兒童配方奶粉對(duì)小鼠骨骼發(fā)育影響的研究

楊麗,劉恬欣,方正峰,敖曉琳,韓國(guó)全,陳洪

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,四川 雅安,625014)

骨骼發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜且動(dòng)態(tài)的過(guò)程,其中涉及多種細(xì)胞和生長(zhǎng)因子[1]。而骨骼發(fā)育不良是一類(lèi)影響骨和軟骨組織組成與結(jié)構(gòu)的發(fā)育性疾病,會(huì)誘發(fā)骨質(zhì)疏松在內(nèi)的多種骨骼相關(guān)疾病,主要表現(xiàn)包括肢端畸形、身材矮小、關(guān)節(jié)松弛、骨密度異常等[2]。

腸道菌群被稱(chēng)為人體內(nèi)的“第二基因組”,維持人體與腸道微生物良好的共生關(guān)系,對(duì)人體健康至關(guān)重要[3]。近年來(lái),越來(lái)越多的研究已經(jīng)證明,腸道菌群可以調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育[4-6]。進(jìn)一步的研究表明,腸道菌群可以通過(guò)調(diào)節(jié)鈣的吸收和免疫系統(tǒng)來(lái)影響骨骼發(fā)育[7-8]。鈣是動(dòng)物體內(nèi)含量最多的礦物元素,對(duì)骨骼完整性和代謝平衡起著重要作用[9]。腸道菌群的代謝產(chǎn)物可直接促進(jìn)鈣吸收,也可增大腸上皮吸收面積,進(jìn)而促進(jìn)腸道鈣的吸收。免疫系統(tǒng)與骨骼系統(tǒng)之間的關(guān)系被稱(chēng)為“骨免疫學(xué)”,當(dāng)機(jī)體的免疫功能失調(diào)時(shí),可導(dǎo)致骨代謝異常。腸道菌群可以調(diào)節(jié)宿主免疫相關(guān)細(xì)胞因子,降低骨吸收標(biāo)志物和激活劑的水平,防止骨質(zhì)流失,且骨形成標(biāo)志物也顯著增加。

奶粉一般是以新鮮牛乳為主要原料,富含優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)、碳水化合物和多種礦物質(zhì)。每天喝適量的奶粉可以促進(jìn)兒童的生長(zhǎng)發(fā)育,補(bǔ)充鈣與維生素D。本試驗(yàn)2種奶粉含有不同量的膳食纖維及其他活性成分,這些成分可以改變腸道菌群的組成,進(jìn)而影響骨骼發(fā)育[10-11]。因此,本實(shí)驗(yàn)建立骨骼發(fā)育不良模型對(duì)比2種奶粉對(duì)骨骼發(fā)育的影響及其腸道菌群介導(dǎo)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

40只3周齡雌性ICR小鼠,購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(川)2020-030。實(shí)驗(yàn)飼料為美國(guó)AIN-93G標(biāo)準(zhǔn)飼料,購(gòu)于北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司。

奶粉1、奶粉2,市售。

地塞米松磷酸鈉注射液,辰欣藥業(yè)股份有限公司;小鼠Ⅰ型膠原N端前肽(type I procollagen N-terminal propeptide,PINP)試劑盒、小鼠堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)試劑盒、小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRACP)試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素-1β(interleukin 1,IL-1β)試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素-6(interleukin 6,IL-6)試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素-10(interleukin10,IL-10)試劑盒,江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司;鈣測(cè)試盒,南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光酶標(biāo)儀,賽默飛世爾科技公司;1176型小動(dòng)物Micro-CT掃描影像系統(tǒng),德國(guó)SkyScan公司;MiSeq PE300高通量測(cè)序平臺(tái),美國(guó)Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 奶粉的配方和營(yíng)養(yǎng)成分

