2株有效抑制劍麻斑馬紋病菌的生防細(xì)菌鑒定

侯會(huì)霞 鄭肖蘭 易克賢 習(xí)金根 李慧 吳偉懷 陳河龍

關(guān)鍵詞：劍麻斑馬紋??；煙草疫霉菌；生防菌；促生特性

劍麻（Agavespp.）又名菠蘿麻、龍舌蘭麻，為龍舌蘭科（Agavaceae）龍舌蘭屬（Agave）植物[1]。劍麻中的硬質(zhì)纖維具有耐磨、耐鹽堿、耐腐蝕等特性，廣泛運(yùn)用于運(yùn)輸、漁業(yè)、化工、國(guó)防等重要行業(yè)[2-4]，劍麻的麻渣還可用于提煉制藥和制作有機(jī)肥[5-7]，同時(shí)劍麻也是一種園林觀賞植物[8]。中國(guó)是世界劍麻主要生產(chǎn)國(guó)之一，主要種植于廣東、廣西、福建、海南等?。▍^(qū)）[9]。1963年我國(guó)從坦桑尼亞引入主栽品種——雜交劍麻H.11648（AgavehybridH.11648），該品種具有高產(chǎn)的特點(diǎn)，但極易感染斑馬紋病[10-11]。

劍麻斑馬紋病是一種嚴(yán)重的土傳病害，其病原菌為煙草疫霉（Phytophthoranicotianae），該菌能侵染劍麻植株地上部分，表現(xiàn)出葉斑、莖腐和軸腐的癥狀[12-13]。此外，煙草疫霉生存能力極強(qiáng)，在土壤中能存活數(shù)年至數(shù)十年，給劍麻生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失[14-15]。目前對(duì)于該病害的防控主要采取以農(nóng)業(yè)栽培措施為主，抗病育種和化學(xué)藥劑防治相結(jié)合的綜合防治措施[16-17]，但運(yùn)用以菌治菌的生物防治措施卻鮮有報(bào)道。因此，本研究以劍麻斑馬紋病為靶標(biāo)，篩選具有較強(qiáng)生防作用的生防菌，評(píng)價(jià)其防治效果，以期為劍麻斑馬紋病和以煙草疫霉引起的植物病害的生物防治及作物綠色生產(chǎn)提供生防菌源和相應(yīng)防控技術(shù)。

1材料與方法

1.1材料

供試生防菌株：PpHyHNCJ2和PpHyHNCJ5分離自海南省昌江黎族自治縣火龍果病莖。

供試病原菌：劍麻斑馬紋病病原菌煙草疫霉菌保存于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所。

抑菌譜病原菌：辣椒疫霉菌（Phytophthoracapsica）P1，寄主為辣椒，由本實(shí)驗(yàn)室保存；黑曲霉菌（Aspergillusniger）由本實(shí)驗(yàn)室保存；辣椒疫霉菌（P.capsica）P2，寄主為胡椒，由海南省萬(wàn)寧市興隆熱帶植物園高圣風(fēng)贈(zèng)送；大豆疫霉菌（P.sojae）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王源超贈(zèng)送；瓜疫霉菌（P.melonis）、棕櫚疫霉菌（P.palmivora）和豇豆疫霉菌（P.vignae）由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院陳慶河贈(zèng)送；尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）由海南省三亞市熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院孔祥義贈(zèng)送；暹羅刺盤孢菌（Colletotrichumsiamense）、可可毛色二孢菌（Lasiodiplodiatheobromae）和霍爾木茲毛球二孢菌（L.hormozganensis）由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所熱帶果樹(shù)病害研究組胡美姣贈(zèng)送。

1.2方法

1.2.1生防菌的獲得于2021年7月在海南省進(jìn)行劍麻、火龍果和橡膠樹(shù)等作物病害調(diào)查，并采用組織分離培養(yǎng)法進(jìn)行生防菌的分離[18]，獲得生防菌株P(guān)pHyHNCJ2和PpHyHNCJ5。

1.2.2生防菌株的篩選采用五點(diǎn)對(duì)峙法[19]進(jìn)行生防菌的篩選，用“十”字交叉法在PDA平板背面做好標(biāo)記，在中心位置接種倒置的直徑約為5mm的劍麻斑馬紋病煙草疫霉菌餅，距菌餅為中心20mm處十字線上的4點(diǎn)接種生防菌，以只在中心位置接病原菌為對(duì)照（CK），每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。于28℃培養(yǎng)5～10d，對(duì)照長(zhǎng)滿整個(gè)平板時(shí)，測(cè)量菌落直徑（cm），計(jì)算抑制率[20]。

