旋毛蟲免疫逃避機(jī)制的研究進(jìn)展

錢艷紅,宋 帥,溫肖會(huì),賈春玲,呂殿紅,袁子國(guó),羅勝軍

旋毛蟲(Trichinellaspiralis)是一種專性胞內(nèi)寄生線蟲,呈世界性分布,宿主范圍超過150種動(dòng)物,包括哺乳動(dòng)物、鳥類和爬行動(dòng)物等[1]。旋毛蟲感染宿主后可引發(fā)旋毛蟲病,旋毛蟲病屬于人獸共患病,被列為世界第七大食源性寄生蟲病,也被我國(guó)列為二類動(dòng)物疫病[2]。旋毛蟲可以感染多種動(dòng)物,并主要通過豬肉及豬肉制品傳播給人類,旋毛蟲感染人以后,可引起人類腹痛腹瀉、發(fā)燒、肌肉絞痛,嚴(yán)重時(shí)引起腦炎導(dǎo)致人死亡[3]。2005-2008年,中國(guó)5個(gè)省份屠宰場(chǎng)屠宰的豬中旋毛蟲感染率高達(dá)5.75%[4]。2009-2020年,中國(guó)報(bào)告了8次人旋毛蟲病暴發(fā)事件,共479例,其中2例死亡[5]。因此,旋毛蟲感染不僅是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,而且對(duì)養(yǎng)殖業(yè)和肉類食品安全構(gòu)成威脅。

旋毛蟲生活史復(fù)雜,主要分為肌肉幼蟲(muscle larva,ML)、成蟲(adult Worm,AW)和新生幼蟲(newborn larva,NBL)3個(gè)時(shí)期[6]。如圖1所示,宿主通過攝入含ML包囊的生肉或未煮熟的肉感染旋毛蟲,含有ML的包囊在宿主胃蛋白酶的消化下釋放ML,ML進(jìn)入宿主腸道,那里它們穿透腸粘膜并經(jīng)歷4次蛻皮,發(fā)育成為AW(雄性或雌性),AW經(jīng)交配產(chǎn)生NBL,NBL穿透腸壁,進(jìn)入淋巴系統(tǒng),并通過血流遷移到橫紋肌,最后NBL侵入橫紋肌細(xì)胞成熟為ML[7-8]。

圖1 旋毛蟲生活史及調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the life history and regulation of the host immune response of Trichinella spiralis

旋毛蟲感染宿主后可與其長(zhǎng)期共存,根據(jù)宿主的壽命不同,旋毛蟲可在嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)持續(xù)存在直至宿主死亡,在高等動(dòng)物或人體內(nèi)存在數(shù)月至數(shù)年[9]。旋毛蟲之所以能夠在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活和持續(xù)感染,不被宿主清除,是因?yàn)樗梢酝ㄟ^各種逃避機(jī)制成功躲避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊[10]。因此,對(duì)旋毛蟲逃避宿主免疫機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)和了解,將為開發(fā)有效防治旋毛蟲的藥物和疫苗提供重要幫助和理論基礎(chǔ)。

