HIF-3α蛋白檢測在子宮內(nèi)膜病變篩查中的應用價值

張靜芳 易嘉升 陸寶明

【摘要】目的：探討缺氧誘導因子-3α（Hypoxia inducible factor-3α，HIF-3α）檢測在子宮內(nèi)膜病變篩查中的應用價值。方法：收集于本院就診的女性因良性疾病切除子宮患者的正常內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織標本，其中正常內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜不典型增生、子宮內(nèi)膜腺癌、子宮內(nèi)膜非腺癌標本各16例。免疫組化實驗檢測正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜增生和不典型增生組織以及子宮內(nèi)膜腺癌組織和子宮內(nèi)膜非腺癌組織中HIF-3α蛋白的表達。Western blot檢測比較各組織HIF-3α表達情況。結(jié)果：與正常內(nèi)膜組織相比，子宮內(nèi)膜增生癌變后HIF-3α的表達顯著增多，其中子宮內(nèi)膜不典型增生組織內(nèi)HIF-3α表達量最多，而子宮內(nèi)膜腺癌與子宮內(nèi)膜非腺癌組織內(nèi)無明顯差異。結(jié)論：HIF-3α蛋白檢測可作為臨床子宮內(nèi)膜病變篩查過程中的重要依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】HIF-3α蛋白；子宮內(nèi)膜病變；篩查

基金項目：廣東省醫(yī)學科學技術(shù)研究基金項目《HIF3α蛋白在不同子宮內(nèi)膜病變中的表達》（B2021277）

Application value of HIF-3α protein detection in screening of endometrial lesions

ZHANG Jingfang， YI Jiasheng， LU Baoming

East Guangdong Hospital， The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Meizhou， Guangdong 514000， China

【Abstract】Objective：To investigate the application value of Hypoxia inducible factor-3α （HIF-3α） detection in screening of endometrial lesions. Methods：The specimens of normal endometrial tissue， endometrial carcinoma tissue and paracancer tissue were collected from women who underwent hysterectomy due to benign diseases. There were 16 specimens of normal endometrial tissue， endometrial hyperplasia， endometrial atypical hyperplasia， endometrial adenocarcinoma and endometrial non-adenocarcinoma respectively. The expression of HIF-3α protein in normal endometrial tissue， endometrial hyperplasia and atypical hyperplasia tissue， endometrial adenocarcinoma tissue and endometrial non-adenocarcinoma tissue was detected by immunohistochemical assay. Western blot analysis was performed to compare HIF-3α expression in different tissues. Results： Compared with normal endometrial tissues， the expression of HIF-3α increased significantly after endometrial hyperplasia， and the expression of HIF-3α was the highest in endometrial atypical hyperplasia tissues， while there was no significant difference between endometrial adenocarcinoma and non-endometrial adenocarcinoma tissues. Conclusion：The detection of HIF-3α protein can be used as an important basis for clinical screening of endometrial lesions.

【Key Words】HIF-3α protein； Endometrial lesions； Screening

癌細胞可以利用氧氣穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)驅(qū)動癌癥進展，缺氧誘導因子（Hypoxia inducible factors，HIF）是調(diào)節(jié)氧氣穩(wěn)態(tài)的主要因子之一，負責與成年人體內(nèi)50萬億個細胞中的每一個細胞的氧氣供需相調(diào)試，在這個過程中，HIFs 激活數(shù)千個基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因轉(zhuǎn)錄過程中激活或者介導血管生成、癌癥干細胞生成、細胞運動、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細胞外間質(zhì)重塑、葡萄糖和脂類代謝、免疫逃避、細胞侵襲和轉(zhuǎn)移等。其中在轉(zhuǎn)錄水平上，維持氧穩(wěn)態(tài)的重要節(jié)段是如何利用缺氧誘導因子（HIFs）的作用，以及為了響應降低的氧可用性HIFs介導的每個細胞如何轉(zhuǎn)錄程序進行重排。缺氧誘導因子是細胞應對缺氧狀態(tài)的關(guān)鍵因子。

