光滑念珠菌磷酸吡哆醇氧化酶的定向進化改造

優(yōu)秀學(xué)者論壇

楊欣偉，1984年生，上海交通大學(xué)博士，福建師范大學(xué)副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事工業(yè)微生物代謝工程的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究工作。主持和參與了福建省自然科學(xué)基金面上項目、國家自然科學(xué)基金項目以及企業(yè)橫向產(chǎn)學(xué)研項目等，通過代謝工程、合成生物學(xué)等手段對大腸桿菌等微生物進行改造，構(gòu)建高效的全細(xì)胞催化劑生產(chǎn)高附加值化學(xué)品以及體外多酶催化法合成高附加值的產(chǎn)品；2019年獲得福建省高校青年教師教學(xué)競賽省級二等獎和福建省高校青年教師教學(xué)新秀稱號；作為第一指導(dǎo)老師，指導(dǎo)學(xué)生2018年獲得國際遺傳工程機器大賽（iGEM）金獎，2019年、2022年、2024年分別獲得中國“互聯(lián)網(wǎng)+創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽”銅獎（第五屆）、福建省“互聯(lián)網(wǎng)+創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽”銀獎（第八屆）、福建省大學(xué)生創(chuàng)新大賽銀獎，2019年獲得中國（福建）女大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽（第四屆）金獎等；以第一作者或通訊作者在學(xué)術(shù)期刊《Journal of Agricultural and Food Chemistry》《Food Bioscience》《生物工程學(xué)報》等發(fā)表論文20多篇。兼任第二屆中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會氨基酸分委會委員，第七屆福建省生物化學(xué)與分子生物學(xué)會理事。

摘要：磷酸吡哆醇氧化酶（pyridoxine 5'-phosphate oxidase，PdxH）是磷酸吡哆醛（Pyridoxal-5'-phosphate，PLP）生物合成途徑的限速酶，是影響PLP高效合成的關(guān)鍵。以來源于光滑念珠菌Nakaseomycesbracarensis中的PdxH（NbPdxH）為研究對象，通過定向進化和高通量篩選對NbPdxH進行改造，以提高酶的催化活性。結(jié)果表明：通過篩選成功獲得1株催化效率提高的突變株pRB1s-NbpdxHM8/BW25113，使得PLP產(chǎn)量達到5.3 g·L?1，PNP轉(zhuǎn)化率為71%，與原始菌株相比提高了27%。通過結(jié)構(gòu)分析，推測NbPdxHM8活性位點附近的電荷發(fā)生改變，進而提高酶與底物的結(jié)合效率。研究結(jié)果為PLP的高效合成提供了新的思路。

關(guān)鍵詞：磷酸吡哆醛；磷酸吡哆醇氧化酶；定向進化；高通量篩選

中圖分類號：R446.5文獻標(biāo)志碼：A文章編號：0253?2301（2024）12?0001?06

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.12.001

Directed Evolution of Pyridoxine 5'-Phosphate Oxidase from Nakaseomycesbracarensis

WANG Mei-ling1，CHEN Yu-xian2，ZHENG Xiao-yin1，LU Bei-si1，YANG Xin-wei1*

（1.Engineering Research Center of Industrial Microbiology and Fermentation Technology/College of Life Science，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350108，China;2.Jinjiang Experimental Junior Middle School，Quanzhou，F(xiàn)ujian 362200，China）

Abstract：Pyridoxine 5'-phosphate oxidase（PdxH）is a rate-limiting enzyme in the biosynthesis pathway of pyridoxal-5'-phosphate（PLP），which is the key to the efficient synthesis of PLP.PdxH from Nakaseomycesbracarensis（NbPdxH）was selected as the study object.NbPdxH was modified through directed evolution and high-throughput screening to improve the catalytic activity of the enzyme.A pRB1s-NbpdxHM8/BW25113 mutant with improved catalytic efficiency was successfully obtained through screening.The PLP production reached 5.3 g·L?1，and the conversion ratio of PNP was 71%，which was 27%higher than that of the original strain.Through the structural analysis，it was speculated that the charge near the active site of NbPdxHM8 was changed，which improved the binding efficiency of the enzyme and the substrate.The relevant research results provided a new idea for the efficient synthesis of PLP.

