缺氧誘導(dǎo)因子-1α調(diào)控骨形態(tài)發(fā)生蛋白9對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響

李 祥,丘志河,謝衛(wèi)勇,黃 剛,閔水平,王安森

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在骨髓中含量豐富,具有向骨、肌肉等組織多向分化的潛能,對目前骨組織工程研究具有重要價值[1-2]。MSCs成骨分化受多基因表達(dá)調(diào)控,骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是目前唯一可誘導(dǎo)異位成骨的細(xì)胞因子,其家族眾多成員中BMP9誘導(dǎo)能力較強[3],主要通過經(jīng)典BMPs-Smads信號通路及非經(jīng)典絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路調(diào)控MSCs成骨分化[4-5]。另有研究[6]報道,BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化可能存在微小RNA(miRNA)或其他基因共同參與影響,但具體調(diào)控機制尚未完全明確。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)可促進(jìn)低氧狀態(tài)下細(xì)胞持續(xù)分化,促進(jìn)血管新生[7]。過表達(dá)miR-155可能通過調(diào)控Smad/BMP信號通路或靶向抑制HIF-1α的表達(dá)來減弱BMP9誘導(dǎo)的小鼠MSCs C3H10T1/2成骨分化[8]。然而關(guān)于HIF-1α單獨對BMP9誘導(dǎo)小鼠MSCs C3H10T1/2成骨分化的影響機制尚未闡明。本研究旨在采用小鼠MSCs C3H10T1/2為細(xì)胞模型,探討HIF-1α對BMP9誘導(dǎo)小鼠MSCs C3H10T1/2成骨分化的影響機制,以期為全面闡明BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化具體機制提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和重組腺病毒來源小鼠MSCs C3H10T1/2細(xì)胞系購自美國菌種保藏中心,BMP9腺病毒(Ad-BMP9)、腺病毒對照液(Ad-GFP,GFP為綠色熒光標(biāo)記)及重組HIF-1α過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-HIF-1α)、空質(zhì)粒(pcDNA3.1-mRFP,mRFP為紅色熒光標(biāo)記)均由上?？吕咨锟萍加邢薰驹O(shè)計并構(gòu)建。

1.2 主要試劑及儀器DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司;茜素紅S染料購自Sigma公司;Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司;堿性磷酸酶(ALP)顯色試劑盒、ALP活性檢測試劑盒、蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒均購自上海碧云天有限公司;BMP9、HIF-1α、骨鈣素(OC)、骨橋蛋白(OPN)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、GAPDH單克隆抗體、羊抗鼠二抗均購自Abcam公司。Forma Steri-Cycle i160型二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher公司;MODEL550型酶標(biāo)儀購自Bio-Rad公司;IX75熒光顯微鏡購自奧林巴斯公司;JS-780型凝膠成像儀購自上海迪奧生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) C3H10T1/2細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后置于提前配置的含10% FBS、1%青鏈霉素DMEM培養(yǎng)基中,于37℃、5% 飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代用0.25%胰蛋白酶消化。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 取對數(shù)期生長C3H10T1/2細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,待細(xì)胞密度生長至70%左右時,分別加入Ad-BMP9、Ad-GFP腺病毒液、Ad-BMP9+pcDNA3.1-mRFP、Ad-BMP9+pcDNA3.1-HIF-1α,分別設(shè)為Ad-BMP9組(轉(zhuǎn)染BMP9過表達(dá)的腺病毒液)、Ad-GFP組(轉(zhuǎn)染腺病毒液)、pcDNA3.1-mRFP組(轉(zhuǎn)染Ad-BMP9+pcDNA3.1空載質(zhì)粒)和pcDNA3.1-HIF-1α組(轉(zhuǎn)染Ad-BMP9+HIF-1α過表達(dá)質(zhì)粒),另選取NC組(正常培養(yǎng)C3H10T1/2細(xì)胞),每組設(shè)置6個平行樣。pcDNA3.1-mRFP組及pcDNA3.1-HIF-1α組轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染法,具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。48 h后在Ad-BMP9組、Ad-GFP組觀察到綠色熒光,在pcDNA3.1-mRFP組和pcDNA3.1-HIF-1α組觀察到綠色和紅色熒光,進(jìn)行后續(xù)實驗操作。

1.3.3ALP活性檢測 取1.3.2中各組C3H10T1/2細(xì)胞,培養(yǎng)7 d后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗2次,4 ℃無水乙醇固定1 h,ALP染色液染色,避光孵育30 min后觀察結(jié)果。參照ALP活性測定試劑盒測定ALP活性。