奶粉1配料表:生牛乳、乳糖、全脂乳粉、脫脂乳粉、脫鹽乳清粉、濃縮乳清蛋白粉(WPC80)、低聚果糖、維生素K2、維生素B1(鹽酸硫胺素)、維生素B2(核黃素)、維生素B6(鹽酸吡哆醇)、維生素B12(氰鈷胺)、維生素C(L-抗壞血酸)、煙酸、葉酸、泛酸(D-泛酸鈣)、生物素(D-生物素)、膽堿(氯化膽堿)、?；撬?、左旋肉堿(L-肉堿)、二十二碳六烯酸油脂、花生四烯酸油脂、CaCO3、FeSO4、葡萄糖酸鋅、亞硒酸鈉、葉黃素、乳鐵蛋白、酵母β-葡聚糖(添加量20.0 mg/100 g)、水解蛋黃粉(添加量50.0 mg/100 g)、初乳堿性蛋白(添加量50.0 mg/100 g)、燕窩酸(添加量10.0 mg/100 g)、磷脂酰絲氨酸(添加量11.0 mg/100 g)、動(dòng)物雙歧桿菌Bb-12(添加量≥1.0×108CFU/100 g)。

奶粉2配料表:生牛乳、脫脂乳粉、脫鹽乳清粉、乳糖、植物油、低聚異麥芽糖、低聚半乳糖、低聚果糖、骨膠原蛋白肽、初乳堿性蛋白、酵母β-葡聚糖、水解蛋黃粉、N-乙酰神經(jīng)氨酸、二十二碳六烯酸、花生四烯酸、動(dòng)物雙歧桿菌Bb-12、乳酸菌粉(乳雙歧桿菌、短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌)、氯化膽堿、葉黃素、?；撬?、左旋肉堿、富硒酵母、L-抗壞血酸鈉、dl-α-醋酸生育酚、醋酸視黃酯、膽鈣化醇、D-泛酸鈣、鹽酸硫胺素、鹽酸叱哆醇、葉酸、氰鈷胺、核黃素、煙酰胺、D-生物素、維生素K2、MgSO4、FeSO4、ZnSO4、CaCO3。每100 g添加:骨膠原蛋白肽200 mg,初乳堿性蛋白100 mg,酵母β-葡聚糖100 mg,水解蛋黃粉50 mg,N-乙酰神經(jīng)氨酸10 mg,動(dòng)物雙歧桿菌Bb-12、乳雙歧桿菌、短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌均為1.0×108CFU。2種奶粉的營(yíng)養(yǎng)成分如表1。

1.3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并嚴(yán)格按照四川農(nóng)業(yè)大學(xué)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用規(guī)則》執(zhí)行。小鼠在溫度20～25 ℃、相對(duì)濕度50%～60%的環(huán)境下,給予12 h光照/12 h黑暗交替條件,自由飲食、飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組(CON)、地塞米松組(DEX)、地塞米松+奶粉1組(DEX+MP1)、地塞米松+奶粉2組(DEX+MP2),分組后繼續(xù)喂養(yǎng)8周。CON組和DEX組飼喂標(biāo)準(zhǔn)純化日糧,DEX+MP1組和DEX+MP2組飼喂定制純化日糧(日糧中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的奶粉)。模型組和處理組按照1 mg/kg的劑量肌肉注射地塞米松磷酸鈉注射液,注射量為100 μL,每周3次,建立骨骼發(fā)育不良模型,CON組肌肉注射等量的NaCl注射液。

表1 兩種奶粉的營(yíng)養(yǎng)成分表Table 1 Nutritional composition of two kinds of milk powder

1.3.3 體質(zhì)量及采食量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)每天記錄每組小鼠的采食量,根據(jù)次日的余糧算出每只小鼠的日均采食量。小鼠禁食12 h后測(cè)量體質(zhì)量,每周1次。

1.3.4 樣品采集

飼喂8周后,收集糞便于凍存管中,放入液氮,轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存待測(cè)。對(duì)小鼠注射戊巴比妥鈉(200 mg/kg BW)將其麻醉,摘眼球取血液樣品于管中,靜置1～2 h,4 ℃下3 000 r/min離心15 min,吸取上清液,放入-20 ℃冰箱待測(cè)。小鼠脫頸處死后解剖,取股骨、脛骨,剔除多余肌肉筋膜及結(jié)締組織后放于10%(體積分?jǐn)?shù))的甲醛固定液中待測(cè)。