1.2.3生防菌株的鑒定（1）形態(tài)學(xué)觀察。采用革蘭氏染色法[21]觀察，紅色為革蘭氏陰性菌，紫色為革蘭氏陽(yáng)性菌。將生防菌株活化后稀釋涂布于LB平板上，于28℃培養(yǎng)18～24h，長(zhǎng)出單個(gè)菌落后，觀察菌落特征，包括其形狀、菌落顏色、透明度、光滑度及是否產(chǎn)生芽孢等。

（2）生理生化指標(biāo)測(cè)定。參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[21]的方法，對(duì)生防菌株P(guān)pHyHNCJ2和PpHyHNCJ5的部分特性進(jìn)行鑒定，包括氧化酶試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、需氧性試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、糖類發(fā)酵試驗(yàn)、醇類發(fā)酵試驗(yàn)和硝酸鹽還原試驗(yàn)。耐鹽性試驗(yàn)分別在含2%、5%、7%和10%NaCl（m/V）的LB液體培養(yǎng)基中加入生防菌菌液，對(duì)其耐鹽性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

（3）分子生物學(xué)鑒定。將生防細(xì)菌單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中于28℃、180r/min培養(yǎng)12h，離心收集菌體，用OMEGA細(xì)菌DNA提取試劑盒進(jìn)行生防細(xì)菌DNA的提取。所用引物為細(xì)菌鑒定通用引物16SrDNA（27F：5?AGAGTTTGATCCTGGCTCAG?3，1492R：5?GGTTACCTTGTTACGACTT?3）[22]，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4min；94℃變性40s，55℃退火45s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送華大基因測(cè)序有限公司進(jìn)行測(cè)序。所得的堿基經(jīng)DNAman軟件拼接后于NCBI網(wǎng)站上（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cg）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast比對(duì)，獲得同源序列。用MEGA11軟件通過(guò)Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定菌株的分類地位。

1.2.4生防菌抑菌譜測(cè)定參照1.2.2中的五點(diǎn)對(duì)峙法，分別測(cè)定生防菌株P(guān)pHyHNCJ2和PpHyHNCJ5對(duì)11種供試病原菌的抑制作用，觀察并記錄抑菌效果。

1.2.5生防菌促生功能測(cè)定參考張昊鑫等[23]的方法進(jìn)行Salkowski比色液的配制，采用Salkowski比色法[24]測(cè)定菌株分泌吲哚乙酸（IAA）的能力。參考張文韜等[25]的方法進(jìn)行解磷能力測(cè)定。解鉀能力測(cè)定：采用點(diǎn)接法將生防菌接種于解鉀培養(yǎng)基平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，菌落周圍有透明油滴狀暈圈表示該菌株具有解鉀能力。參考李章雷等[26]的方法進(jìn)行固氮能力測(cè)定。參考彭云等[27]的方法進(jìn)行產(chǎn)鐵能力測(cè)定。

1.3數(shù)據(jù)處理

利用Excel2019和IBMSPSS22.0軟件進(jìn)行圖表制作和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)；分子生物學(xué)鑒定使用DNAman軟件進(jìn)行序列拼接，用MEGA11軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1生防菌株的分離、活化與篩選

通過(guò)分離、篩選獲得生防菌PpHyHNCJ2和PpHyHNCJ5，菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為85.92%、83.10%（圖1）。通過(guò)觀察煙草疫霉菌菌絲顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，PpHyHNCJ2和PpHyHNCJ5均抑制了煙草疫霉菌菌絲的生長(zhǎng)，生防菌對(duì)峙的煙草疫霉菌出現(xiàn)菌絲體分支畸形（圖2b）、膨大增粗（圖2c）、纏繞（圖2d）等現(xiàn)象，而對(duì)照菌絲表面光滑、粗細(xì)均勻、生長(zhǎng)正常（圖2a）。

2.2生防菌株的鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué)特征菌株P(guān)pHyHNCJ2和PpHyHNCJ5在LB培養(yǎng)基平板上均能生長(zhǎng)良好（圖3A），菌體均呈乳白色，不透明，邊緣不整齊，表面較光滑（圖3B）。革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，革蘭氏染色均呈陽(yáng)性，菌體細(xì)胞呈桿狀，有芽孢（圖3C）。