1.3.4茜素紅S染色 取1.3.2中各組C3H10T1/2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染6 h后換液同時添加50 mg/L維生素C、10 mmol/L β-磷酸甘油,繼續(xù)培養(yǎng)14 d后棄去培養(yǎng)基,PBS洗3次,4 ℃ 0.05%戊二醛固定10 min,去離子水(ddH2O)洗3次,加入0.4%茜素紅S染色5 min,ddH2O終止染色并洗滌,顯微鏡下觀察結(jié)果。為了進(jìn)一步定量分析鈣化結(jié)節(jié),顯微鏡下拍照后,用PBS洗滌各組細(xì)胞2次,加入10%氯化十六烷基吡啶(采用10 mmol/L pH為7.0的磷酸鹽配制而成),室溫下孵育15 min,將溶解下的染料使用酶標(biāo)儀在570 nm處測量其吸光度(A)值。

1.3.5各組C3H10T1/2細(xì)胞中BMP9、HIF-1α、OC、OPN及Runx2蛋白表達(dá)檢測 取1.3.2中各組C3H10T1/2細(xì)胞,采用蛋白抽提試劑盒提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,置于-80 ℃冰箱保存待用。采用蛋白免疫印跡(WB)法檢測蛋白表達(dá)。取50 mg蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜、封閉、加入BMP9(1 ∶200)、HIF-1α(1 ∶500)、OC(1 ∶200)、OPN(1 ∶500)、Runx2(1 ∶500)、GAPDH(1 ∶500)一抗孵育,4 ℃過夜,加入羊抗鼠二抗孵育(1 ∶5 000),37 ℃ 1 h,顯像、曝光、拍照并分析結(jié)果。以靶蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值比值作為靶蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 5組C3H10T1/2細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況及ALP活性檢測鑒定轉(zhuǎn)染48 h后,與NC組比較,熒光顯微鏡下觀察到Ad-BMP9組、Ad-GFP組有大量綠色熒光出現(xiàn),說明Ad-BMP9和Ad-GFP轉(zhuǎn)染成功;pcDNA3.1-mRFP組和pcDNA3.1-HIF-1α組不僅有大量綠色熒光,還有大量紅色熒光出現(xiàn),提示Ad-BMP9與pcDNA3.1-HIF-1α或pcDNA3.1-mRFP均轉(zhuǎn)染成功;見圖1。ALP活性:NC組與Ad-GFP組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);Ad-BMP9組、pcDNA3.1-mRFP組、pcDNA3.1-HIF-1α組均較NC組、Ad-GFP組增加(P<0.05);Ad-BMP9組與pcDNA3.1-mRFP組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);pcDNA3.1-HIF-1α組較Ad-BMP9組、pcDNA3.1-mRFP組均增加(P<0.05);見表1。

圖1 熒光顯微鏡下5組C3H10T1/2細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況(×200) A.NC組;B.Ad-GFP組;C.Ad-BMP9組;D.pcDNA3.1-mRFP組;E.pcDNA3.1-HIF-1α組 圖2 茜素紅S染色檢測5組C3H10T1/2細(xì)胞中鈣化結(jié)節(jié)情況(×200) A.NC組;B.Ad-GFP組;C.Ad-BMP9組;D.pcDNA3.1-mRFP組;E.pcDNA3.1-HIF-1α組

表1 5組C3H10T1/2細(xì)胞ALP活性比較

2.2 5組C3H10T1/2細(xì)胞中鈣化結(jié)節(jié)情況比較茜素紅S染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NC組、Ad-GFP組比較,Ad-BMP9組鈣鹽沉積明顯增加;與Ad-BMP9組、pcDNA3.1-mRFP組比較,pcDNA3.1-HIF-1α組鈣鹽沉積明顯增加;見圖2。定量分析結(jié)果顯示,NC組、Ad-GFP組、Ad-BMP9組、pcDNA3.1-mRFP組、pcDNA3.1-HIF-1α組的A值分別為0.80～0.92(0.85±0.03)、0.81～0.94(0.87±0.05)、1.23～1.50(1.36±0.09)、1.22～1.56(1.38±0.11)、1.53～1.91(1.73±0.15);NC組與Ad-GFP組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);Ad-BMP9組、pcDNA3.1-mRFP組、pcDNA3.1-HIF-1α組均較NC組、Ad-GFP組增加(P<0.05);Ad-BMP9組與pcDNA3.1-mRFP組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);pcDNA3.1-HIF-1α組較Ad-BMP9組、pcDNA3.1-mRFP組均增加(P<0.05)。