1.3.5 股骨和脛骨的骨重、骨長(zhǎng)的測(cè)定

用電子天平對(duì)骨組織的骨重進(jìn)行測(cè)量;用游標(biāo)卡尺對(duì)骨組織的骨長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量。

1.3.6 骨微結(jié)構(gòu)的測(cè)定

取固定液中的股骨通過(guò)Micro-CT掃描影像系統(tǒng)進(jìn)行掃描,掃描股骨遠(yuǎn)端的骨小梁部分,分辨率為9 μm,計(jì)算骨密度(bone mineral density,BMD)、骨小梁數(shù)量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁分離度(trabecular separation,Tb.Sp)。

1.3.7 血清PINP、ALP、TRACP、鈣含量的測(cè)定

將收集的血清按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟測(cè)定PINP、ALP、TRACP、鈣的含量。

1.3.8 血清中炎癥因子含量的測(cè)定

將收集的血清按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟測(cè)定TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的含量。

1.3.9 16S rRNA高通量測(cè)序及微生物多樣性分析

將收集的糞便樣本,寄送至北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建和Illumina MiSeq測(cè)序。使用PowerSoilRDNA Isolation Kit 試劑盒提取糞便中的細(xì)菌總DNA。對(duì)16s RNA基因V3～V4區(qū)域片段進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序。使用Usearch軟件對(duì)Reads在97.0%的相似度水平下進(jìn)行聚類(lèi)、獲得操作分類(lèi)單元。進(jìn)一步采用α多樣性分析、β多樣性分析、物種組成及差異分析等方法獲得微生物相關(guān)信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 26進(jìn)行單因素方差分析,通過(guò)Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析,P<0.05表示顯著差異,采用Origin 9.1軟件繪圖,采用Hiplot進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析并做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶粉對(duì)小鼠生長(zhǎng)指數(shù)的影響

如圖1-a所示,小鼠飼養(yǎng)8周后,與CON組相比,DEX組小鼠體質(zhì)量下降;與DEX組相比,2種奶粉添加后體質(zhì)量有所增加。與CON組相比,DEX組采食量顯著降低;而添加奶粉1后采食量有所增加,并在添加奶粉2后達(dá)到顯著水平,表明注射地塞米松會(huì)導(dǎo)致小鼠采食量下降,進(jìn)而降低體質(zhì)量,而奶粉的添加改善了小鼠的采食量。

a-奶粉對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響;b-小鼠的日均采食量圖1 奶粉對(duì)小鼠生長(zhǎng)指數(shù)的影響Fig.1 Effect of milk powder on growth index of mice 注:同一指標(biāo),不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.2 奶粉對(duì)小鼠骨組織的影響

如圖2所示,與CON組相比,DEX組的骨長(zhǎng)、骨重顯著下降;與DEX組相比,2種奶粉添加后股骨骨長(zhǎng)和骨重有明顯改善,而脛骨骨組織無(wú)顯著變化,且2種奶粉之間沒(méi)有顯著差異。

2.3 奶粉對(duì)小鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響

BMD是評(píng)價(jià)骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度的重要指標(biāo),骨微結(jié)構(gòu)是骨小梁的三維構(gòu)筑及小梁間連接程度的統(tǒng)稱(chēng)。圖3反映了各組小鼠的骨微結(jié)構(gòu),與CON組相比,DEX組的BMD顯著下降,Tb.sp顯著增加。而與DEX組相比,2種奶粉添加后都顯著增加了BMD,并降低了Tb.sp,表明奶粉的添加可以改善骨微結(jié)構(gòu)。此外,DEX+MP1組的Tb.N顯著高于其他3組,表明奶粉1對(duì)骨微結(jié)構(gòu)的改善效果優(yōu)于奶粉2。

a-股骨骨長(zhǎng);b-股骨骨重;c-脛骨骨長(zhǎng);d-脛骨骨重圖2 奶粉對(duì)小鼠骨組織的影響Fig.2 Effect of milk powder on bone tissue of mice

a-BMD;b-Tb.N;c-Tb.sp;d-Tb.Th;e-CON組骨結(jié)構(gòu)照片;f-DEX組骨結(jié)構(gòu)照片;g-DEX+MP1組骨結(jié)構(gòu)照片;h-DEX+MP2組骨結(jié)構(gòu)照片圖3 奶粉對(duì)小鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effect of milk powder on bone microstructure of mice