2.2.2生理生化鑒定生理生化測(cè)試結(jié)果顯示，菌株P(guān)pHyHNCJ2和PpHyHNCJ5為厭氧型菌株。在接觸酶、乙酰甲基甲醇測(cè)定、淀粉水解、硝酸鹽還原、明膠液化測(cè)試中均呈陽(yáng)性，在氧化酶、甲基紅測(cè)定中均呈陰性。且可以利用葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇產(chǎn)酸，但不能利用山梨醇產(chǎn)酸；能利用葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇產(chǎn)氣，但不能利用果糖產(chǎn)氣。在NaCl濃度為2%～7%時(shí)均可生長(zhǎng)，在10%NaCl中不能生長(zhǎng)（表1）。

2.2.3分子生物學(xué)鑒定將測(cè)序結(jié)果通過(guò)DNAman軟件拼接后，得到菌株P(guān)pHyHNCJ2和PpHyHNCJ5的16SrDNA有效序列長(zhǎng)度分別為1460bp和1357bp。將得到的序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行blast序列比對(duì)，結(jié)果顯示，菌株P(guān)pHyHNCJ2、PpHyHNCJ5與多粘類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa）相似性分別為99.72%和99.78%。將序列通過(guò)MEGA11軟件，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示，菌株P(guān)pHyHNCJ2和PpHyHNCJ5的16SrDNA序列與多粘類芽孢桿菌（P.polymyxa）聚為一支（圖4），結(jié)合生防菌形態(tài)特征、生理生化特征、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)綜合分析，菌株P(guān)pHyHNCJ2和PpHyHNCJ5鑒定為多粘類芽孢桿菌（P.polymyxa）。

2.3生防菌抑菌譜測(cè)定

抑菌譜分析結(jié)果顯示，PpHyHNCJ2和PpHyHNCJ5對(duì)11種病原菌均具有較好的抑制效果（圖5），菌絲生長(zhǎng)抑制率均在61.03%以上。PpHyHNCJ2和PpHyHNCJ5對(duì)不同病原菌的抑制率存在顯著差異，對(duì)大豆疫霉菌的抑制率分別為88.26%、93.89%。菌株P(guān)pHyHNCJ2對(duì)黑曲霉菌和可可毛色二孢菌的抑制率較低，均為62.44%；菌株P(guān)pHyHNCJ5對(duì)可可毛色二孢菌抑菌率較差，僅為61.03%（表2）。

2.4生防菌促生特性分析

生防菌促生特性結(jié)果分析表明，生防菌PpHyHNCJ2和PpHyHNCJ5均不具有產(chǎn)植物激素IAA的能力（圖6A）。在解有機(jī)磷培養(yǎng)基和解無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基上，PpHyHNCJ2和PpHyHNCJ5菌落周圍均出現(xiàn)透明暈圈（圖6B，圖6C），在解鉀培養(yǎng)基上菌落周圍出現(xiàn)透明油滴狀暈圈（圖6D），在阿須貝無(wú)氮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好（圖6E），CAS在固體培養(yǎng)基上菌落周圍出現(xiàn)橘黃色暈圈（圖6F），表明菌株P(guān)pHyHNCJ2和PpHyHNCJ5具有解有機(jī)磷能力、解無(wú)機(jī)磷能力、解鉀能力、固氮能力和產(chǎn)鐵能力。

3討論

劍麻斑馬紋病是為害劍麻H.11648的嚴(yán)重病害。目前，針對(duì)劍麻斑馬紋病的防治主要以預(yù)防為主，優(yōu)先采取農(nóng)業(yè)技術(shù)措施防治，化學(xué)藥劑防治為輔，結(jié)合抗病育種等綜合防治措施[15]。農(nóng)業(yè)措施、藥劑防治和抗病育種對(duì)劍麻斑馬紋病的防治研究已經(jīng)相對(duì)深入，但是農(nóng)業(yè)防治[28]人工成本高，工人操作技術(shù)參差不齊，一些農(nóng)業(yè)措施工作繁瑣，很難達(dá)到精細(xì)化的管理?；瘜W(xué)藥劑主要有敵克松、甲基托布津、疫霜靈和金雷[29-30]等，防治過(guò)程中容易產(chǎn)生死角，加上劍麻葉片表面帶有蠟質(zhì)層，存在藥液不易吸附的問(wèn)題而影響藥效，而且大量施藥也容易造成病原抗藥性提高和環(huán)境污染。另外，由于劍麻生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，種質(zhì)資源缺乏，劍麻遺傳背景模糊等問(wèn)題，加上抗病育種本身難度大，育種周期長(zhǎng)、效率低，至今未能育成既抗病又高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的劍麻新品種[31-32]。因此，利用“以菌治菌”的措施對(duì)劍麻斑馬紋病進(jìn)行防控，完善和豐富劍麻斑馬紋病的綜合防治方式顯得尤為重要。本研究從火龍果病莖中分離篩選獲得2株對(duì)煙草疫霉菌具有顯著抑制效果的菌株P(guān)pHyHNCJ2和PpHyHNCJ5，其抑制率分別達(dá)85.92%和83.10%，根據(jù)菌株形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定以及分子鑒定構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，最終菌株P(guān)pHyHNCJ2和PpHyHNCJ5鑒定為多粘類芽孢桿菌（P.polymyxa）。