2.3 5組C3H10T1/2細(xì)胞中BMP9及HIF-1α蛋白表達(dá)水平比較見圖3、表2。NC組與Ad-GFP組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);Ad-BMP9組、pcDNA3.1-mRFP組、pcDNA3.1-HIF-1α組均較NC組、Ad-GFP組增加(P<0.05);Ad-BMP9組與pcDNA3.1-mRFP組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);pcDNA3.1-HIF-1α組較Ad-BMP9組、pcDNA-3.1-mRFP組均增加(P<0.05)。

圖3 5組C3H10T1/2細(xì)胞中BMP9及HIF-1α WB圖 A:NC組;B:Ad-GFP組;C:Ad-BMP9組;D:pcDNA3.1-mRFP組;E:pcDNA3.1-HIF-1α組

表2 5組C3H10T1/2細(xì)胞BMP9及HIF-1α蛋白表達(dá)水平比較

2.4 5組C3H10T1/2細(xì)胞中OC、OPN蛋白表達(dá)水平比較見圖4、表3。 NC組與Ad-GFP組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);Ad-BMP9組、pcDNA3.1-mRFP組、pcDNA3.1-HIF-1α組均較NC組、Ad-GFP組增加(P<0.05);Ad-BMP9組與pcD-NA3.1-mRFP組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);pcDNA3.1-HIF-1α組較Ad-BMP9組、pcDNA3.1-mRFP組均增加(P<0.05)。

圖4 5組C3H10T1/2細(xì)胞中OC、OPN WB圖 A:NC組;B:Ad-GFP組;C:Ad-BMP9組;D:pcDNA3.1-mRFP組;E:pcDNA3.1-HIF-1α組

表3 5組C3H10T1/2細(xì)胞OC、OPN蛋白表達(dá)水平比較

2.5 5組C3H10T1/2細(xì)胞中Runx2蛋白表達(dá)水平比較見圖5、表4。NC組與Ad-GFP組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);Ad-BMP9組、pcDNA3.1-mRFP組、pcDNA3.1-HIF-1α組均較NC組、Ad-GFP組增加(P<0.05);Ad-BMP9組與pcDNA3.1-mRFP組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);pcDNA3.1-HIF-1α組較Ad-BMP9組、pcDNA3.1-mRFP組均增加(P<0.05)。

圖5 5組C3H10T1/2細(xì)胞中Runx2 WB圖 A:NC組;B:Ad-GFP組;C:Ad-BMP9組;D:pcDNA3.1-mRFP組;E:pcDNA3.1-HIF-1α組

表4 5組C3H10T1/2細(xì)胞中Runx2蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

3.1 BMP9對MSCs成骨分化的影響骨組織工程中核心問題為定向誘導(dǎo)MSCs等成骨分化。BMPs家族屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族,可與細(xì)胞表面骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體(BMPR)Ⅰ和BMPRⅡ受體結(jié)合,調(diào)控細(xì)胞分化,對誘導(dǎo)MSCs成骨分化調(diào)控起重要作用[9-10]。目前臨床較多使用BMP2、BMP7誘導(dǎo)MSCs成骨分化[11-12]。近來研究表明,BMP9促進(jìn)MSCs成骨分化作用更為強效。任格 等[13]報道,BMP9可促進(jìn)牙囊干細(xì)胞成骨分化。Zhu et al[14]報道,Wnt11可能通過增強BMP9誘導(dǎo)的BMPs-Smads和p38 MAPK信號以增強其在MSCs中誘導(dǎo)成骨分化潛能。本研究以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系C3H10T1/2細(xì)胞為載體,采用腺病毒包裝BMP9誘導(dǎo)其成骨分化,結(jié)果顯示,Ad-GFP組和Ad-BMP9組均出現(xiàn)大量綠色熒光,且BMP9蛋白表達(dá)水平Ad-BMP9組較Ad-GFP組均明顯增加;pcDNA3.1-mRFP組和pcDNA3.1-HIF-1α組均出現(xiàn)大量紅綠色熒光,且BMP9、HIF-1α蛋白表達(dá)水平pcDNA3.1-HIF-1α組均較pcDNA3.1-mRFP組明顯增加,提示Ad-BMP、Ad-BMP+pcDNA3.1-HIF-1α均轉(zhuǎn)染成功,可進(jìn)行后續(xù)實驗。與Ad-GFP組比較,Ad-BMP9組HIF-1α蛋白表達(dá)、ALP活性、鈣鹽沉積、A值均明顯增加,其中ALP活性是成骨早期標(biāo)志,提示BMP9可誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化。