2.4 奶粉對(duì)小鼠血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物及鈣含量的影響

骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物反映骨形成和骨吸收水平及其活躍程度,PINP和ALP屬于骨形成標(biāo)志物,TRACP屬于骨吸收標(biāo)志物。圖4-a～圖4-c反映了小鼠血清中骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的含量差異。與CON組相比,DEX組的PINP含量顯著增加,TRACP含量顯著下降。與DEX組相比,2種奶粉添加后都顯著增加了ALP和TRACP的含量,表明2種奶粉添加后促進(jìn)了骨形成和骨吸收標(biāo)志物的形成。此外,與DEX+MP1組相比,DEX+MP2組顯著增加了PINP和TRACP的含量。結(jié)果表明,2種奶粉添加后都會(huì)提高骨轉(zhuǎn)換速率,奶粉2的效果更顯著。與CON組相比,DEX組血清中鈣含量顯著降低;與DEX組相比,2種奶粉添加后血清中鈣的含量顯著增加(圖4-d),表明奶粉的添加促進(jìn)了血清中鈣的吸收,且2種奶粉之間沒(méi)有顯著差異。

a-PINP;b-ALP;c-TRACP;d-鈣含量圖4 奶粉對(duì)小鼠血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物及鈣含量的影響Fig.4 Effect of milk powder on serum bone turnover markers and calcium content in mice

2.5 奶粉對(duì)小鼠血清中炎癥因子的影響

炎癥因子參與機(jī)體的生理及病理過(guò)程,IL-1β、IL-6和TNF-α屬于促炎細(xì)胞因子,IL-10屬于抗炎細(xì)胞因子,促炎細(xì)胞因子會(huì)刺激骨吸收,還能加強(qiáng)其他細(xì)胞因子的作用。圖5反映了血清中炎癥因子的含量,與CON組相比,DEX組IL-1β、IL-6含量顯著增加,IL-10含量顯著降低;與DEX組相比,2種奶粉添加后降低了IL-1β的含量,增加了IL-10的含量,表明奶粉的添加通過(guò)降低促炎細(xì)胞因子水平和增加抗炎細(xì)胞因子水平來(lái)促進(jìn)骨骼發(fā)育。此外,與DEX+MP1組相比,DEX+MP2組降低了IL-6和IL-10的含量,表明奶粉1可能是通過(guò)增加抗炎細(xì)胞因子的含量促進(jìn)骨骼發(fā)育,奶粉2可能是通過(guò)降低促炎細(xì)胞因子的含量促進(jìn)骨骼發(fā)育。

2.6 奶粉對(duì)小鼠腸道菌群的影響

2.6.1 α多樣性分析

α多樣性反映單個(gè)樣品物種豐度及多樣性,ACE指數(shù)衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少,Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)衡量物種多樣性,受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響。結(jié)果如表2所示,與CON組相比,DEX組中的多樣性指數(shù)無(wú)顯著變化,表明地塞米松對(duì)α多樣性沒(méi)有顯著影響。與DEX組相比,2種奶粉添加后多樣性有所下降,表明奶粉的添加降低了由地塞米松引起的腸道菌群紊亂。此外,與DEX+MP1組相比,DEX+MP2組的多樣性顯著下降,表明奶粉2的添加降低了物種多樣性。

表2 奶粉對(duì)小鼠腸道菌群α多樣性的影響(n=6)

2.6.2 β多樣性分析

β多樣性反映各組小鼠腸道菌群組成的相似性或差異性。

a-TNF-a;b-IL-1β;c-IL-6;d-IL-10圖5 奶粉對(duì)小鼠血清炎癥因子含量的影響Fig.5 Effect of milk powder on serum inflammatory factors in mice

如圖6-a所示,各組出現(xiàn)明顯分離,與DEX組相比,DEX+MP1組和DEX+MP2組微生物群落向右偏移,表明2種奶粉的添加在一定程度上能改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)。與DEX+MP1組相比,DEX+MP2組與DEX組表現(xiàn)出更遠(yuǎn)的距離,表明奶粉2的添加會(huì)顯著改變腸道菌群的組成。非加權(quán)組平均法的結(jié)果也表明,不同樣本之間的物種組成存在較大差異(圖6-b)。