1 抗原變異

抗原變異是指病原體不斷改變自身抗原,產(chǎn)生新的變異體,使宿主已產(chǎn)生的抗體不再起作用。按照來源部位的不同,旋毛蟲的抗原主要分為表面抗原、蟲體抗原和代謝分泌抗原[11]。旋毛蟲表面抗原分子是構(gòu)成蟲體表面角質(zhì)層的主要成分,可直接暴露于宿主的免疫系統(tǒng),并在旋毛蟲的蛻皮和生長(zhǎng)過程中發(fā)生變化。旋毛蟲蟲體抗原是蟲體死亡后的可溶性部分,主要來自于蟲體內(nèi)部,不易被宿主識(shí)別[12]。旋毛蟲代謝分泌(excretory-secretory, ES)抗原是蟲體分泌到體外與宿主機(jī)體直接作用的抗原,參與生命周期中的多種功能[13]。旋毛蟲發(fā)育史復(fù)雜,為了逃避宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別,旋毛蟲AW、NBL和ML的表面抗原、蟲體抗原和代謝分泌抗原發(fā)生了不同程度的變異,這種抗原變異體現(xiàn)在相同抗原占比的改變以及不同新抗原的產(chǎn)生。如Liu JY等[14]將旋毛蟲AW、NBL和ML裂解物中的蛋白質(zhì)通過同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技術(shù)進(jìn)行鑒定,在所有發(fā)育階段共鑒定出4 691種蛋白質(zhì),在成對(duì)(NBL與AW、AW與ML及NBL與ML)比較中,共發(fā)現(xiàn)146種蛋白質(zhì)差異表達(dá),階段特異性蛋白質(zhì)的數(shù)量在ML與NBL中最高(352種蛋白質(zhì)),是NBL與AW(93種蛋白質(zhì))的3倍。旋毛蟲抗原的變異延緩了宿主清除免疫的進(jìn)程,有利于蟲體逃避宿主的免疫攻擊。

2 調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)

旋毛蟲從感染到形成包囊前的整個(gè)過程是其能夠在宿主體內(nèi)建立長(zhǎng)期感染的關(guān)鍵。在此期間,旋毛蟲暴露于宿主免疫系統(tǒng)中,宿主將啟動(dòng)各種免疫反應(yīng)阻止旋毛蟲侵入機(jī)體并將其清除。為了逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊,旋毛蟲通過ES抗原誘導(dǎo)T細(xì)胞極化、抑制樹突狀細(xì)胞成熟以及調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型以抑制宿主的抗寄生蟲免疫反應(yīng)(圖1)。

2.1 誘導(dǎo)T細(xì)胞極化 在健康宿主免疫系統(tǒng)中,Th1/Th2免疫反應(yīng)處于平衡狀態(tài),調(diào)控機(jī)體免疫狀態(tài)和免疫水平,有利于宿主抵抗外來病原體入侵。旋毛蟲感染宿主后,能通過ES抗原調(diào)控宿主免疫系統(tǒng),引發(fā)Th2反應(yīng)為主的Th1/Th2混合免疫反應(yīng),使宿主免疫反應(yīng)失衡,導(dǎo)致宿主免疫功能受到抑制,以逃避宿主的免疫攻擊,保護(hù)自身不被清除[15]。

旋毛蟲在腸感染階段,宿主以γ-干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)和白細(xì)胞介素-12(IL-12)增加為特征的Th1免疫應(yīng)答反應(yīng)為主,在此期間抑制Th1型免疫將為旋毛蟲AW的入侵、發(fā)育和幼蟲的產(chǎn)生提供充足的時(shí)間[16]。在NBL移行階段和ML包囊形成階段,宿主免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)門h2型免疫應(yīng)答反應(yīng),并占主導(dǎo)地位,其特征是產(chǎn)生高水平的細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13,以協(xié)調(diào)杯狀細(xì)胞增生、粘蛋白產(chǎn)生增加、平滑肌收縮力增強(qiáng)和上皮細(xì)胞周轉(zhuǎn)延長(zhǎng)等上皮細(xì)胞反應(yīng),有助于減輕蟲體給宿主造成的組織損傷并加強(qiáng)組織修復(fù),維持旋毛蟲在宿主體內(nèi)的慢性感染[17-18]。Song Y等[19]采用MSD電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)旋毛蟲感染小鼠的免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子譜。脾臟MSD結(jié)果顯示,感染后6 h至6 d時(shí)Th1免疫受到抑制,6 d時(shí)Th2免疫應(yīng)答水平顯著升高;腸系膜淋巴結(jié)在3 d至 6 d時(shí)表現(xiàn)出 Th1/Th2 混合免疫應(yīng)答,Th1在6 d時(shí)呈下降趨勢(shì);流式細(xì)胞術(shù)分析顯示,感染后6 h,Th1細(xì)胞比例顯著降低,Th2細(xì)胞比例明顯升高,這些結(jié)果表明旋毛蟲誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生Th2型主導(dǎo)的免疫反應(yīng)。Gao X等[20]對(duì)旋毛蟲ML衍生的細(xì)胞外囊泡蛋白(Ts-ML-EVs)進(jìn)行蛋白組學(xué)鑒定,并用純化的TS-ML-EVs皮下注射免疫BALB/c小鼠,在用旋毛蟲感染后,檢測(cè)TS-ML-EV誘導(dǎo)的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答,結(jié)果表明,TS-ML-EVs能誘導(dǎo)以Th2為主的Th1/Th2混合免疫應(yīng)答。

