揚(yáng)子鱷源粘質(zhì)沙雷氏菌XCYZE株的分離鑒定及其致病性分析

朱 鵬,周永康,姜 紀(jì),李佳佳,易平四,章 松,張雪松,周奎厚,王應(yīng)超,石 涵,陳洪超,卜孝林,王雅婷,徐前明

粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)屬于變形菌門腸桿菌科沙雷氏菌屬,是沙雷氏菌屬中最常見(jiàn)的一種革蘭氏陰性菌,菌體較小、短桿狀、周生鞭毛,菌株在28 ℃下培養(yǎng)有玫瑰紅樣色素產(chǎn)生,菌落有粘性、呈中心顆粒狀、有惡臭氣味[1]。大量的臨床調(diào)查結(jié)果顯示,雖然粘質(zhì)沙雷氏菌表現(xiàn)出相對(duì)較低的毒力,但它會(huì)引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等疾病,例如腦膜炎[2]、尿路感染、肺炎、心內(nèi)膜炎和其他呼吸道疾病等,尤其是在嬰兒和免疫功能低下的患者中。此外,粘質(zhì)沙雷氏菌也會(huì)引起傷口和軟組織感染[3-4],發(fā)病率及死亡率高達(dá)39%～50%[5]。粘質(zhì)沙雷氏菌具有侵襲性,對(duì)許多常用抗菌藥具有耐藥性,現(xiàn)已成為醫(yī)院感染的重要條件性致病菌,近年來(lái)臨床分離率及耐藥性都有增加的趨勢(shì)[6]。該菌除了感染人,還可以感染多種動(dòng)物如白蟻[7]、山羊[8]、水貂[9]、牦牛[10]、中華鱟[11]、草金魚[12]、牙鲆[13]等。

揚(yáng)子鱷是中國(guó)特有的一種鱷類動(dòng)物,為國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物,也是世界上瀕危物種之一,主要分布在長(zhǎng)江中下游流域。由于生態(tài)環(huán)境的破壞,揚(yáng)子鱷種群數(shù)量急劇下降,近年來(lái)圍繞著揚(yáng)子鱷的生存環(huán)境、飼養(yǎng)方法、種群繁殖、人工孵化等方面報(bào)道較多,但對(duì)揚(yáng)子鱷的細(xì)菌性疾病報(bào)道還很空缺。顧永熙等[14]報(bào)道,上海野生動(dòng)物園在揚(yáng)子鱷越冬末期,發(fā)現(xiàn)3條死亡鱷魚、1條病重鱷魚,通過(guò)對(duì)其解剖及分離培養(yǎng),結(jié)果分離出3株沙雷氏菌,通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),證實(shí)了該菌具有致病性,推測(cè)沙雷氏菌是此次鱷魚死亡的可能原因。唐名艷[15]通過(guò)對(duì)揚(yáng)子鱷血液學(xué)及生化指標(biāo)檢測(cè)及卵源細(xì)菌的分離鑒定,發(fā)現(xiàn)鱷魚胚胎期便有多種細(xì)菌感染。

2022年9月下旬,安徽省宣城市揚(yáng)子鱷繁殖研究中心出現(xiàn)1條死亡幼鱷,幼鱷生前臨床表現(xiàn)為精神萎靡不振、食欲下降、四肢無(wú)力、活動(dòng)減少、行動(dòng)緩慢、頭部左右傾斜、眼神黯淡無(wú)光、腹部稍腫脹。剖檢見(jiàn)肝臟顯著腫大,伴有嚴(yán)重出血、膽囊腫大、腎臟明顯水腫、肺臟有多處膿性結(jié)節(jié)和壞死灶,壞死灶中央有膿汁和干酪樣物,腦組織有炎性滲出物。取腦組織病料分離培養(yǎng),獲得1株分離菌,經(jīng)鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌,可為臨床防治該病提供一定借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 主要用品 ExTaq酶、dNTP、蛋白酶K、DNA DL 2000 Marker購(gòu)自Takara公司;Blood DNA &Tissue kit購(gòu)自QIAGEN公司;標(biāo)準(zhǔn)革蘭氏染色液購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;普通肉湯培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、血瓊脂平板由本實(shí)驗(yàn)室提供;生理生化反應(yīng)管、藥敏片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;SPF昆明鼠購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn),編號(hào)為AHAUB2022014。

1.2 菌株來(lái)源 1株疑似粘質(zhì)沙雷氏菌分離菌由安徽省宣城市揚(yáng)子鱷繁殖研究中心的1條死亡幼鱷腦組織病料中分離培養(yǎng)獲得。

1.3 菌株的分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察 用接種環(huán)從幼鱷的腦內(nèi)壞死灶中挑取炎性滲出物病料,接種于血瓊脂平板,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,挑取疑似沙雷氏菌的菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基于28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)18 h,觀察菌落特征。挑取單個(gè)特征性菌落,按常規(guī)革蘭氏染色法染色,鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.4 分離菌株的生理生化試驗(yàn) 將分離并純化的典型單個(gè)菌落接種于普通瓊脂培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)18 h;在無(wú)菌條件下挑取培養(yǎng)的單菌落接種于各種生化鑒定管中,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察反應(yīng)變化,試驗(yàn)結(jié)果參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行比對(duì)。