Key words：PLP；PdxH；Directed evolution；High-throughput screening

磷酸吡哆醛（Pyridoxal-5'-phosphate，PLP），化學(xué)名稱為2-甲基-3-羥基-5-（磷酰氧基）甲基-4-吡啶甲醛，是維生素B6的活性形式。PLP作為140多種酶的輔因子[1]，在人體中參與氨基酸代謝[2]，對合成血清素、腎上腺素、去甲腎上腺素、組胺、多巴胺和γ-氨基丁酸（GABA）等[3?5]神經(jīng)遞質(zhì)至關(guān)重要，影響內(nèi)分泌、神經(jīng)和循環(huán)等[6?8]系統(tǒng)的穩(wěn)定。PLP因其在細(xì)胞代謝中的關(guān)鍵作用，被廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域，包括作為提高食品營養(yǎng)價值的添加劑[9]、提高作物產(chǎn)量和改善作物品質(zhì)的植物生長調(diào)節(jié)劑[10]以及用于治療糖尿病、癲癇、癌癥、新冠肺炎等[11?14]疾病的藥物成分。隨著PLP在各行業(yè)的廣泛應(yīng)用，PLP的市場需求不斷放大。當(dāng)前，PLP的制備方法主要為化學(xué)合成法和生物合成法兩類?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)PLP大都采用施泰格瓦爾德制藥有限公司的工藝，其中部分工藝使用昂貴與有毒的化學(xué)物質(zhì)，如氰化氫、磷酸酐和1，4-丁二醇等[15]?；瘜W(xué)合成法存在步驟復(fù)雜、產(chǎn)量低等問題，且有機溶劑的使用有殘留風(fēng)險，不符合綠色生產(chǎn)的要求。相比之下，生物合成法具有反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物更少、產(chǎn)品純度更高和更環(huán)保等優(yōu)點，在生產(chǎn)PLP方面具有極大的應(yīng)用潛力，比化學(xué)合成更具吸引力。

目前，生物體內(nèi)PLP的生物合成途徑已經(jīng)闡明，這包括兩條獨立的從頭合成途徑：脫氧木酮糖-5-磷酸（DXP）依賴途徑和DXP非依賴途徑，以及挽救途徑（salvage pathway）。在挽救途徑中，磷酸吡哆醇氧化酶（pyridoxine 5′-phosphate oxidase，PdxH）將磷酸化形式的磷酸吡哆醇（PNP）氧化為PLP[16]。PdxH是PLP生物合成途徑的重要限速酶。PdxH表現(xiàn)出低kcat值和催化效率的特征[17]，同時受產(chǎn)物PLP的變構(gòu)反饋抑制，導(dǎo)致酶-PNP-PLP（PES）三元復(fù)合物催化活性部分喪失[18?19]。近年來，通過研究PdxH的晶體結(jié)構(gòu)，對其關(guān)鍵位點進行改造，獲得了一系列解反饋的酶突變體。研究發(fā)現(xiàn)，對大腸桿菌來源的PdxH酶中23、24、215位點的精氨酸進行突變可不同程度的解除變構(gòu)效應(yīng)[20]。Anna等[21]學(xué)者發(fā)現(xiàn)PdxH的第161位點的精氨酸突變?yōu)榘腚装彼峥赏耆齈LP施加的變構(gòu)反饋抑制。盡管如此，目前關(guān)于提高PdxH催化活性的研究仍然較少。因此，本研究以光滑念珠菌Nakaseomycesbracarensis中的PdxH（NbPdxH）為研究對象，利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)對NbPdxH進行定向進化和高通量篩選，獲得了酶活性顯著提高的NbPdxH突變體，為生物合成法生產(chǎn)PLP提供重要理論支持和研究方向。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1主要試劑基因隨機突變試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和ClonExpress II重組克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；胰蛋白胨和酵母提取粉購自英國Oxoid公司；鏈霉素購自生工（上海）生物工程有限公司；其余均是分析純試劑。

