肺泡灌洗液行mNGS 患者的細(xì)菌檢出率、病原體種類數(shù)＞2 種檢出率明顯高于行傳統(tǒng)病原微生物檢測(cè)的患者。ROC 結(jié)果中,mNGS 診斷VAP 患者的AUC 為0.941, 明顯高于傳統(tǒng)病原微生物檢測(cè)的0.714。行mNGS 患者的抗生素使用率、抗生素使用時(shí)間、機(jī)械通氣時(shí)間、ICU 住院時(shí)間、MODS 發(fā)生率明顯低(短)于行傳統(tǒng)病原微生物檢測(cè)的患者, 這提示VAP 患者經(jīng)電子支氣管鏡下肺泡灌洗液行mNGS 能夠提升病原體檢出率, 進(jìn)而及時(shí)得到治療,提升療效, 進(jìn)而降低抗生素使用強(qiáng)度、縮短機(jī)械通氣時(shí)間、住院時(shí)間與MODS 發(fā)生率, 使患者的預(yù)后得到極大的改善。

綜上所述, 經(jīng)電子支氣管鏡下肺泡灌洗液行mNGS在VAP 患者中的應(yīng)用價(jià)值較高, 能使檢出感染病原體的幾率提高, 進(jìn)而降低抗生素使用強(qiáng)度、縮短機(jī)械通氣時(shí)間, 盡可能使患者早脫機(jī)早拔管, 對(duì)患者病情快速準(zhǔn)確診斷、及時(shí)采取針對(duì)性治療措施意義重大, 值得大力推廣。