高靈敏度嘔吐毒素時間分辨熒光快速定量檢測卡的研發(fā)和應(yīng)用

王振芳，王平東，鄧 慶，葉 金，孫秀蘭，紀 劍，談 婷，趙 皖，肖理文

（1.中央儲備糧德州直屬庫有限公司，山東 德州 253000； 2.中儲糧江蘇質(zhì)檢中心有限公司，南京 211155；3.國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院糧油質(zhì)量安全研究所，北京 102629；4.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；5.南京微測生物科技有限公司，南京 210031)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），又名嘔吐毒素，是某些鐮刀菌種產(chǎn)生的幾種真菌毒素之一， 化學(xué)上屬于真菌毒素的毛霉烯家族成員，為極性有機化合物，屬于B 型毛霉烯， 化學(xué)名稱為12,13－環(huán)氧－3α，7α，15－三羥基單端孢霉－9－烯－8－酮。在其分子中含有3個與其毒性相關(guān)的游離羥基(－OH)[1]。DON 最重要的物理化學(xué)性質(zhì)之一是其超強的熱穩(wěn)定性。DON 的毒性作用包括嘔吐和厭食，改變腸道和免疫功能， 減少對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及增加對感染性和慢性疾病的易感性[2]。 GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準食品中真菌毒素限量》 和GB 2715—2005《糧食衛(wèi)生標(biāo)準》等標(biāo)準中規(guī)定了小麥和小麥粉等制品DON 的允許限量≤1 000 μg/kg。 近年來有學(xué)者對DON 及其衍生物污染情況進行調(diào)查，湖北、安徽、江蘇、 河北4 省脫粒小麥受5 種鐮刀菌毒素的污染較為嚴重且具有顯著的相關(guān)性。尤其是DON 的檢出率高達90.3%，45.3%樣品DON 的含量超過國家限量標(biāo)準1 000 μg/kg，污染較為嚴重[3]。

目前，常見的DON 的準確檢測方法有同位素稀釋液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS/MS）[4]、高效液相色譜（HPLC）[5]、氣相色譜（GC）、質(zhì)譜（MS）、酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫快速檢測卡[6]、薄層層析（TLC）等技術(shù)，能夠精準確定毒素的種類和含量。薄層色譜法由于其操作繁瑣、耗時長、靈敏度低和特異性差等特點現(xiàn)已很少采用。 色譜化學(xué)技術(shù)由于對技術(shù)人員專業(yè)要求高，操作繁瑣機器設(shè)備昂貴，不適合田間作業(yè)以及大量樣本現(xiàn)場篩選。 韓麗等[7]利用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附原理制作了用于測定飼料中DON 含量的試劑盒( icELISA)，姚晶等[8]采用膠體金快速定量法檢測不同水平的小麥及其制品中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量， 使用了液相色譜法對其進行驗證性檢測， 酶聯(lián)免疫法和膠體金法的檢測結(jié)果都與HPLC 的檢測結(jié)果相近， 這些方法相較于HPLC 而言更加適合大批量篩檢以及現(xiàn)場快速測定小麥及其制品中的DON 含量。

本研究利用最新的時間分辨熒光快速定量檢測技術(shù)采用稀有元素“銪”作為示蹤物，開發(fā)出一種用于檢測糧食谷物中的DON 含量的高靈敏度嘔吐毒素時間分辨熒光快速定量檢測卡， 以期為糧食行業(yè)快速檢測提供參考方法。

1 材料和儀器

1.1 主要試劑與耗材

時間分辨熒光微球， 南京微測生物科技有限公司；嘔吐毒素單抗，實驗室自制；嘔吐毒素抗原，實驗室自制；嘔吐毒素（DON）標(biāo)準品，國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院；超純水，實驗室自制；硝酸纖維素膜（NC 膜），美國Millipore 公司；樣品墊（玻璃纖維），美國奧斯龍；吸水紙，上海金標(biāo)生物科技有限公司；PVC 膠板，上海金標(biāo)生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

FD－600 型熒光定量快速檢測儀和FD－2200 型檢測卡恒溫孵育器， 上海飛測生物科技有限公司；XYZ 3060 劃膜儀，美國Biodot；峰航劃膜噴金儀和HGS201 可編程切條機， 杭州峰航科技有限公司；GL－21M 高速冷凍離心機， 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；DHG－9620A 電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海天呈實驗儀器制造有限公司。

2 實驗方法

2.1 優(yōu)化C 線劃膜位置

定義硝酸纖維素140 膜（ 140NC 膜）靠近吸水紙端為上端，分別設(shè)置140NC 膜距離上端8 mm、12 mm、16 mm 處依次為C、T1、T2 線。 聯(lián)動工藝的C 線位于16 mm 處， 獨立工藝的C 線位于NC 膜上8 mm 位置處，C 線劃膜液的濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，保持T 線劃膜液濃度0.3 mg/mL 不變，檢測DON 的定量值濃度點250 μg/kg 的濃度點5 個平行樣，將檢測濃度的精密度，即標(biāo)準差與平均值的比值（CV）作為評價指標(biāo)，對比這兩種工藝對檢測卡整體性能的影響。

