新疆山桃腐爛病病原菌鑒定

摘 要：【目的】鑒定在新疆奎屯市（44°26′35″N，84°54′24″E）和阿拉爾市（40°32′30″N，81°17′35″E）的山桃腐爛枝條病癥。

【方法】從山桃腐爛枝條上分離出2株山桃腐爛病病原菌（KTST和TDST），測定分析田間癥狀、無性形態(tài)、致病性，并結(jié)合ITS、RPB2、Tef1-α多基因序列聯(lián)合鑒定分析病原菌。

【結(jié)果】KTST和TDST的子座結(jié)構(gòu)、孔口的數(shù)量、腔室形狀及孢子類型均符合殼囊孢屬（Cytospora）特征，KTST與TDST分離株與GenBank中已有的Cytospora leucostoma、Cytospora chrysosperma菌株聚為一個獨(dú)立的分支。將腐爛病病原菌接種在離體的健康山桃枝上，引起腐爛病癥狀，驗(yàn)證其致病性。

【結(jié)論】新疆奎屯市和阿拉爾市的山桃腐爛病致病菌為Cytospora chrysosperma。

關(guān)鍵詞：山桃腐爛??；形態(tài)特征；致病性測定；多基因聯(lián)合分析

中圖分類號：S436.629"" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"" 文章編號：1001-4330（2024）12-3089-08

0 引 言

【研究意義】山桃樹（ Prunus davidiana ）是一種小喬木或灌木，屬于薔薇科李亞科桃屬，常被用于城市道路綠化的栽培樹種^［1-2］。山桃抗逆性強(qiáng)、成活率高、對環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)，是退耕還林和改善土質(zhì)的首選樹種^［3］，同時還是嫁接梅花和紫葉矮櫻等樹種的優(yōu)秀砧木^［4-5］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】2010年Khalil-Berdi^［6］在伊朗扁桃樹上分離出3株腐爛病病原菌，鑒定為Cytospora cincta Sacc.和Cytospora leucosperma。Jane E.Stewart^［7］對科羅拉多州西部的桃樹腐爛病菌鑒定為Cytospora plurivora、Valsa parapersoonii和Leucocytospora Paraleucostoma?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于山桃樹的文獻(xiàn)報道多集中在良種砧木及抗寒耐旱品種上^［8-10］，但山桃樹病害鮮有報道。近年來，在新疆奎屯市和阿拉爾市山桃樹上出現(xiàn)主干或側(cè)枝干枯死亡，且病枝表皮上有黑色子實(shí)體?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在形態(tài)學(xué)觀察基礎(chǔ)上，結(jié)合分子系統(tǒng)學(xué)方法鑒定奎屯市和阿拉爾市的山桃腐爛病病原菌，為2市山桃腐爛病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

從新疆奎屯市和阿拉爾市采集具有典型病害特征的山桃腐爛病枝條，放入牛皮紙袋中，標(biāo)記采集時間、地點(diǎn)帶回實(shí)驗(yàn)室常溫保存。表1

1.2 方 法

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

1.2.1.1 田間癥狀

觀察病原菌在寄主植物上的為害癥狀、病斑顏色、大小，有無分生孢子角溢出及分生孢子角顏色。

1.2.1.2 病原菌的分離純化及菌落培養(yǎng)性狀

采用單孢分離法^［11］分離山桃腐爛病病原菌，用75%的酒精消毒病組織表面，滅菌刀挑出子實(shí)體并切碎溶于無菌水中，制成孢子懸浮液（孢子懸浮液在顯微鏡下一個視野3～5個孢子）。取50 μL孢子懸浮液均勻涂布于PDA平板上，28°C暗培養(yǎng)1～2 d，挑取2塊已萌發(fā)的菌絲轉(zhuǎn)入新的PDA平板上，每個菌株重復(fù)3個培養(yǎng)皿，培養(yǎng)2～3 d后，用5 mm的打孔器取菌落邊緣5 mm菌餅轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上中央進(jìn)行菌株純化，并用封口膜將培養(yǎng)皿封口，倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，觀察記錄菌落生長速度、菌絲紋飾質(zhì)地、菌落后期是否產(chǎn)生色素和產(chǎn)孢情況。

1.2.1.3 子實(shí)體形態(tài)

在體式顯微鏡下觀察病害標(biāo)本子實(shí)體著生狀態(tài)及孔口數(shù)量；徒手切片法^［12］切取子實(shí)體橫、縱切片各30個，觀察橫、縱切面的腔室數(shù)量、形態(tài)特征并測量大小，放大倍數(shù)后可觀察到清晰的分生孢子梗，記錄分生孢子梗顏色和分支情況；挑取病組織表面分生孢子角溶于無菌水稀釋后鏡檢觀察分生孢子形態(tài)及大小，無分生孢子角溢出的病樣標(biāo)本，可挑取子實(shí)體制成孢子懸浮液進(jìn)行鏡檢觀察，分生孢子各觀察50個。