2.6.3 腸道微生物菌落組成分析

圖7-a為門(mén)水平上各組的物種組成分類(lèi)柱狀圖,其中Firmicutes和Bacteroidota是豐度最高的2個(gè)菌門(mén)。比較組間豐度變化發(fā)現(xiàn),與CON組相比,DEX組增加了Bacteroidota和Verrucomicrobiota的相對(duì)豐度;與DEX組相比,2種奶粉添加后增加了Firmicutes和Verrucomicrobiota的相對(duì)豐度,降低了Bacteroidota的相對(duì)豐度。此外,奶粉2的添加顯著增加了Firmicutes的相對(duì)豐度,降低了Bacteroidota的相對(duì)豐度。在屬水平上,如圖7-b所示,與CON組相比,DEX組中Lactobacillus和Bacteroides的相對(duì)豐度增加,unclassified_Desulfovibrionaceae的相對(duì)豐度降低。與DEX組比較,DEX+MP1組Akkermansia和Alloprevotella的相對(duì)豐度增加,Lactobacillus、unclassified_Muribaculaceae和Alistipes的相對(duì)豐度降低;DEX+MP2組Lactobacillus和Lachnoclostridium的相對(duì)豐度增加,unclassified_Muribaculaceae和Alistipes的相對(duì)豐度降低。進(jìn)行LEfSe分析確定了各組間的差異物種(圖7-c和圖7-d)。在屬水平上,奶粉1處理增加了f__Prevotellaceae,s__Prevotella_sp__canine_oral_taxon_226,g__Alloprevotella的豐度。奶粉2處理增加了g__Lachnoclostridium的豐度。

a-主坐標(biāo)分析;b-非加權(quán)組平均法圖6 奶粉對(duì)小鼠腸道菌群β多樣性的影響Fig.6 Effect of milk powder on β diversity of intestinal flora in mice

a-門(mén)水平腸道菌群結(jié)構(gòu);b-屬水平腸道菌群結(jié)構(gòu);c-組間差異物種LDA值分布柱狀圖;d-組間差異物種進(jìn)化分支圖圖7 各組小鼠腸道微生物菌群組成及差異物種分析Fig.7 Composition of intestinal microflora and analysis of different species of mice in each group

2.7 骨相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)與腸道菌群相關(guān)性分析

為了尋找骨相關(guān)指標(biāo)與腸道菌群之間可能存在的聯(lián)系,我們進(jìn)行了皮爾遜相關(guān)性分析(圖8)。結(jié)果表明,在屬水平上,并不是所有的生物學(xué)變化都與微生物群落的變化相關(guān)。在血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物方面,血清PINP與Alistipes呈負(fù)相關(guān);血清ALP與unclassified_Muribaculaceae、Muribaculum和Alistipes呈負(fù)相關(guān);血清TRACP與unclassified_Muribaculaceae和Alistipes呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果說(shuō)明血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物與不同腸道菌群之間存在相關(guān)性,腸道菌群可能參與調(diào)控骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物水平。