2.2 噴膜稀釋液的篩選

交聯(lián)劑碳二亞胺（EDC）使用量10 μL/mL，抗體量15 μg/mL，T1 線劃膜液濃度為0.2 mg/mL，T2 線劃膜液濃度為0.1 mg/mL，劃膜稀釋液使用檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液（12 mmol/L，pH 6.4） ，其余各項參數(shù)均保持一致， 甘氨酸–氫氧化鈉緩沖液（12mM，pH 7.35）、Tris－HCl 緩沖液（12 mmol/L，pH 8.02）、硼酸－硼砂緩沖液 （12 mmol/L，pH 7.27）、HEPESNaOH 緩沖溶液（12 mmol/L，pH 8.06）。 用這四種噴膜稀釋液進行噴膜并制作成檢測卡用來檢測帶值樣本，DON 的含量范圍為600～5 000 μg/kg。 對比這4種噴膜稀釋液體系所制作的檢測卡的梯度、 均一性以及準確度。 篩選出最適合的噴膜稀釋液進行EDC使用量、抗體量及T1 線和T2 線劃膜濃度的優(yōu)化。

2.3 劃膜稀釋液的篩選

EDC 使用量10 μL/mL，抗體量15 μg/mL，T1 線劃膜液濃度為0.2 mg/mL，T2 線劃膜液濃度為0.1 mg/mL，噴膜稀釋液使用篩選出來性能較好的硼酸－硼砂緩沖液 （12 mmol/L，pH 7.27），C 線劃膜液為HEPES－NaOH 緩沖液（15 mmol/L，pH 7.4）包含2%蔗糖、1%NaCl 以及0.05%P300 。 T 線劃膜液為以下五種緩沖液且每種緩沖液中包含1%蔗糖、0.15%NaCl 以及0.05%P300。 5 種緩沖液包括MES－NaOH緩沖液 （10 mmol/L，pH 6.5）、Tris－HCl 緩沖液（10mmol/L，pH 7.0）、醋酸－醋酸銨緩沖液（10 mmol/L，pH 7.0）、HEPES－NaOH 緩沖液 （10 mmol/L，pH 7.4）、硼酸－硼砂緩沖液（10 mmol/L，pH 8.0），對比這5 種T 線劃膜液制作的檢測卡的抑制率范圍以及效價（即：陰性樣本檢測的熒光值）、靈敏度，選出最適合的劃膜稀釋液進行后續(xù)優(yōu)化實驗。

2.4 試驗設(shè)計與因素選擇

根據(jù)高靈敏度嘔吐毒素時間分辨熒光檢測試卡在檢測標(biāo)準品以及樣本過程中， 確定了EDC 使用量，抗體的使用量，T2 線劃膜濃度以及T1 線劃膜濃度是影響試劑條的效價和靈敏度的明顯因素， 其中抗體量未完全按照等倍數(shù)選擇， 真菌毒素檢測中一般抗體量的使用范圍在5～30 μg/mL，為了摸索這一范圍的抗體量對檢測卡性能的影響， 故選擇了以下5 個抗體濃度水平。根據(jù)這4 個主要因素，EDC 加入量（A）取10、15、20、25、30 μL/mL 這5 個水平，偶聯(lián)加入的抗體量（B）5、10、15、25、30 μg/mL，T2 線劃膜濃度 （C）0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL 和T1 線劃膜濃度（D）0.01、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL 這五個水平。 試驗因素及水平表如表1 所示。 根據(jù)正交表L25（56）分別進行試驗。 最后將正交實驗中的五個水平的最佳選擇組合后制作檢測卡進行性能驗證。 以DON 時間分辨熒光定量檢測試劑卡的定量值濃度點250 μg/kg 的抑制率作為優(yōu)化目標(biāo)， 篩選出檢出范圍100～3 000 μg/kg 的抑制率為35%～90%、 效價在20 000 左右的最佳組合。

表1 正交試驗的因素與水平設(shè)計

2.5 對比不同方法檢測實際樣本中DON 含量

選取來自國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院、江蘇質(zhì)檢中心以及南京微測生物科技有限公司的18 個質(zhì)控樣本，樣本類型覆蓋玉米、小麥以及小麥制品，其中DON 的含量范圍為400～3 000 μg/kg。分別使用高效液相色譜法和高靈敏度嘔吐毒素時間分辨熒光快速定量檢測卡檢測樣本。