1.2.2 致病性

從田間采集1年生山桃健康枝條，將枝條截成10 cm的小段，用清水沖洗干凈，將枝條浸泡在75%的酒精1 min，無菌水沖洗3遍后晾干表面水分。選取規(guī)格5 mm的打孔器在枝條正中間打孔^［13］，再用5 mm滅菌打孔器在培養(yǎng)皿菌落邊緣打取菌餅，用鑷子將菌餅菌絲朝下接種到傷口處，每個菌株重復(fù)10 次，對照枝條接種空白PDA培養(yǎng)基。接種后的枝條用無菌保鮮膜將接種處纏緊，并用石蠟將枝條兩端進(jìn)行密封，放入接種盤置于28℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。接種后每24 h觀察并測量病斑擴(kuò)展速度、子實(shí)體形成和分生孢子角溢出時間。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定

1.2.3.1 基因組DNA的提取

用接種環(huán)從純化培養(yǎng)皿內(nèi)刮取少量菌絲轉(zhuǎn)入100 mL PD培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于25℃，180 r/min搖床內(nèi)培養(yǎng)3～5 d，用無菌紗布過濾菌絲球，無菌水沖洗3遍，再用無菌濾紙干燥處理。將收集的干燥菌絲放入滅菌的研缽中，加入液氮充分研磨。利用上海生物工程股份有限公司的Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒方法，抽提山桃腐爛病病原菌基因組DNA。抽取的DNA溶液經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測后，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 PCR擴(kuò)增和測序

PCR采用12.5 μL體系：2.5 μL 10×Buffer，2 μL dNTP（2.5 mM each），上游引物和下游引物各0.5 μL（10 μM），0.15 μL Ex Tap 酶（5 U/mL），1 μL 的DNA模板，最后用ddH2O補(bǔ)足12.5 μL（TaKaRa）。參照PCR擴(kuò)增引物序列^［14-16］及反應(yīng)條件。擴(kuò)增后產(chǎn)物送至上海生工科技股份有限公司進(jìn)行測序。表2

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將各個菌株的不同基因序列提交至NCBI中Blast程序中與Genbank中已知序列進(jìn)行比對，下載同源性較高的序列，用MEGA X^［17］進(jìn)行多基因序列比對，用最大簡約法^［18］（Maximum Parsimony）構(gòu)建序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征

2.1.1 分離株KTST形態(tài)

研究表明，KTST田間癥狀：發(fā)病部位多分布在側(cè)枝上，個別枝條干枯死亡，在樹皮上形成多而密集的黑色小突起，無分生孢子角溢出。

培養(yǎng)形態(tài)：在PDA培養(yǎng)基上初期白色到淡綠色，菌絲致密，放射狀生長，菌落擴(kuò)展速度為2.5 cm/d，第4 d菌絲生長覆蓋全培養(yǎng)皿，菌絲產(chǎn)生墨綠色色素，培養(yǎng)5 d產(chǎn)生子實(shí)體，培養(yǎng)后期子實(shí)體溢出黃色油滴狀分生孢子角。

子實(shí)體形態(tài)：子座在寄主樹枝表皮下埋生，有明顯的黑色界限圈，單孔口。腔室內(nèi)褶形成規(guī)則的多腔室，共用腔室璧。橫切面大小為1 045.16～1 553.91 μm×920.19～1 435.69 μm（平均1 367.68 μm×1 179.97 μm，n=30），縱切面大小為1 217.33～1722.74 μm×658.47～974.39 μm（平均1 534.52 μm×710.11μm，n=30）。分生孢子梗無色透明，不分枝。分生孢子無色透明，無分隔，臘腸形，大小為5.508～8.057 μm×0.855～1.570 μm（平均6.349 μm×1.135 μm，n=50）。圖1

2.1.2 TDST形態(tài)特征

研究表明，TDST田間癥狀：發(fā)病的山桃樹主干干枯死亡，病部溢出橘紅色和橘黃色孢子角。

培養(yǎng)形態(tài)：病原菌培養(yǎng)24 h內(nèi)開始生長，菌絲白色羽毛狀，在接種中心呈放射狀向四周生長，3 d后菌絲長滿整個培養(yǎng)皿，菌落呈現(xiàn)白色，后期產(chǎn)生較淺的黃色色素，7 d后在培養(yǎng)皿生長出黑色球狀的產(chǎn)孢器（子實(shí)體），15 d后小而密集的子實(shí)體隨機(jī)分布在培養(yǎng)皿上。