3 討論

骨骼發(fā)育不良,也稱(chēng)為骨軟骨發(fā)育不良,其特征是骨骼嚴(yán)重受累,伴有軟骨和骨骼生長(zhǎng)異常,導(dǎo)致骨長(zhǎng)度、骨形狀或骨密度異常[12-13]。研究表明[14-15],長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)流失,在糖皮質(zhì)激素的長(zhǎng)期作用下,成骨和破骨細(xì)胞凋亡增加,骨轉(zhuǎn)換下降,骨密度降低,骨骼生長(zhǎng)受到抑制。而地塞米松作為糖皮質(zhì)激素的一種,可以使生長(zhǎng)板靜止帶和肥大帶軟骨細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)增強(qiáng),抑制骨骼縱向生長(zhǎng),進(jìn)而我們使用地塞米松對(duì)小鼠構(gòu)建骨骼發(fā)育不良模型[16]。本實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)地塞米松刺激致使小鼠產(chǎn)生骨骼發(fā)育不良反應(yīng),導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量和采食量下降。2種奶粉添加后,體質(zhì)量和采食量均有所增加,這可能與奶粉本身的性質(zhì)與所含能量有關(guān)。2種奶粉的添加使股骨組織和骨微結(jié)構(gòu)得到改善,表明2種奶粉的添加緩解了地塞米松對(duì)小鼠骨骼生長(zhǎng)的抑制,這與張會(huì)豐等[15]的研究結(jié)果類(lèi)似。此外,奶粉1對(duì)骨微結(jié)構(gòu)的改善效果優(yōu)于奶粉2,可能與奶粉1中所含二十二碳六烯酸含量有關(guān)。二十二碳六烯酸屬于n-3多不飽和脂肪酸,研究表明長(zhǎng)期補(bǔ)充n-3脂肪酸對(duì)骨微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生有利影響[17]。另有研究表明攝入較多的n-3脂肪酸與較高的股骨密度之間存在關(guān)聯(lián)[18]。

圖8 骨相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)與腸道菌群相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis between bone-related biological indicators and intestinal flora

此外,我們進(jìn)一步分析了血清骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)。ALP可以比較確切地反映骨形成功能狀態(tài),其含量升高說(shuō)明骨形成增加[19],TRACP主要來(lái)源于破骨細(xì)胞,且被認(rèn)為直接參與破骨細(xì)胞的骨吸收過(guò)程,與其他酶一起參加骨基質(zhì)中固體鈣磷礦化物的降解[20]。在本研究中,2種奶粉添加后顯著提高骨轉(zhuǎn)換速率,進(jìn)而改善小鼠的骨骼發(fā)育情況。而地塞米松處理后的小鼠骨形成標(biāo)志物增加,可能是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞參與骨重建,使骨轉(zhuǎn)換率升高。皮爾遜相關(guān)性分析的結(jié)果表明,Alistipes和unclassified_Muribaculaceae與血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,表明這2種菌可能參與調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育。研究表明[21-22],溫暖暴露能防止骨質(zhì)流失,而溫暖暴露后Muribaculaceae在屬水平上明顯減少;飼糧中添加魔芋低聚糖對(duì)骨骼健康有益,而Alistipes的相對(duì)豐度卻降低,這些研究表明這2種菌可能會(huì)抑制骨骼發(fā)育。血清中的鈣與骨骼中的鈣保持動(dòng)態(tài)平衡,血鈣含量的測(cè)定能反映出骨組織的代謝情況[23]。有研究表明地塞米松能夠抑制腸道對(duì)鈣的吸收[24]。2種奶粉添加后血清中鈣的含量顯著增加,表明奶粉可以通過(guò)增加腸鈣的吸收,從而升高血鈣水平,有助于新骨形成。

低濃度炎癥環(huán)境能夠激發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)和多細(xì)胞因子的聚集,調(diào)控?fù)p傷附近的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,促進(jìn)骨組織的再生修復(fù)[25]。而隨著炎癥反應(yīng)的加劇和持續(xù),間充質(zhì)干細(xì)胞的活性及成骨分化能力受到抑制[26]。而抗炎細(xì)胞因子對(duì)破骨細(xì)胞生成的有抑制作用,對(duì)成骨細(xì)胞分化有促進(jìn)作用。在本研究中,奶粉1顯著增加了抗炎細(xì)胞因子含量,奶粉2顯著降低了促炎細(xì)胞因子含量。這可能是由于奶粉1中添加了磷脂酰絲氨酸和動(dòng)物雙歧桿菌Bb-12,奶粉2中添加了乳酸菌粉。有研究表明[27-28],磷脂酰絲氨酸和動(dòng)物雙歧桿菌作用于機(jī)體,可使機(jī)體中IL-10含量增加。左玲玲[29]的研究表明,乳酸菌發(fā)酵的食物能夠有效地降低機(jī)體的IL-6等促炎細(xì)胞因子含量。表明這2種奶粉可以通過(guò)增加抗炎細(xì)胞因子水平,降低促炎細(xì)胞因子水平來(lái)調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育。