2.2 抑制樹突狀細(xì)胞成熟 樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)屬于專職抗原遞呈細(xì)胞,主要功能是識(shí)別、捕獲、處理和向T細(xì)胞呈遞抗原[21]。根據(jù)分化狀態(tài)的不同,DC分為前體樹突狀細(xì)胞、 未成熟樹突狀細(xì)胞、 遷移期樹突狀細(xì)胞和成熟樹突狀細(xì)胞,只有成熟樹突狀細(xì)胞才能刺激初始T細(xì)胞活化,誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生T細(xì)胞反應(yīng)。在宿主免疫反應(yīng)過程中,DC既是始動(dòng)者也是協(xié)調(diào)者,它可以通過多種模式識(shí)別受體激活途徑引導(dǎo)免疫應(yīng)答,這是適應(yīng)性免疫應(yīng)答產(chǎn)生和極化的基礎(chǔ)。DC上廣泛表達(dá)的模式識(shí)別受體(如Toll樣受體、NOD樣受體以及C型凝集素受體等)是寄生蟲與宿主相互作用的重要靶點(diǎn)。旋毛蟲感染宿主后,宿主DC細(xì)胞受到抗原的刺激分化為成熟樹突狀細(xì)胞,誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)將其清除。為了逃避宿主的免疫清除,旋毛蟲通過ES抗原與DC上的多種模式識(shí)別受體相互作用,影響DC表面共刺激分子或相關(guān)蛋白的表達(dá),抑制部分DC成熟或完全成熟,阻止宿主初始T淋巴細(xì)胞正常增殖分化及誘導(dǎo)輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)極化,為自己能夠長(zhǎng)期感染宿主創(chuàng)造有利條件[22]。Jin X等[23]為了研究NOD樣受體蛋白3(NLRP3)在旋毛蟲感染觸發(fā)的免疫反應(yīng)中的作用,用旋毛蟲肌幼蟲代謝分泌抗原(ML-ES)處理野生型(WT)小鼠和NLRP3基因敲除小鼠,檢測(cè)、評(píng)估相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo),研究結(jié)果證明ML-ES可以通過NLRP3調(diào)節(jié)DC表型,使表面CD40表達(dá)水平增加,并增強(qiáng)宿主Th2和Treg 反應(yīng)。Gruden-Movsesijan A等[24]用旋毛蟲ML-ES處理大鼠骨髓來源的 DC(BMDC)和DA大鼠,并用ELISA和流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)檢測(cè)DC表面共刺激分子及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平,結(jié)果表明ML-ES刺激的大鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(DC)不完全成熟,并在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)Th2反應(yīng)。

2.3 調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型 巨噬細(xì)胞(Macrophages,Mφ)是組織中單核吞噬細(xì)胞的主要群體,屬于先天性細(xì)胞,它可以破壞病原體、清除凋亡細(xì)胞體并調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)[25]。根據(jù)活化狀態(tài)不同通常將Mφ分為兩類:經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(M1)和交替活化巨噬細(xì)胞(M2)[26]。其中M1型巨噬細(xì)胞具有促炎作用,能夠分泌高水平的TNF-α、IL-6及IL-1β等促炎細(xì)胞因子,參與抗原呈遞,介導(dǎo)Th1免疫應(yīng)答,在抗病毒、抗菌和抗寄生蟲反應(yīng)中非常重要[27]。相反,M2型巨噬細(xì)胞具有抑炎作用,可以被IL-4、IL-13、IL-10以及TGF-β誘導(dǎo)并表達(dá)豐富的甘露糖受體(CD206)、IL-1受體拮抗劑(IL1Ra)和精氨酸酶-1(arginase 1,Arg1),能限制過度炎癥,抑制Th1反應(yīng),有利于傷口愈合和組織修復(fù)[28]。