HIF是α/β異二聚體的轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)節(jié)細胞對低氧環(huán)境的反應，在三種HIF-α亞型中，HIF-3α與HIF-1α和HIF-2α在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達調(diào)節(jié)方面不有所不同，并且長期以來，HIF-3α被認為是HIF調(diào)控基因的負調(diào)控因子并且具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，在缺氧時與HIF-1和HIF-2競爭結(jié)合靶基因中的轉(zhuǎn)錄元件，從而對基因表達產(chǎn)生負面影響。缺氧誘導因子的活化隨后誘導下游靶基因，導致一系列反應，由此產(chǎn)生的異常過程或代謝產(chǎn)物反過來影響缺氧誘導因子的穩(wěn)定性。鑒于HIFs在腫瘤進展中的作用，HIFs已被認為是提高治療效果的治療靶點。目前已知，HIF-1和HIF-2作為缺氧轉(zhuǎn)錄反應的主要調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，HIF-3α是迄今為止研究最少的一種。

通過美國癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫的分析，高突變負荷組子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-3α突變顯著，提示其可能在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，是發(fā)展中國家發(fā)病率最高的婦科惡性腫瘤，但其具體發(fā)病機制目前仍不十分清楚，在鑒別診斷過度增生和高分化子宮內(nèi)膜癌的組織學研究中仍然存在爭議，利用現(xiàn)有的標記物來預測非典型子宮內(nèi)膜癌患者是否過度增生尚不可靠[1]。研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜增生主要是指子宮內(nèi)膜內(nèi)腺體的過度增生，會導致腺體與基質(zhì)的比例過高，這一細胞學異型性，可能進展為與子宮內(nèi)膜癌和其他病理變化共存，在子宮內(nèi)膜過度增生或癌癥中表達改變的生物標志物，如孕激素受體、胰島素樣生長因子、視黃醛去氫酶II型和分泌的卷曲相關(guān)蛋白4，似乎均有望用作早期腫瘤標志物，然而如何通過早期腫瘤標志物的檢測進而盡早阻斷子宮內(nèi)膜疾病的發(fā)生發(fā)展仍然有待研究[2]。本研究擬通過免疫組化和Western blot檢測不同子宮內(nèi)膜病變組織中HIF-3α蛋白的表達情況，對發(fā)現(xiàn)其潛在的分子機制和新型分子靶標應用于子宮內(nèi)膜癌的早期診斷有重要意義。

1.1 一般資料

使用G.Power軟件估計樣本量，取α=0.05，1-β=0.8，算得免疫組化需要總標本80例，Western blot需要總標本42例。選取正常內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜不典型增生、子宮內(nèi)膜腺癌、子宮內(nèi)膜非腺癌標本各16例，術(shù)中取出組織后，在無菌條件下將組織置于福爾馬林浸泡（浸泡時間>12h），組織石蠟包埋，制成蠟塊，經(jīng)病理確診后用于IHC檢測；選取女性因良性疾病切除子宮患者的正常內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織作為標本，術(shù)中取出標本后，在無菌條件下放入液氮盒中凍存，并保存在-80℃冰箱中，使用Western blot法檢測HIF-3α表達情況。

1.2 實驗試劑

鼠抗人HIF-3α單克隆抗體由美國Abcam公司提供；免疫組化S-P試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司提供；DAB酶底物顯色劑由碧云天生物科技公司提供；GAPDH一抗、HRP標記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG購自碧云天生物技術(shù)公司；HIF-3α抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 2.實驗方法

1.2.1 免疫組化實驗

造模結(jié)束后將各組織進行固定、脫水、透明、透蠟、包埋、切片。采用免疫組化S-P法進行染色，染色步驟按照試劑盒要求進行。陽性對照：已知鼠抗人HIF-3α單克隆抗體表達陽性的內(nèi)膜組織；陰性對照：PBS代替一抗。

1.2.2 Western blot實驗

每例標本取組織約50mg，加入細胞裂解液、研磨、離心，通過試劑盒檢測各組蛋白樣品的濃度。使用SDS-PAGE 在電泳液中分離。電泳通過SDSPAGE分離各組蛋白樣品，電泳結(jié)束后在200mA恒流條件下在轉(zhuǎn)移液中將各組蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后PBS洗滌，后將膜在封閉液中室溫封閉1h左右，封閉結(jié)束后PBS洗滌，后將膜與稀釋后的Gli-1和Shh抗體在4℃冰箱中孵育過夜。孵育結(jié)束后TBST洗滌，室溫下將膜與稀釋后的山羊抗兔IgG孵育1h左右，最后通過顯影儀顯影并用ImageJ進行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料采用（%）表示，進行x2檢驗，計量資料采用（x±s）表示，進行t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.1 免疫組化（IHC）檢測HIF-3α蛋白表達情況