1.5 分離菌株的16SrDNA基因序列的測(cè)定 取純化后的細(xì)菌培養(yǎng)液提取細(xì)菌DNA,細(xì)菌通用引物上下游序列分別為27-F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492-R: 5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′,選擇細(xì)菌通用引物及DNA模板進(jìn)行16SrDNA基因序列PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測(cè)后將PCR產(chǎn)物送至南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BLAST進(jìn)行比對(duì),利用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,進(jìn)行同源性分析。

1.6 致病性試驗(yàn) 選購(gòu)5～6周齡的昆明鼠進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。將分離菌進(jìn)行小鼠致病性試驗(yàn),分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組5只小鼠。實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射分離菌菌液0.2 mL(濃度:2×108CFU/mL),對(duì)照組小鼠腹腔注射0.2 mL普通肉湯培養(yǎng)基,將小鼠隔離飼養(yǎng),每8 h觀察1次,記錄臨床表現(xiàn)。

1.7 藥物敏感性試驗(yàn) 按常規(guī)法用藥敏片對(duì)分離菌做藥敏試驗(yàn)。選用的藥敏片有丁胺卡那、恩諾沙星、青霉素、阿莫西林、慶大霉素、氧氟沙星和頭孢噻肟共7種常用抗菌藥物。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌的菌落形態(tài)及特征 培養(yǎng)結(jié)果顯示,該菌株表面隆起、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊,為灰白色中等大小的菌落,菌落中央有紅色素(圖1)。由鏡檢結(jié)果可以看出菌株為革蘭氏陰性菌,短桿狀、大小均一,多為單個(gè)存在。見(jiàn)圖2。

圖1 沙雷氏菌XCYZE株的純培養(yǎng)菌落形態(tài)Fig.1 Morphology of pure cultured colonies of Serratia XCYZE strain

圖2 XCYZE菌株的革蘭氏染色結(jié)果 (1 000×) Fig.2 Gram stain results of Serratia XCYZE strain (1 000×)

2.2 分離菌株的生理生化試驗(yàn) 分離菌株XCYZE的生理生化特征如表1所示,可產(chǎn)生葡萄糖、甘露醇、乳糖、檸檬酸鹽和硫化氫等,對(duì)照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》,結(jié)果與粘質(zhì)沙雷氏菌相符。

表1 分離菌株XCYZE的主要生理生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Results of major physiological and biochemical indexes of the isolated Serratia XCYZE strain

2.3 PCR擴(kuò)增分離菌株16SrDNA序列結(jié)果 以分離菌株基因組DNA為模板,利用細(xì)菌16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到的條帶長(zhǎng)度約為1 500 bp基因片段(圖3)。

注:M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.XCYZE株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;2.空白對(duì)照。圖3 16S rDNA鑒定結(jié)果Fig.3 Identification results of 16S rDNA from the ioslated

2.4 目的菌株16SrDNA序列遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果 測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖4,測(cè)序完成后, 將目的菌株16SrDNA序列在NCBI中進(jìn)行BLAST檢索,結(jié)果顯示與Serratiamarcescensstrain GRD 1(GenBank登錄號(hào):JN806401.1)等粘質(zhì)沙雷氏菌的基因同源性達(dá)99.10%,同時(shí)用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5),將本試驗(yàn)從揚(yáng)子鱷幼鱷中分離得到的菌株命名為XCYZE,由進(jìn)化樹分析得知XCYZE株與粘質(zhì)沙雷氏菌GRD1株的親緣關(guān)系較近,與已報(bào)道的粘質(zhì)沙雷氏菌GRD1株(JN806401.1)在同一分支上(圖5),結(jié)合細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理生化結(jié)果,綜合鑒定分離菌株XCYZE為粘質(zhì)沙雷氏菌,因?yàn)镚RD1株分離自醫(yī)院的廢水,且與人源的粘質(zhì)沙雷氏菌有一定的關(guān)系。

圖4 目的菌株測(cè)序結(jié)果Fig.4 Sequencing results of the target strain

圖5 分離菌株XCYZE的16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of 16S rDNA of the isolated Serratia strain XCYZE