旋毛蟲感染宿主后在其體內(nèi)發(fā)育并移行,從消化道進(jìn)入淋巴系統(tǒng),最后隨血液遷移至肌肉組織,整個(gè)移行過程造成了機(jī)體嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和組織損傷,此時(shí)宿主巨噬細(xì)胞分化為M1型,M1型巨噬細(xì)胞分泌大量促炎因子,介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Th1免疫反應(yīng),以達(dá)到清除旋毛蟲的目的。旋毛蟲為了保護(hù)自身不被宿主清除,各階段幼蟲通過ES抗原作用于Mφ,控制Mφ分化。在腸道感染階段,AW進(jìn)入腸道上皮產(chǎn)生NBL,此時(shí)M1型巨噬細(xì)胞能促進(jìn)AW幼蟲從腸道上皮組織排出,有利于旋毛蟲感染;在移行階段和形成包囊階段,旋毛蟲NBL和ML則抑制M1型巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生,促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá),調(diào)節(jié)Mφ表型向M2型極化,以抑制抗炎癥反應(yīng)和Th1型免疫應(yīng)答,促進(jìn)損傷組織的愈合,從而逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除。Sun Q等[29]用流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)旋毛蟲感染小鼠在不同感染階段的不同組織中巨噬細(xì)胞激活的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示,旋毛蟲感染在腸內(nèi)階段,巨噬細(xì)胞向M1表型極化,M1型巨噬細(xì)胞在這一時(shí)期的成蟲排出中發(fā)揮重要作用;但在NBL遷移和包囊形成階段,組織和免疫器官中的巨噬細(xì)胞以M2型被激活,其主要功能可能傾向于促進(jìn)組織修復(fù)和協(xié)助旋毛蟲免疫逃逸。Wu J等[30]用旋毛蟲幼蟲衍生的細(xì)胞外小泡(EV)與宿主相互作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)旋毛蟲幼蟲衍生的EVs表達(dá)的miR-1-3p和let-7-5p,可以促進(jìn)骨髓巨噬細(xì)胞向M2b型的極化。Kang SA等[31]用旋毛蟲ES抗原預(yù)處理骨髓源性巨噬細(xì)胞,并將其轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi),以制備小鼠疾病模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),旋毛蟲ES蛋白抑制M1型巨噬細(xì)胞(M1)中iNOS的表達(dá),誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化。