采用IHC法對16例人子宮內(nèi)膜癌組織及周圍組織的石蠟包埋切片進行HIF-3α蛋白檢測。HIF-3α蛋白在子宮內(nèi)膜不典型增生狀態(tài)下表達量明顯最多，略高于子宮內(nèi)膜癌，明顯高于正常內(nèi)膜組織以及子宮內(nèi)膜增生組織。而子宮內(nèi)膜腺癌與非腺癌標本中，并未發(fā)現(xiàn)太大差異。（圖1）

正常子宮內(nèi)膜；（b）子宮內(nèi)膜增生；（c）子宮內(nèi)膜不典型增生；（d）子宮內(nèi)膜腺癌；（e）子宮內(nèi)膜非腺癌

有研究表明，當HIF-α異二聚體在低氧條件下處于穩(wěn)定狀態(tài)時可以執(zhí)行轉(zhuǎn)錄活性。HIF-1α和 HIF-2α異源二聚體是產(chǎn)生基因活化的主要轉(zhuǎn)錄因子，這些基因在其啟動子序列中含有缺氧反應元件。癌細胞中HIF-α靶基因的活化可促使新陳代謝過程中發(fā)生氧化磷酸化、糖酵解、生存活化、血管生成、轉(zhuǎn)移和增殖路徑。雖然過去的大部分研究集中在不同類型癌癥中HIF-1α和HIF-2α活性的重要性，但很少有數(shù)據(jù)可以充分解釋不同類型癌癥中HIF-3α表達水平和分子活性的重要性。HIF-3α含有ODD結(jié)構(gòu)域，可以在低氧條件下穩(wěn)定與 HIF-β亞單位競爭二聚化來限制HIF-1α和HIF-2α的活性，目前已證明HIF-3α蛋白在肝臟、胃、大腸中都有表達，此外在正常細胞和缺氧細胞中也均有表達，并且其分布并不局限于細胞核中，在細胞胞漿中也有少量的表達，若將細胞保持在缺氧狀態(tài)下，HIF-3α蛋白的表達會明顯增加。盡管HIF-3α已經(jīng)顯示出組織特異性的表達模式，但是它在許多類型的癌癥中的確切表達模式仍然是未知的[3]。

因此有研究對HIF-3α蛋白對靶細胞的侵襲和遷移能力做了相關(guān)實驗，臨床研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者體內(nèi) HIF-3α蛋白表達水平越高，其生存率反而降低，進一步檢測發(fā)現(xiàn)HIF-3α蛋白表達升高時，癌細胞的局部侵襲和遠處轉(zhuǎn)移的能力明顯增強。而在動物實驗中研究人員發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下，敲除HIF-3α后能夠明顯抑制小鼠體內(nèi)胰腺癌細胞的生物學行為。當HIF-3α過表達時能夠明顯促進小鼠體內(nèi)胰腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移。在近年的文獻報道中，實驗人員發(fā)現(xiàn)HIF-3α促進胰腺癌細胞生物學行為的過程可能與 RhoCROCK1信號通路的調(diào)控有關(guān)。此外，研究已證明HIF-1α和HIF-2α可能在肺缺氧適應過程中起作用，但HIF-3α聯(lián)合血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）可能在心臟對缺氧的反應中起重要作用[4]。本研究中關(guān)于HIF-3α蛋白在子宮內(nèi)膜癌病變發(fā)展中的表達發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌變時的HIF-3α蛋白表達明顯大于正常內(nèi)膜組織以及子宮內(nèi)膜增生組織，其中子宮內(nèi)膜不典型增生狀態(tài)為HIF-3α蛋白的最高峰，略高于子宮內(nèi)膜癌，明顯高于正常內(nèi)膜組織以及子宮內(nèi)膜增生組織。

綜上所述，HIF-3α蛋白與子宮內(nèi)膜病變的之間存在一定相關(guān)性，當細胞處于不典型增生狀態(tài)時HIF-3α蛋白為高表達狀態(tài)，子宮內(nèi)膜腺癌與非腺癌標本總體HIF-3α蛋白表達量大于正常內(nèi)膜以及子宮內(nèi)膜增生狀態(tài)。這為后續(xù)發(fā)現(xiàn)其潛在的分子機制和新型分子靶標應用于子宮內(nèi)膜癌的早期診斷有重要意義。

參考文獻

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