1.1.2質(zhì)粒、菌株及培養(yǎng)基質(zhì)粒pRB1s、pRB1s-NbpdxH及菌株BW25113、pRB1s-NbpdxH/BW-25113均保藏于本實驗室。Luria-Bertani培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉5 g。ZYM自誘導(dǎo)培養(yǎng)基（1 L）：955 mL ZY培養(yǎng)基，20 mL 50×5 052，20 mL 50×M，10 mL 20%阿拉伯糖，200μL 1 000×Trace，200μL 1 mol·L?1硫酸鎂，1 mL鏈霉素。ZY培養(yǎng)基（1 L）：10 g胰蛋白胨，5 g酵母粉。50×5 052（1 L）：200 g甘油、30g葡萄糖。50×M（1 L）：2 mol·L?1磷酸二氫鈉、2 mol·L?1磷酸氫二鉀、2 mol·L?1氯化銨、0.5 mol·L?1硫酸鈉。

1.2儀器與設(shè)備

3-30KS高速冷凍離心機購自德國Sigma Laborzentrifuge公司；waters高效液相購自沃特世科技（上海）有限公司；UV1800分光光度計購自島津儀器（蘇州）有限公司；自動凝膠成像系統(tǒng)JS-68D購自上海培清科技有限公司；蛋白電泳儀購自美國Bio-rad公司；恒溫培養(yǎng)箱購自上海智誠分析儀器有限公司；IS-AH3GS恒溫振蕩器購自蘇州捷美電子有限公司；SpectraMax i3x酶標(biāo)儀購自Melecular Devices。

1.3試驗方法

1.3.1磷酸吡哆醇氧化酶突變文庫的構(gòu)建與表達本試驗采用易錯PCR（epPCR）技術(shù)構(gòu)建NbPdxH的突變體文庫。模板質(zhì)粒pRB1s-NbpdxH用量為20～400 ng。易錯PCR（epPCR）反應(yīng)體系（50μL）包括：ddH2O 22μL、10×RandomMut buffer 5μL、10×Mutation enhancer 5μL、2.5 mmol·L?1 dNTP 5μL、RandMut DNA polymerase 1μL、Template 1μL、Primers 1μL。利用epPCR體系獲得epNbpdxH片段，連接至pRB1s質(zhì)粒，形成pRB1s-epNbpdxH質(zhì)粒突變體庫，將構(gòu)建的質(zhì)粒文庫化學(xué)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BW25113感受態(tài)細(xì)胞中，計算感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及評估質(zhì)粒連接效率。將篩選到的陽性菌落擴增后提取質(zhì)粒測序，統(tǒng)計和分析NbpdxH基因的堿基突變情況。

從NbpdxH突變體文庫平板上挑單菌落，接種于含有LB培養(yǎng)基的96孔板中，在37℃、900r·min?1條件下培養(yǎng)8 h，再按1%的接種量轉(zhuǎn)接至含有ZYM培養(yǎng)基的96孔板中，在30℃、700 r·min?1條件下培養(yǎng)3 h后轉(zhuǎn)25℃、700 r·min?1繼續(xù)培養(yǎng)19 h。離心收菌，重懸浮后超聲破碎，進行SDS-PAGE，觀察NbPdxH蛋白條帶。

1.3.2磷酸吡哆醇氧化酶突變體的初步篩選PLP與Tris發(fā)生席夫堿反應(yīng)產(chǎn)生Tris-PLP醛亞胺絡(luò)合物，該復(fù)合物可在波長約414 nm處被檢測[20，22]。利用酶標(biāo)儀測定一系列已知濃度的Tris-PLP標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定完成后，得到OD414與濃度關(guān)系，利用Excel軟件制作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