子實(shí)體形態(tài)：子座在寄主表皮下埋生，無黑色界限圈，后期突出，呈圓錐形。腔室內(nèi)褶形成復(fù)雜的多腔室，腔室數(shù)量7～26個，。腔室大小不一，各個腔室共用腔室壁，僅有一個孔口通向表皮外。子實(shí)體橫切面大小為3 158.68～4 327.36 μm×1 852.93～3 859.45 μm（平均3 765.73 μm×2 963.12 μm，n=30），子實(shí)體縱切面大小為3 254.68～3 810.36 μm×744.32～1 357.67 μm（平均3 625.64 μm×1 187.67 μm，n=30）。分生孢子梗無色透明，不分枝。分生孢子單孢無色，臘腸形，大小為5.741～7.757 μm×1.536～2.334 μm （平均6.875 μm×1.903 μm，n=50）。圖2

2.2 分離株KTST和TDST致病性變化

研究表明，將菌株KTST和TDST接種在1年生健康山桃枝條上，均可在48 h內(nèi)發(fā)病，發(fā)病率均為100%，病斑呈褐色。TDST菌株病斑擴(kuò)展速度為0.79 cm/d，較KTST菌株稍快。2株病原菌侵染后期在樹皮上形成大量小突起，皺縮的樹皮下出現(xiàn)黑色子實(shí)體。KTST和TDST致病力差異不明顯。表3，圖3

2.3 分子系統(tǒng)學(xué)

2.3.1 ITS 序列

研究表明，新疆奎屯市的山桃腐爛病分離株KTST與MG879495 、MH855047聚為一支，為Cytospora leucostom。來自阿拉爾市的分離株TDST與KX168605和KC880152聚為一支，同為Cytospora chrysosperm。圖中KP045637作為外群基因。圖4

2.3.2 RBP2序列分析

研究表明，分離株KTST與MW815958聚為一支，并與MH015295、MW815955、MN850746等Cytospora leucostom聚為一支，自展支持率均在95%以上KTST為C.leucostom。TDST與MH015303、KF76505、KF76506聚為一支，為殼囊孢屬金黃殼囊孢菌Cytospora chrysosperm。TDST和KTST兩個分離株則分布在較遠(yuǎn)的兩支上。圖5

2.3.3 TEF-1α 序列分析

研究表明，TDST與KF765722和KF765721聚為一支，自展支持率在98%以上，菌株KTST與MH820408和MW815944聚為一支，自展支持率達(dá)99%，因此TDST和KTST分別鑒定為C. chrysosperm、C.leucostom。圖6

3 討 論

3.1

Cytospora主要引起林木腐爛病，患病的樹皮可能出現(xiàn)黃色、棕色、紅褐色、灰色或黑色凹陷，在濕潤條件下，分生孢子常以黃色、橙色到紅色的膠狀卷須的形式出現(xiàn)，寄主種類眾多，地域分布廣泛，寄主專一性弱，且不同寄主來源腐爛病之間存在交互侵染現(xiàn)象^［19-20］，依靠傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征對其進(jìn)行鑒定分類是不恰當(dāng)?shù)?sup>［^21］。張星耀^［22］、張俊娥^［23］在對金黃殼囊孢菌表觀特征研究時，發(fā)現(xiàn)不同分離株楊樹腐爛病菌培養(yǎng)性狀會由寄主及地理差異而出現(xiàn)明顯分化現(xiàn)象。孫祥瑞^［24］、冀瑞卿^［25］對樹皮腐爛病進(jìn)行分子鑒定時發(fā)現(xiàn)單基因序列對腐爛病從類群到種的劃分存在一定局限性，不同序列在同一個體內(nèi)的差異可能超過了部分物種間的差異^［26］，因此僅靠寄主、形態(tài)學(xué)特征或單基因系統(tǒng)發(fā)育研究對該類病原菌進(jìn)行鑒定并不可靠。研究使用多基因聯(lián)合分析，彌補(bǔ)了單基因結(jié)果的片面性，同時結(jié)合形態(tài)學(xué)分析得出種間差異，所得結(jié)果更加準(zhǔn)確。