2.4 致病性分析 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠分別腹腔注射0.2 mL的分離菌菌液和肉湯培養(yǎng)基后,觀察臨床表現(xiàn):8 h后,實(shí)驗(yàn)組小鼠開始出現(xiàn)精神亢奮、局促不安、亂竄現(xiàn)象。對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好;16 h后,實(shí)驗(yàn)組小鼠被毛粗亂、食欲減少,精神沉郁。對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)和采食量均正常;36 h后,實(shí)驗(yàn)組小鼠全部死亡,對(duì)照組小鼠2周后健康狀態(tài)依然良好,未見(jiàn)任何異常。剖檢死亡小鼠,可見(jiàn)腹腔大量積液、腸道黏連水腫、肝臟顯著腫大、脾臟出血(圖6)。將肝、肺切面觸片并革蘭氏染色,腹腔積液接種于肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng),結(jié)果表明,死亡小鼠體內(nèi)分離菌確為與接種菌株相同的細(xì)菌。

注:A、B為攻毒小鼠腹腔解剖圖;C、D為攻毒小鼠肝臟圖;E、F為攻毒小鼠脾臟圖。圖6 小鼠感染沙雷氏菌XCYZE株的主要病理變化Fig.6 Main pathological changes of mice after infected with Serratia XCYZE strain

2.5 藥物敏感性分析結(jié)果 參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)分析:粘質(zhì)沙雷氏菌XCYZE株對(duì)恩諾沙星、丁胺卡那、氧氟沙星、頭孢噻肟高敏;對(duì)慶大霉素中敏;對(duì)青霉素、阿莫西林耐藥。見(jiàn)圖7。

圖7 XCYZE株沙雷氏菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Results of drug susceptibility testing of Serratia XCYZE strain

3 討 論

目前,關(guān)于沙雷氏菌的報(bào)道是極其有限的,人們對(duì)該菌的認(rèn)知僅停留在一般生物學(xué)特性上。粘質(zhì)沙雷氏菌最初被認(rèn)為是無(wú)害細(xì)菌,但隨著關(guān)于其致病性報(bào)道的增多,粘質(zhì)沙雷氏菌已被重新定義為重要的條件性致病菌[16]。在我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域,粘質(zhì)沙雷氏菌也多作為無(wú)害細(xì)菌被報(bào)道,如從養(yǎng)殖廢水中分離后作為處理高濁度廢水的細(xì)菌[17],從鱖魚腸道分離后作為產(chǎn)生靈紅菌素的細(xì)菌[18]。但在揚(yáng)子鱷這類瀕危珍稀爬行動(dòng)物中鮮有報(bào)道,關(guān)于該病原體是否對(duì)爬行動(dòng)物具有較強(qiáng)的致病力仍是未知的,有待于進(jìn)一步探討。

本研究從1起表現(xiàn)腦膜腦炎的揚(yáng)子鱷中成功分離培養(yǎng)出1株粘質(zhì)沙雷氏菌,通過(guò)一系列細(xì)菌學(xué)鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化樹分析得知該菌株與已報(bào)道的粘質(zhì)沙雷氏菌(JN806401.1)GRD1株同屬一支,且親緣關(guān)系較近,確定該菌株即為粘質(zhì)沙雷氏菌,因?yàn)樗蛛x的細(xì)菌與GRD1株接近,可能也存在感染人的風(fēng)險(xiǎn)。在致病性分析方面,利用所分離的粘質(zhì)沙雷氏菌接種SPF昆明鼠,在36 h后全部死亡,死亡率達(dá)到100%,且對(duì)肝臟、肺臟和脾臟造成嚴(yán)重?fù)p傷,腹腔大量積液、腸道黏連水腫、肝臟顯著腫大伴有出血特征、肺臟嚴(yán)重出血、脾臟腫大出血;并從感染死亡小鼠肝臟再次分離到致病性沙雷氏菌,從而證實(shí)此株粘質(zhì)沙雷氏菌XCYZE確為導(dǎo)致幼鱷死亡的高致病性病原菌。

粘質(zhì)沙雷氏菌易于存活,易形成生物膜,對(duì)環(huán)境和抗生素有較強(qiáng)的抵抗力,對(duì)多種常用抗菌藥具有耐藥性[6],有研究表明,醫(yī)院分離株較環(huán)境分離株耐藥性更強(qiáng)[19]。本研究測(cè)定了揚(yáng)子鱷源粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)7種抗生素的敏感性,結(jié)果顯示該菌對(duì)青霉素、阿莫西林等臨床常用抗生素產(chǎn)生耐藥,對(duì)恩諾沙星、丁胺卡那、氧氟沙星、頭孢噻肟等高度敏感,不同來(lái)源粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)不同藥物的敏感性差異,也間接表明了環(huán)境因素對(duì)菌株耐藥存在一定的影響[20],這為今后的揚(yáng)子鱷養(yǎng)殖管理、治療提供參考。同時(shí),粘質(zhì)沙雷氏菌作為一種有較高致病性的人獸共患病原菌,理應(yīng)受到相關(guān)部門更多重視。

利益沖突：無(wú)