本試驗利用酶標(biāo)儀對酶標(biāo)板進行掃描，檢測PLP含量，對NbpdxH突變文庫進行高通量篩選。高通量篩選流程如下：對NbpdxH突變文庫進行誘導(dǎo)表達，用酶標(biāo)儀測定各孔生物量（OD600）。將96孔板離心，去上清后，每孔加入300μL含7.5 g·L?1 PNP的Tris反應(yīng)液重懸菌體，于30℃、600 r·min?1振蕩器中全細(xì)胞催化3 h。結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀測量每孔在414 nm處的吸光度（OD414）。鑒于培養(yǎng)過程中各孔生物量存在差異，計算單位生物量吸光度比（OD414/OD600）以評估NbPdxH的催化效率。96孔板中，1B孔為陽性對照pRB1s-NbpdxH/BW25113，將各孔OD414/OD600數(shù)值進行均一化處理，陽性對照OD414/OD600的值為1，以大于對照組2倍的比值為標(biāo)準(zhǔn)，初步篩選出催化速率提高突變菌株，并以M1、M2、M3……命名。

1.3.3磷酸吡哆醇氧化酶突變體的復(fù)篩將初篩結(jié)果最好的4株突變菌進一步復(fù)篩，首先將菌株轉(zhuǎn)接到搖瓶中誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心后調(diào)整OD600值為10，以7.5 g·L?1 PNP為底物，在10 mL體系、30℃、150 r·min?1的條件下進行搖瓶全細(xì)胞催化復(fù)篩。結(jié)束后用HPLC進行產(chǎn)物含量測定。

HPLC測定PLP含量的條件：Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（250×4.6 mm，5μm），流動相A相為甲醇，B相為1.01 g·L?1庚烷磺酸鈉。檢測方法為梯度洗脫：A相與B相的比值分別為0 min（5∶95）、10 min（10∶90）、15 min（80∶20）、20 min（80∶20）、25 min（5∶95）、30 min（5∶95）。流速設(shè)定為0.5 mL·min?1，進樣量為10μL，色譜分析在30℃的柱溫下進行，檢測波長設(shè)定為319 nm。1.3.4突變菌株基因序列比對及結(jié)構(gòu)預(yù)測對篩選得到的正向突變體進行序列測定，并將所得序列與原始NbpdxH基因序列比對，以確定堿基及相應(yīng)氨基酸的變化。利用Swiss-Model進行蛋白質(zhì)同源建模并用PyMOL進行可視化，探究正向突變體的空間結(jié)構(gòu)變化。

2結(jié)果與分析

2.1磷酸吡哆醇氧化酶突變文庫的構(gòu)建與鑒定

將pRB1s-epNbpdxH質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BW25113感受態(tài)細(xì)胞中，對平板菌落進行計數(shù)，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率約為9.72×108 cfu·μg?1。隨機選取20個單克隆進行菌液PCR驗證，所有克隆均產(chǎn)生約1 000 bp的單一條帶，與野生型NbpdxH基因大小相符，證實所選克隆均為陽性重組子。對文庫中隨機挑選的20個單克隆菌株提取質(zhì)粒測序，結(jié)果表明在4種NTP中T堿基的突變頻率最高，為35%；C堿基的突變頻率最低，為10%。A堿基和G堿基的突變頻率分別為30%、25%。NbpdxH基因平均每基因堿基突變2個，氨基酸平均突變1個。

5株突變菌株經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖1。NbPdxH蛋白條帶在27 kDa左右，突變菌株中NbPdxH的可溶性表達和包涵體形成與搖瓶培養(yǎng)菌株相似。上清液中蛋白條帶明顯，而沉淀中條帶不明顯，說明大部分蛋白為可溶性蛋白。本試驗結(jié)果表明96孔板中NbPdxH的誘導(dǎo)表達成功，且其蛋白表達良好。

2.2磷酸吡哆醇氧化酶突變體的高通量篩選

用Excel軟件對從酶標(biāo)儀中獲得的數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。由圖2可知，在測試的濃度范圍內(nèi)，Tris-PLP濃度與OD414之間存在良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2大于0.999。

