肝硬化營養(yǎng)不良患者腸道菌群的組成特征分析

畢炯炯，馬英杰

1 河南中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州 450003

2 河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院/鄭州人民醫(yī)院消化內(nèi)科，鄭州 450003

肝硬化是各種慢性肝病的終末階段，營養(yǎng)不良是肝硬化的常見并發(fā)癥，約有20%的代償期肝硬化患者和50%以上的失代償期肝硬化患者可并發(fā)營養(yǎng)不良，其發(fā)生率不但與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，還是疾病預(yù)后的獨立預(yù)測因子［1-4］。肝硬化患者的營養(yǎng)不良可由多種因素造成，既包括禁食時間和飲酒等外部因素，又包括能量和蛋白質(zhì)攝入減少、炎癥、吸收不良、營養(yǎng)代謝改變、激素紊亂、高代謝和腸道微生態(tài)失調(diào)等內(nèi)部因素［1，4］。Stadlbauer 等［5］發(fā)現(xiàn)中度營養(yǎng)不良的肝硬化患者的糞便中彎曲桿菌屬豐度較高。目前，評估肝硬化營養(yǎng)風(fēng)險狀況的方法包括測量BMI、上臂圍、肌酐-身高指數(shù)及前白蛋白等指標(biāo)及營養(yǎng)風(fēng)險篩查2002、預(yù)后營養(yǎng)指數(shù)、主觀全面評K 估工具及皇家自由醫(yī)院營養(yǎng)優(yōu)先排序工具（Royal free hospital-nutriton priority tool，RFH-NPT）等，這些營養(yǎng)評估工具各具優(yōu)缺點，其中RFH-NPT 被認(rèn)為是目前肝病患者營養(yǎng)篩查的最佳選擇［6］。為了探索肝硬化營養(yǎng)不良與腸道菌群的關(guān)系，本研究首先利用RFHNPT 對肝硬化患者進(jìn)行營養(yǎng)風(fēng)險評估，隨后利用高通量測序技術(shù)檢測患者糞便菌群的特征，旨在為肝硬化患者營養(yǎng)狀況的干預(yù)提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入2021年3月—2022年11月在鄭州人民醫(yī)院消化內(nèi)科住院的肝硬化患者作為試驗組（LC組）。肝硬化符合2019年版《肝硬化診治指南》［7］中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。選取同期健康體檢者作為對照組（HC 組），HC組納入標(biāo)準(zhǔn)：無消化系統(tǒng)疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、器官功能障礙、惡性腫瘤等，常規(guī)檢查未見異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：近4周內(nèi)使用抗菌藥物、微生態(tài)制劑、胃腸動力藥物、免疫抑制劑；合并慢性腹瀉、炎癥性腸病等可引起腸道菌群紊亂的疾??；有胃腸道或腹腔外科手術(shù)史；妊娠及哺乳期婦女。

1.2 營養(yǎng)狀況評估 對患者問診是否為急性酒精性肝炎或正在接受鼻飼，有無液體潴留情況、過去3～6 個月是否有非計劃的體質(zhì)量下降，營養(yǎng)攝入情況等，測量身高、BMI，完成RFH-NPT評分后進(jìn)行營養(yǎng)風(fēng)險篩查。

1.3 血清內(nèi)毒素檢測 外周血內(nèi)毒素檢測采用鱟試劑凝膠法，試劑為廈門鱟試劑生物科技有限公司生產(chǎn)，用分光光度計在545 nm波長處測定吸光度，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出內(nèi)毒素濃度。

1.4 糞便樣本采集 采集前要求受檢者排盡尿液，避免采集過程中尿液等污染，用無菌密閉糞便采集管中的勺子從糞便內(nèi)部挖取約5 g樣本，密封后凍存在-80 ℃冰箱中用于下一步研究。

1.5 測序方法及生物信息分析 采用DNeasy PowerSoil Pro Kit 試劑盒（QIAGEN，美國）提取糞便樣本基因組DNA，利用特異性引物343F：TACGGRAGGCAGCAG，798R：AGGGTATCTAATCCT 對基因組16S V3-V4區(qū)域進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，構(gòu)建基因文庫，使用Illumina Miseq 測序平臺進(jìn)行測序。測序結(jié)果經(jīng)過Reads 拼接成Tags 后，按97%的相似性進(jìn)行OUT 聚類并與Silva（v138）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對注釋，最終獲得物種信息。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布的計量資料以xˉ±s表示，組間比較采用成組t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。非正態(tài)分布的計量資料以M（P25～P75）表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman 檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 LC 組患者58 例，平均年齡（58.31±10.51）歲，其中男性39 例，女性19 例；乙型肝炎肝硬化54例，丙型肝炎肝硬化2例，酒精性肝硬化1例，自身免疫性肝炎肝硬化1 例。根據(jù)RFH-NPT 得分情況，將分值＜1分的患者歸為低營養(yǎng)風(fēng)險組（LC-A組，n=28），分值≥1分的患者歸為中/高營養(yǎng)風(fēng)險組（LC-B組，n=30）；其中Child-Pugh A 級、B 級、C 級營養(yǎng)風(fēng)險的發(fā)生率分別為13.64%（3/22）、61.90%（13/21）、93.33%（14/15）。HC 組25 例，平均年齡（54.68±8.56）歲，男性12 例，女性13 例。三組ALT、GGT、Alb、TBil 及血清內(nèi)毒素水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）（表1）。