3 結(jié)果與討論

3.1 獨立工藝和聯(lián)動工藝的選擇

DON 的定量值250 μg/kg 的濃度點的檢測結(jié)果的T/C 值如圖1、圖2 所示，獨立工藝的精密度（CV值）的變動范圍為1.79%～5.50%，而聯(lián)動工藝的CV值在11.62%～21.84%范圍。 顯然獨立工藝檢測效果更佳，此時C 線的T/C 值CV 最小值為1.8%，C 線的劃膜濃度為0.2 mg/mL。 獨立工藝的C 值與T1、T2值變動是互不影響；聯(lián)動工藝的C、T1、T2 值變動是相互影響的， 當(dāng)C 值升高時，T1 和T2 值都是降低的，但是聯(lián)動工藝造成它們的變化幅度并不可控。標(biāo)準品檢測的濃度CV 值尚且變化幅度較大， 當(dāng)檢測實際樣本時， 由于基質(zhì)效應(yīng)會給檢測結(jié)果造成更大的誤差。 獨立工藝的C、T1 和T2 值變化趨勢是同向的，這就使得T/C 值能保持相對穩(wěn)定。

圖1 獨立工藝C、T 值及CV 變化

圖2 聯(lián)動工藝的C、T 值及T/C 的CV 變化

3.2 噴膜稀釋液的優(yōu)化

用甘氨酸–氫氧化鈉緩沖液 （12 mmol/L，pH 7.35）、Tris－HCl 緩沖液（12 mmol/L，pH 8.02）、硼酸－硼砂緩沖液 （12 mmol/L，pH 7.27）、HEPESNaOH 緩沖溶液（12 mmol/L，pH 8.06）這4 種噴膜稀釋液進行噴膜并制作成檢測卡用來檢測帶值樣本，DON 的含量范圍為600～5 000 μg/kg。對比這4 種噴膜稀釋液體系所制作的檢測卡的梯度、 均一性以及準確度。 如圖3 所示，4 種噴膜稀釋液對比結(jié)果顯而易見，其中硼酸－硼砂緩沖液（12 mmol/L，pH 7.27）的噴膜稀釋液體系的帶值樣本T/C 值CV、 濃度CV最小，準確度達到95.00%。 因此，優(yōu)選硼酸－硼砂緩沖液（12 mmol/L，pH 7.27）的噴膜稀釋液體系進行后續(xù)優(yōu)化實驗。

圖3 不同噴膜稀釋液體系的DON 檢測卡的帶值樣本結(jié)果

3.3 劃膜稀釋液的篩選

DON 標(biāo)準品的250 μg/kg、5 000 μg/kg 的抑制率以及效價如圖4 所示，Tris－HCl （10 mmol/L，pH 7.0） 的劃膜液體系制作的檢測卡的靈敏度（250μg/kg 的抑制率） 最高，250～5 000 μg/kg 抑制率范圍達到為35.72%～94.8%，但是它的效價僅有16 576，是這5 種劃膜液體系中相對較低的一種。 HEPESNaOH（10 mmol/L，pH 7.4）劃膜液體系的檢測卡效價為24439，是5 種中相對較高的一種，靈敏度相對較低，抑制率范圍為25.78%～91.73%。 醋酸－醋酸銨（10 mmol/L，pH 7.0）、 硼酸－硼砂 （10 mmol/L，pH 8.0）和MES－NaOH（10 mmol/L，pH 6.5）劃膜液體系的效價分別為19 417、20 978、21 002；抑制率范圍為33.58～93.03、32.21%～92.70%和26.02%～91.04%。 由于本研究主要以開發(fā)一種高靈敏度的檢測卡為目的，250 μg/kg 的抑制率是主要關(guān)注點， 且效價15 000～25 000 都是可接受的效價范圍，通過其它方面的優(yōu)化，可以一定程度提高效價，因此考慮靈敏度，優(yōu)選Tris－HCl（10 mmol/L，pH 7.0）的劃膜液體系進行后續(xù)優(yōu)化實驗。

圖4 不同劃膜稀釋液體系的DON檢測卡的抑制率范圍和效價

3.4 正交試驗結(jié)果分析

根據(jù)正交表L25（56）進行試驗安排，試驗結(jié)果如表2 所示。ki為因素的效價之和的平均值，R 為各因素列的極差，公式為R=kimax－kimin。極差R 值的大小代表了各因素對效價的影響關(guān)系，R 值越大，該影響因素越重要。