3.2

通過對山桃腐爛病病樣上的子實(shí)體、菌落形態(tài)及致病性觀察與測量。菌株TDST子座無黑色界限圈、頂盤單孔口、多腔室及培養(yǎng)形態(tài)初期白色，菌絲致密，培養(yǎng)后期淡黃色等特征均符合陸家元^［27］對金黃殼囊孢的表述，也與范鑫磊^［28］對殼囊孢屬形態(tài)分類研究結(jié)果一致，但子實(shí)體大小及分生孢子大小略有不同，可能由于子實(shí)體成熟程度不同導(dǎo)致，也可能是由于金黃殼囊孢菌內(nèi)部存在遺傳分化。結(jié)合ITS、RPB2、TEF-1α三對基因分別測序建樹，TDST總能與chrysosperma聚為一支，由此確定來自阿拉爾的山桃腐爛病菌株TDST為殼囊孢屬金黃殼囊孢菌（C.chrysosperma）。同樣菌株KTST子實(shí)體有明顯的黑色界限圈，根據(jù)殼囊孢屬形態(tài)學(xué)分類依據(jù)C.leucostom、Cytospora nivea、Cytospora cincta均有此特征，但C.leucostom孢子小于其他兩個種，KTST孢子大小與C.leucostom一致，KTST菌落形態(tài)初期為白色至淡綠色，培養(yǎng)后期產(chǎn)生墨綠色色素，與馬榮^［29］對新疆殼囊孢屬分類中C.leucostom描述一致，結(jié)合多基因序列比對，KTST為C.leucostom。TDST和KTST均是山桃腐爛病，但分為兩個不同的種，一方面地理差異較大，另一方面可能來自其他寄主腐爛病菌的傳播。根據(jù)致病性測定可知兩個菌株均屬于致病性菌株，是否侵染其他樹種需進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

4 結(jié) 論

KTST和TDST的子座結(jié)構(gòu)、孔口的數(shù)量、腔室形狀及孢子類型均符合殼囊孢屬（Cytospora）特征，KTST與TDST分離株與GenBank中已有的Cytospora leucostoma、Cytospora chrysosperma菌株聚為一個獨(dú)立的分支。TDST和KTST分別為C.chrysosperma和C.leucostom。

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［28］ 范鑫磊. 中國黃河流域殼囊孢屬的分類和系統(tǒng)學(xué)研究［D］. 北京： 北京林業(yè)大學(xué)， 2016.

FAN Xinlei. Taxonomy and systematics of the genus Cytospora in the Yellow River Basin of China［D］. Beijing： Beijing Forestry University， 2016.

［29］ 馬榮. 新疆殼囊孢屬真菌的分類及系統(tǒng)學(xué)研究［D］. 北京： 北京林業(yè)大學(xué)， 2017.

MA Rong. Study on taxonomy and systematics of the fungi of the genus Cystispora in Xinjiang［D］. Beijing： Beijing Forestry University， 2017.

Identification of the pathogen of Prunus davidiana canker in Xinjiang

TANG Li1， LI Chunyan2， JIA Wenhao1， LIU Zhenya1， LI Yapeng1， DAN Hongxia1， ZHANG Wangbin1

（1. The National Local Joint Engineering Lab of High Efficiency and Superior-Quality Cultivation and Fruit Deep Processing Technology of Characteristic Fruit Tress in Southern Xinjiang/Key Lab of Xinjiang Production and Construction Corps in Comprehensive Agricultural Pest Management in Southern Xinjiang/Scientific Observing/Experimental Station of Crops Pests in Aral， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Tarim University， Aral Xinjiang 843300， China; 2. Xinjiang Applied Vocational and Technical College， Kuitun Xinjiang 833200， China）

Abstract：【Objective】 There is a typical symptom about canker disease in Prunus davidiana from Kuitun City （44°26′35″N， 84°54′24″ E） and Aral City （40°32′30″N， 81°17′35″E）， Xinjiang.With this in mind， this research aim to identify the real cause.

【Methods】"" Pathogens （KTST and TDST） were isolated from the susceptible Prunus davidiana branches.

【Results】" Based on morphological characteristics， combined with ITS， RPB2 and Tef1-α multi-genesequence analysis， Cytospora leucostoma and Cytospora chrysosperma were isolates from KTST and TDST.

【Conclusion】" The Koch postulates was verified by inoculating the pathogen of canker disease on the healthy branches in vitro to cause canker disease symptoms.

Key words： Valsa canker; morphological characteristics; pathogenicity determination; multigene analysis

Fund project：Genetic Diversity and Pathogenicity Differentiation of Fruit Trees in Xinjiang （31660034）

Correspondence author： ZHANG Wangbin（1974-），male，from Cheng cheng，professor，master's supervisor，research direction：plant pathology，（E-mail）zwbzky@163.com

基金項(xiàng)目：“新疆棗園林果樹木腐爛病菌遺傳多樣性及致病力分化研究”（31660034）

作者簡介：唐麗（1993-），女，四川德陽人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)，（E-mail）susuzaizai@163.com

通訊作者：張王斌（1974-），男，陜西澄城人，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)，（E-mail）zwbzky@163.com