表1 各組基本資料Table 1 Basic information of each group

2.2 腸道菌群豐度和多樣性比較 與HC 組比較，LC-A組、LC-B 組的Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)均有下降趨勢，HC 組與LC-B 組Chao1 指數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 各組腸道菌群豐度和多樣性比較Table 2 Comparison of the abundance and diversity of intestinal flora in each group

2.3 腸道菌群的豐度差異比較 在門水平上，各組主要由擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteriota）組成，并占總體門類的95%以上，HC-A 組與LC-B 組厚壁門相對豐度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表3 各組腸道菌群門水平相對豐度組成比較Table 3 Composition comparison of relative abundance of intestinal flora at phylum level in each group

在屬水平上，與HC 組比較，肝硬化組中擬桿菌屬（Bacteroides）、大腸埃氏菌屬-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）相對豐度升高（t值分別為-0.630、4.321、-1.082，P值分別為0.212、0.001、0.285），普雷沃氏菌（Prevotella）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、羅氏菌屬（Roseburia）、毛螺菌屬（Lachnospira）、乳梭菌屬（Lachnoclostridium）相對豐度降低（t=-1.623、4.465、2.135、1.967、1.657，P值分別為0.111、＜0.001、0.038、0.055、0.104）（圖1）。進(jìn)一步比較分析后，肝硬化低營養(yǎng)風(fēng)險組和中/高營養(yǎng)風(fēng)險組共有12種腸道差異菌群：內(nèi)生單胞菌屬（Endozoicomonas）、霍華德菌屬（Howardella）、Roseimarinus、螺旋體（Spirochaeta_2）在中/高營養(yǎng)風(fēng)險組中相對豐度升高，另枝菌屬（Alistipes）、柯林斯菌屬（Collinsella）、GCA-900066575、霍爾德曼氏菌屬（Holdemanella）、瘤胃菌科（Incertae_Sedis）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae_ND3007_group、Lachnospiraceae_UCG-010）、塞內(nèi)加爾厭氧菌（Senegalimassilia）在低營養(yǎng)風(fēng)險組中相對豐度升高（P值均＜0.05）（圖2）。

圖1 腸道菌群主要屬（前20位）相對豐度百分比Figure 1 Relative abundance percentage of major genera（top 20）of intestinal flora

圖2 腸道菌群屬水平物種相對豐度比較Figure 2 Comparison of relative abundance of species at genus level of gut microbiota

2.4 腸道差異物種與臨床指標(biāo)相關(guān)性 血清內(nèi)毒素與瘤胃菌科呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.420，P=0.007）。螺旋體與TBil 呈顯著正相關(guān)（r=0.419，P=0.007），與Alb 呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.492，P=0.001）（圖3）。

圖3 腸道差異菌群與臨床指標(biāo)的關(guān)系Figure 3 Relationship between gut differential flora and clinical indicators

3 討論

肝硬化患者營養(yǎng)不良的發(fā)生被認(rèn)為與營養(yǎng)和炎癥反應(yīng)有關(guān)［8］。其中營養(yǎng)物質(zhì)攝入減少，腸道消化或吸收不良以及高分解代謝等機(jī)制已被證實［9-11］。在晚期肝病中，小腸細(xì)菌過度生長也是導(dǎo)致肝硬化營養(yǎng)不良的重要機(jī)制，由于結(jié)腸細(xì)菌在小腸內(nèi)大量定植，小腸微絨毛結(jié)構(gòu)及腸道屏障功能受損，消化酶產(chǎn)生減少，腸道運(yùn)動能力受阻，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)吸收代謝紊亂［12-13］。此外，炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分解代謝增加，也可導(dǎo)致營養(yǎng)不良和肌肉量減少，該反應(yīng)與肝硬化失代償期患者的腸道菌群組成的改變相關(guān)［8］。肝硬化時腸道細(xì)菌易位，易位的微生物及其代謝產(chǎn)物通過門靜脈傳遞，并被肝細(xì)胞表面的模式識別受體識別，激活肝臟固有免疫反應(yīng)，使機(jī)體處于促炎激活狀態(tài)，并通過TLR4/MYD88/NF-κB 通路，促使各種促炎因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6）大量表達(dá)，這些促炎因子不但會降低食欲，影響營養(yǎng)物質(zhì)的攝入，還可能導(dǎo)致高代謝［14-15］。由此可見，腸道微生態(tài)失調(diào)是肝硬化患者營養(yǎng)不良的一個重要促進(jìn)因素。