劍麻斑馬紋病的主要致病菌為煙草疫霉，目前已有許多生防菌對(duì)煙草疫霉有較好防治效果的相關(guān)報(bào)道[33-34]，如生防細(xì)菌有枯草芽孢桿菌[35]、銅綠假單胞桿菌[36]、解淀粉芽孢桿菌[37]等，生防真菌有哈茨木霉菌[38]、綠色木霉菌[39]、寡雄腐霉菌[40]等，生防放線菌主要以鏈霉菌為主[41-43]。多粘類芽孢桿菌是一種重要的生防細(xì)菌，具有促生長(zhǎng)和生物防治兩方面的作用，一是通過(guò)固氮、溶解磷、獲取鐵和產(chǎn)生植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑促進(jìn)植物生長(zhǎng)；二是通過(guò)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性、產(chǎn)生殺菌物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)生物防治[44]。前人研究顯示從煙草根際土壤中分離的多粘類芽孢桿菌C-5菌株[45]和多粘類芽孢桿菌LB-9[46]對(duì)煙草疫霉的抑菌率分別為71.10%和60.60%；王波等[47]發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌XZ-2對(duì)大豆疫霉病菌、大豆炭疽病菌和大豆菌核病菌菌絲均有較強(qiáng)的抑制作用，并可抑制大豆炭疽病菌孢子的萌發(fā)；郝芳敏等[48]發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌NBmelon-1對(duì)甜瓜多種真菌病害的病原菌均有抑制作用，且對(duì)甜瓜幼苗的生長(zhǎng)具有促生長(zhǎng)作用。此外，多粘類芽孢桿菌被美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局定為可作商用的微生物之一[49]。魏鴻剛等[50]利用多粘類芽孢桿菌成功開(kāi)發(fā)出防治植物青枯病和枯萎病的新型、高效微生物農(nóng)藥康地蕾得，該農(nóng)藥對(duì)植物青枯病、枯萎病等土傳病害防治效果顯著，促生增產(chǎn)明顯。本研究發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌菌株P(guān)pHyHNCJ2和PpHyHNCJ5對(duì)煙草疫霉菌菌絲體有較強(qiáng)的抑制作用，致使菌絲體出現(xiàn)分支增多、膨大增粗、纏繞等現(xiàn)象，其抑制率分別為85.92%、83.10%，均高于前人的報(bào)道；且抑菌譜廣，對(duì)辣椒疫霉菌、尖孢鐮刀菌、黑曲霉菌等11種病原菌的生長(zhǎng)表現(xiàn)出較好的抑制效果。另一方面，菌株P(guān)pHyHNCJ2和PpHyHNCJ5具有解有機(jī)磷能力、解無(wú)機(jī)磷能力、解鉀能力、固氮作用和產(chǎn)鐵作用。研究結(jié)果還顯示本研究分離的多粘類芽孢桿菌的耐鹽性為7%，均高于大多數(shù)多粘類芽孢桿菌，如菌株C-5的耐鹽性為3.5%[45]、菌株SH15的耐鹽性為5%[51]等，但其相關(guān)機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果表明：本研究分離的2株多粘類芽孢桿菌既具有殺菌作用，又能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，具有良好的生防潛力，研究結(jié)果為該生防菌進(jìn)一步的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

雖然關(guān)于抑制煙草疫霉菌的生防菌已有較多研究，但能真正成為產(chǎn)品，應(yīng)用于病害防治的少之又少，本研究分離獲得2株多粘類芽孢桿菌（菌株P(guān)pHyHNCJ2和PpHyHNCJ5），其對(duì)劍麻斑馬紋病菌抑制率均達(dá)83.10%以上，且抑菌譜廣，具有一定的促生能力，下一步將開(kāi)展這2株生防菌株對(duì)劍麻斑馬紋病的盆栽及田間防治效果的驗(yàn)證，以期為劍麻斑馬紋病的生物防治提供依據(jù)。