3 免疫隔離

當(dāng)寄生蟲寄生于宿主免疫系統(tǒng)相對(duì)隔離部位(如腦、眼、淋巴結(jié))或侵入宿主細(xì)胞內(nèi)(如紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞),使宿主不對(duì)寄生蟲產(chǎn)生免疫反應(yīng)的現(xiàn)象叫做免疫隔離。在包囊形成階段,旋毛蟲NBL遷移到宿主肌肉組織中,并侵入肌肉細(xì)胞內(nèi),NBL在肌肉細(xì)胞內(nèi)迅速生長(zhǎng)發(fā)育,整個(gè)過程導(dǎo)致宿主肌肉細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷,從而激活宿主衛(wèi)星細(xì)胞(成肌細(xì)胞)。宿主成肌細(xì)胞在正常生理狀態(tài)下會(huì)增殖和再分化為新的肌肉細(xì)胞,修復(fù)肌肉組織損傷和凋亡。而旋毛蟲感染能夠抑制這一過程,使成肌細(xì)胞增殖、分化相互融合或與蟲體侵入的肌肉細(xì)胞融合形成另一種細(xì)胞—保姆細(xì)胞(nurse cell,NC)[32]。幼蟲“隱藏”在NC內(nèi),成為肌期幼蟲,以逃避宿主的免疫清除[33]。此外,由于旋毛蟲入侵肌肉細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)宿主肌肉細(xì)胞自噬,宿主細(xì)胞可以通過自噬清除寄生蟲[34]。自噬是一種基本的代謝過程,通過溶酶體系統(tǒng)降解非必需或功能失調(diào)的細(xì)胞成分或外源微生物,以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和保護(hù)[35]。因此,在旋毛蟲ML期間,蟲體沒有完全處于靜息狀態(tài),而是不斷向包囊周圍釋放ES抗原。ES抗原不斷刺激宿主的免疫系統(tǒng)與免疫活性以及細(xì)胞間的相互作用,上調(diào)或下調(diào)自噬相關(guān)因子,以逃避宿主的自噬清除,并為其在包囊內(nèi)長(zhǎng)期存活提供適宜的生存環(huán)境,實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主長(zhǎng)期的慢性感染 。郭琨等[36]以 C2C12 細(xì)胞系作為細(xì)胞模型,用不同濃度的旋毛蟲肌幼蟲粗提物(Trichinellaspiralismuscle larvae crude worm extract,TMCWE)刺激 C2C12 細(xì)胞,通過檢測(cè) C2C12 細(xì)胞增殖分化相關(guān)因子及信號(hào)通路,在體外評(píng)估 TMCWE 對(duì)小鼠成肌細(xì)胞增殖與分化的影響,結(jié)果顯示TMCWE能直接或通過激活PI3K/AKT/NF-κB 信號(hào)通路促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖和分化以及干擾 NC 的形成。Hu X等[37]為了探究ML-ES抗原對(duì)成肌細(xì)胞自噬的影響,體外培養(yǎng)C2C12細(xì)胞建立成肌細(xì)胞模型,體內(nèi)用不同劑量的旋毛蟲感染BALB/c小鼠,電鏡觀察旋毛蟲感染小鼠膈肌自噬體的產(chǎn)生,采用qPCR和Western blotting等技術(shù)檢測(cè)體內(nèi)和體外自噬特異性標(biāo)志物表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示,旋毛蟲感染誘導(dǎo)宿主肌肉細(xì)胞自噬,而旋毛蟲ML-ES抗原則能夠抑制成肌細(xì)胞的自噬。

4 結(jié) 語

作為我國(guó)生豬屠宰必檢項(xiàng)目之一,旋毛蟲病嚴(yán)重危害生豬的生長(zhǎng)和發(fā)育,且很容易通過食物鏈進(jìn)入人類體內(nèi),嚴(yán)重威脅人類健康和我國(guó)生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè),而對(duì)于旋毛蟲免疫逃避機(jī)制的研究有利于阻斷旋毛蟲病的傳播及消滅旋毛蟲。因此,通過總結(jié)近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者的相關(guān)研究,本文從抗原變異、免疫調(diào)節(jié)和免疫隔離3個(gè)方面簡(jiǎn)述了旋毛蟲免疫逃避機(jī)制的研究進(jìn)展,其中對(duì)旋毛蟲各階段異性抗原及免疫調(diào)節(jié)作用的研究較多,而對(duì)于免疫隔離逃避機(jī)制的相關(guān)研究則較少。目前市場(chǎng)上還沒有針對(duì)旋毛蟲病的特效藥,對(duì)于旋毛蟲病的治療,一般選用阿苯達(dá)唑和甲苯咪唑,但這類藥物對(duì)NC中的旋毛蟲ML不起作用,因此研究影響旋毛蟲形成免疫隔離的關(guān)鍵因子,對(duì)阻止包囊的形成,以及治療旋毛蟲病新藥物的研制都起到促進(jìn)作用。

利益沖突：無