表2 正交試驗結(jié)果

3.5 驗證性試驗

鑒于沒有考慮因素間的交互作用及誤差等因素，因此需要對最優(yōu)方案試驗驗證。 由于T1 線的不同濃度的劃膜液制作的檢測卡的抑制率相差不大，而雙T 線主要起到增補的效果，需要結(jié)合效價以及均一性進行選擇， 若劃膜濃度過低而檢測的樣本中DON 含量過低， 會導(dǎo)致未結(jié)合的抗體無法完全被NC 膜上的抗原截留，從而出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。 通過正交試驗得出的最優(yōu)方案為A4B2C1D4組合。 由于正交試驗中， 得出的是每個單一因素的最佳結(jié)果，250 μg/kg 的抑制率都較低，都在30%以下，故需將最優(yōu)方案A4B2C1D4組合在一起后制作檢測卡，實驗結(jié)果為定量值濃度點250 μg/kg 的抑制率為39.54%，驗證了試驗結(jié)果的準確性。

3.6 主要工藝參數(shù)對檢測卡性能的影響

根據(jù)正交試驗數(shù)據(jù)處理的結(jié)果繪制出EDC 用量、 抗體量、T1 線劃膜濃度、T2 線劃膜濃度與效價之間的相互關(guān)系曲線，如圖5 所示。

圖5 （A） EDC 量對試劑條效價和靈敏度的影響；（B）抗體量對試劑條效價和靈敏度的影響；（C）T1 線劃膜濃度試劑條效價和靈敏度的影響；（D）T2 線劃膜濃度試劑條

3.6.1 EDC 用量的影響

如圖5A 所示為EDC 用量和效價以及定量值濃度點250 μg/kg 的關(guān)系曲線圖。 隨著EDC 含量的增加，檢測卡的效價呈現(xiàn)下降趨勢，但是關(guān)鍵濃度點的抑制率反而在上升。綜合考慮，宜選用第4 水平下的EDC 添加量為25 μL/mL， 此時檢測卡的抑制率能夠達到27.50%，效價為17 105。

3.6.2 抗體量的影響

圖5B 所示為抗體量對檢測卡的性能的影響，效價會隨著抗體量的增加而增加，但抗體量到達25 mg/mL，效價基本趨于穩(wěn)定，不再往上升，達到飽和?？赡苡捎谖⑶虮砻娴聂然鶖?shù)量有限， 即使增加抗體量也無法繼續(xù)與微球上活化后的羧基結(jié)合。 另一方面，可能由于抗體量持續(xù)增加導(dǎo)致空間位阻增大，靈敏度隨著抗體量的增加先增加， 達到10 mg/mL 后靈敏度會相應(yīng)地隨之下降。 綜合分析， 選擇抗體量10 mg/mL 對效價和靈敏度的性能均能兼顧，此時定量值濃度點的抑制率為23.10%，效價為19 471。

3.6.3 T 線濃度對檢測卡效價的影響

如圖5C 所示，T2 線劃膜濃度超過0.15 mg/mL后效價逐漸趨于穩(wěn)定， 定量值濃度點抑制率隨著劃膜濃度增加而降低，抗原濃度并非越高越好，從節(jié)約成本的角度考慮，T2 線的劃膜濃度為0.05 mg/mL。如圖5D 所示，T1 線的劃膜濃度為0.15 mg/mL，此時它的效價為21 878，抑制率為22%。 T1 線的劃膜濃度增加抑制率基本保持不變， 當(dāng)增加到0.2 mg/mL后抑制率呈現(xiàn)下降趨勢， 效價在0.05～0.15 mg/mL的范圍內(nèi)逐漸上升，達到0.2 mg/mL 反而下降，這可能是由于NC 膜是具有一定比表面積微孔結(jié)構(gòu)的薄膜，抗原通過靜電作用或疏水作用與NC 膜結(jié)合，隨著劃膜濃度的增加，堆疊在NC 膜上的抗原量增加，加樣后在表面活性劑的作用下，抗原又被大量沖走，無法與抗體一一結(jié)合。 其次，劃膜濃度偏低，會導(dǎo)致檢測卡整體的均一性較差。 綜合考慮，T1 線劃膜濃度為0.15 mg/mL。

3.7 實際樣品檢測結(jié)果對比

以液相色譜檢測的結(jié)果作為參考值， 由圖6 可以看出標(biāo)準品標(biāo)準曲線回算檢測卡檢測的樣本濃度偏陰的結(jié)果有6 例，偏陽的結(jié)果10 例，檢測值和參考值接近的樣本有2 例。 由于基質(zhì)效應(yīng)需要對標(biāo)準曲線進行調(diào)整。校正曲線后，校正值接近參考值的樣本有10 例。說明采用硼酸－硼砂緩沖液（12 mmol/L，pH 7.27）體系作為噴膜稀釋液，Tris－HCl（10mmol/L，pH 7.0）劃膜液體系、EDC 用量25 μL/mL、抗體量10 μg/mL、T2 線劃膜濃度0.05 mg/mL、T1 線劃膜濃度0.15 mg/mL 制作的高靈敏度嘔吐毒素檢測卡可大批量、快速、準確定量被嘔吐毒素污染的糧食谷物。

圖6 檢測值、校正值與參考值的關(guān)系圖