近年來(lái),腸道菌群與人類(lèi)健康和疾病的密切關(guān)系受到越來(lái)越多的關(guān)注,有研究表明腸道菌群可以促進(jìn)正常骨骼健康和抑制骨質(zhì)流失[22]。文章分析了各組小鼠糞便中的腸道菌群,主坐標(biāo)分析和非加權(quán)組平均法結(jié)果顯示,4組微生物群落出現(xiàn)明顯分離。2種奶粉添加后都降低了由地塞米松引起的腸道菌群紊亂而導(dǎo)致的多樣性增加,改變了群落組成。這與楊茜等[30]的研究結(jié)果類(lèi)似,地塞米松的添加會(huì)使小鼠的腸道菌群紊亂,且地塞米松作為碳源和能源促進(jìn)部分腸道菌群的代謝。此外,奶粉2的添加顯著改變了物種多樣性,這可能與奶粉2中的膳食纖維含量有關(guān)。SO等[10]的研究結(jié)果表明低聚果糖和低聚半乳糖可有效增加雙歧桿菌和乳酸桿菌的豐度,抑制有害細(xì)菌增殖,但對(duì)α多樣性沒(méi)有明顯影響。PATEL等[11]的研究結(jié)果表明低聚異麥芽糖可以促進(jìn)雙歧桿菌等的增殖。

Firmicutes和Bacteroidota作為腸道菌群的兩大優(yōu)勢(shì)菌門(mén),其平衡在宿主生理活動(dòng)中起重要作用[31]。有研究表明[32-33],BMD與Firmicutes的比例呈正相關(guān),與Bacteroidota的比例呈負(fù)相關(guān)。在本研究中,從門(mén)水平來(lái)看,2種奶粉添加后Firmicutes的比例增加,Bacteroidota的比例降低,這與WANG等[34]的研究結(jié)果類(lèi)似。此外,奶粉1添加后增加了Verrucomicrobiota的比例,Verrucomicrobiota是一種有益細(xì)菌,廣泛分布于健康的人體腸道中,可以控制炎癥[35]。從屬水平來(lái)看,奶粉1添加后增加了Akkermansia和Alloprevotella的相對(duì)豐度,降低了unclassified_Muribaculaceae的相對(duì)豐度,這與CHEVALIER等[22]的研究結(jié)果一致。LIU等[36]的研究表明,Akkermansia可能含有一些促成骨和抗破骨功能的分子,對(duì)骨骼健康產(chǎn)生有益作用。WANG等[37]的研究結(jié)果表明,Prevotella可改善破骨細(xì)胞的骨吸收,防止骨丟失,促進(jìn)骨骼發(fā)育。奶粉2添加后增加了Lactobacillus和Lachnoclostridium的相對(duì)豐度。研究表明[38],Lactobacillusreuteri是一種具有抗炎和骨骼健康特性的益生菌,添加L.reuteri可防止成骨細(xì)胞成熟標(biāo)志物的抑制。Lachnoclostridium被發(fā)現(xiàn)是一種可以將乳酸發(fā)酵為短鏈脂肪酸的菌株[39],進(jìn)而通過(guò)降低腸道pH值、增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化能力和誘導(dǎo)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的產(chǎn)生來(lái)調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育[40-41]。

4 結(jié)論

本研究中2種奶粉都能調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育,但調(diào)控機(jī)制存在差異。奶粉1主要通過(guò)改善骨微結(jié)構(gòu),增加抗炎細(xì)胞因子的含量,而奶粉2主要通過(guò)提高血清骨轉(zhuǎn)換速率,降低促炎細(xì)胞因子的含量,不同的調(diào)節(jié)機(jī)制可能與奶粉的配方不同有關(guān)。在調(diào)節(jié)腸道菌群方面,奶粉1上調(diào)了Akkermansia和Alloprevotella的相對(duì)豐度,而奶粉2上調(diào)了Lactobacillus和Lachnoclostridium的相對(duì)豐度,這些差異可能與不同奶粉配方的獨(dú)特組成有關(guān)。2種奶粉比較而言,奶粉1能直接促進(jìn)骨組織和改善骨微結(jié)構(gòu),具有更直接促進(jìn)骨骼發(fā)育的效果。