3.2 HIF-1α對MSCs成骨分化的影響HIF-1α普遍存在于人和動物細(xì)胞中,在缺氧環(huán)境下可穩(wěn)定表達(dá),主要參與調(diào)節(jié)并維持低氧狀態(tài)下細(xì)胞新陳代謝、促進(jìn)肝細(xì)胞分化[15-16]。左新慧 等[17]報道,HIF-1α可參與骨髓MSCs成骨分化。李松濤 等[15]報道,缺氧條件下,干擾HIF-1α表達(dá)可通過促進(jìn)神經(jīng)纖毛蛋白1蛋白表達(dá),抑制小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞(RAW264.7)向成熟破骨細(xì)胞分化。Zhou et al[18]報道,HIF-1α是BMP2誘導(dǎo)MSCs軟骨分化、成骨分化和軟骨內(nèi)成骨的調(diào)節(jié)因子,HIF-1α和BMP2可協(xié)同促進(jìn)增殖軟骨細(xì)胞區(qū)擴張。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與pcDNA3.1-mRFP組比較,pcDNA3.1-HIF-1α組HIF-1α蛋白表達(dá)、ALP活性、鈣鹽沉積、A值均明顯增加,提示過表達(dá)HIF-1α可能協(xié)同BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化,與上述文獻(xiàn)結(jié)果一致,但本研究結(jié)果尚不能確定兩者協(xié)同作用的具體機制。

3.3 HIF-1α調(diào)控BMP9對MSCs Runx2表達(dá)的影響徐麗 等[19]報道,BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化過程中,鈣鹽沉積、OC、OPN蛋白表達(dá)顯著增加。陳曉婷 等[20]報道,骨化三醇可增強BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化,增加其鈣鹽沉積、OC、OPN蛋白表達(dá),與激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶B信號通路有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),BMP9過表達(dá)可提高OC、OPN蛋白表達(dá)水平;在過表達(dá)BMP9的基礎(chǔ)上過表達(dá)HIF-1α后,OC、OPN蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步增加,提示HIF-1α可協(xié)同BMP9促進(jìn)OC、OPN蛋白表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)成骨分化。OC是由成骨細(xì)胞合成分泌的一種維生素K依賴性鈣結(jié)合蛋白,大部分沉著于骨骼中;OPN是一種帶負(fù)電荷非膠原性骨基質(zhì)糖蛋白,可大量表達(dá)于骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等,在骨基質(zhì)和礦化物吸收過程中起重要作用;以上兩者均是中晚期成骨標(biāo)志蛋白[21]。綜合以上研究及本研究結(jié)果提示,HIF-1α可能通過促進(jìn)成骨分化標(biāo)記物OC、OPN蛋白表達(dá)促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞鈣鹽沉積及成骨分化。Runx2是介導(dǎo)成骨分化的重要轉(zhuǎn)錄因子,是BMP信號通路下游靶標(biāo)因子,對MSCs成骨細(xì)胞分化起重要作用[22]。Sun et al[23]報道,葡萄糖通過上調(diào)Sry相關(guān)組蛋白9(Sox9)和Runx2表達(dá)調(diào)節(jié)人軟骨終板干細(xì)胞組織特異性軟骨成骨分化。Ren et al[24]報道,鹿茸水提液通過刺激BMP-2/Smad1、5/Runx2信號通路,促進(jìn)骨髓MSCs增殖和成骨分化。本研究進(jìn)一步檢測Runx2蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),與Ad-GFP組比較,Ad-BMP9組Runx2蛋白表達(dá)水平明顯增加;與pcDNA3.1-mRFP組比較,pcDNA3.1-HIF-1α組Runx2蛋白表達(dá)水平明顯增加,與Ren et al[24]研究報道一致,提示HIF-1α可能通過促進(jìn)BMP9表達(dá)進(jìn)而上調(diào)其下游轉(zhuǎn)錄因子Runx2誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化,但尚不明確Smad通路在此過程中的作用。

綜上所述,HIF-1α可促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)MSCs C3H10T1/2成骨分化,可能與上調(diào)OC、OPN及其下游Runx2蛋白表達(dá)有關(guān),但該過程涉及具體通路尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。