用構(gòu)建好的高通量篩選方法對NbpdxH突變文庫進行篩選，選出M1、M2、M3……M12等12株NbPdxH突變菌株。由圖3可知，M8的OD414/OD600比值最大，為3.53，M2的OD414/OD600比值最小為2.35，其余菌株的OD414/OD600在2.63～3.39范圍內(nèi)波動。

2.3磷酸吡哆醇氧化酶突變體的復(fù)篩

通過對初篩結(jié)果最好的M3、M6、M8、M12突變菌株進行復(fù)篩，結(jié)果見圖4。各突變菌株在相同時間內(nèi)轉(zhuǎn)化PNP合成PLP的量均比出發(fā)菌株的要高。轉(zhuǎn)化進行3 h后，出發(fā)菌株pRB1s-NbpdxH/BW25113和突變菌株M3、M6、M8、M12的PLP生產(chǎn)速率分別為0.47、0.7、0.8、0.9、0.73 g·L?1·h?1。轉(zhuǎn)化進行到12 h后基本停止，M3菌株的PLP產(chǎn)量達到4.2 g·L?1，轉(zhuǎn)化率為56%，相比于出發(fā)菌株（44%）提高了12%；M8菌株的PLP產(chǎn)量達到5.3 g·L?1，轉(zhuǎn)化率為71%，相比于出發(fā)菌株提高了27%，其余菌株的產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)詳見表1。綜上所述，M8為篩選出的產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化率最高的突變菌株，將此菌株命名為pRB1s-NbpdxHM8/BW25113。

2.4突變菌株基因序列比對及結(jié)構(gòu)預(yù)測

pRB1s-NbpdxHM8/BW25113的測序結(jié)果表明，該菌株有2個堿基突變，位置為89位A堿基（突變?yōu)镚堿基）、435位A堿基（突變?yōu)镚堿基），對應(yīng)的氨基酸位置為：30位谷氨酰胺（突變?yōu)榫彼幔?45位賴氨酸（同義突變）。以原始的磷酸吡哆醇氧化酶NbPdxH為模板，利用Swiss-model和Pymol等對M8進行同源建模。由圖5可知，30位點的空間位置位于酶蛋白表面，由Gln突變?yōu)锳rg后，氨基酸極性從中性變?yōu)閴A性，Q30R與T25的相互作用力消失。堿性氨基酸帶有正電荷，這種電荷的改變可能會影響酶的活性位點的電荷環(huán)境，從而增強對底物的吸引力。145位點發(fā)生同義突變，mRNA序列的變化也可能影響蛋白質(zhì)的折疊和穩(wěn)定性，使得突變體的酶促效果增強。

3討論與結(jié)論

PLP在食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)具有重大應(yīng)用潛力，然而野生型PdxH較低的酶活力水平使其在實際的PLP生產(chǎn)應(yīng)用中受到一定限制。本研究對光滑念珠菌Nakaseomycesbracarensis來源的NbpdxH進行定向進化，采用易錯PCR技術(shù)構(gòu)建PdxH隨機突變文庫，建立高通量篩選方法對文庫進行篩選，得到了1株P(guān)dxH酶促效率提高突變菌pRB1s-NbpdxHM8/BW25113，PLP的產(chǎn)量達到了5.3 g·L?1，較原始菌株產(chǎn)量提高了60.6%，PNP轉(zhuǎn)化率提高了27%。通過同源建模等手段對NbPdxHM8突變位點影響PdxH催化活性的原因進行了推測分析，發(fā)現(xiàn)酶活提高的主要原因可能是突變引入了帶正電荷的堿性氨基酸，改變了活性位點的電荷環(huán)境，從而使底物與酶更親和。后續(xù)研究可在充分了解PdxH結(jié)構(gòu)與功能及催化機制的基礎(chǔ)上，選用更有針對性的半理性進化和理性進化策略對PdxH進行酶學(xué)特性改造，繼而拓寬PLP的工業(yè)應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）