個體中微生物組多樣性越高，其對病原微生物的易感性越低，越有利于機(jī)體健康和微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定。在本研究中，肝硬化患者腸道菌群豐度和多樣性均低于健康人群，與國內(nèi)外研究［16-17］結(jié)果一致。Kriss 等［18］認(rèn)為低多樣性的腸道菌群失調(diào)是導(dǎo)致肝臟炎癥的可能機(jī)制。此外還發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)不良風(fēng)險更高的患者腸道菌群的多樣性和豐度低于低營養(yǎng)不良風(fēng)險患者。部分觀點認(rèn)為，腸道微生物組豐度或多樣性的降低反映的是患者體內(nèi)各種有害細(xì)菌過度生長的情況。但關(guān)于肝硬化營養(yǎng)不良患者腸道菌群多樣性降低的機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。

腸道微生物群是一種營養(yǎng)信號傳感器，能夠合成或修飾短鏈脂肪酸和支鏈氨基酸等營養(yǎng)信號分子。而在肝硬化病情進(jìn)展中，腸道微生態(tài)的失衡會導(dǎo)致支鏈氨基酸的缺失，從而抑制蛋白質(zhì)的合成和周轉(zhuǎn)，加劇營養(yǎng)不良和肌肉萎縮［19］。在本研究中，厚壁菌門在肝硬化中/高營養(yǎng)不良風(fēng)險患者中相對豐度降低，而變形菌門在中/高營養(yǎng)不良風(fēng)險患者中的相對豐度升高。郝莎莎等［20］發(fā)現(xiàn)肝硬化合并肌量減少患者的腸道菌群中變形菌門相對豐度同樣升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化低營養(yǎng)不良風(fēng)險患者和中/高營養(yǎng)不良風(fēng)險患者腸道菌群中存在顯著差異的物種。其中，另枝菌屬、毛螺旋菌科、瘤胃菌科及柯林斯菌屬等在肝硬化中/高營養(yǎng)不良風(fēng)險患者糞便中相對豐度降低。Iebba 等［21］發(fā)現(xiàn)肝硬化患者腸道中的另枝菌屬豐度低于健康對照組。并且這種豐度的改變與疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)［22］。Sung 等［23］在比較失代償期肝硬化和急性肝性腦病患者的糞便菌群時發(fā)現(xiàn)，另枝菌屬豐度的降低與肝性腦病復(fù)發(fā)的增加有關(guān)?；蛟S另枝菌屬在肝硬化病情發(fā)展中起到正向作用。此外，另枝菌屬是隸屬于擬桿菌門的一種革蘭陰性菌，在代謝過程中產(chǎn)生丙酸和乙酸［24］。丙酸是肝臟進(jìn)行糖異生的主要能量來源，能夠通過其對厭食性腸道激素的刺激作用和增加瘦素的合成來控制攝食情況［25］。乙酸是脂肪生成和膽固醇合成的底物，可與腸道內(nèi)的某些受體結(jié)合，促進(jìn)特定腸道激素如酪酪肽（肽YY）和胰高血糖素樣肽1 的釋放來控制食欲和抑制胰腺分泌，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收［26］。Lachnospiraceae_ND3007_group和Lachnospiraceae_UCG-010屬于毛螺菌科，可能是一種潛在的有益菌，參與膳食纖維的發(fā)酵，產(chǎn)生的乙酸和丁酸為宿主提供能量來源。瘤胃球菌科在新陳代謝中起著至關(guān)重要的作用，是“降解抗性淀粉的關(guān)鍵菌”，通過分解纖維素來獲取營養(yǎng)并產(chǎn)生丁酸。丁酸可被氧化成乙酰輔酶A，通過三羧酸循環(huán)產(chǎn)生大量的ATP，為機(jī)體提供能量來源，同時具有抗炎及預(yù)防代謝性內(nèi)毒素血癥的特性。此外，丁酸鹽誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞群的擴(kuò)張，通過產(chǎn)生TGF-β 來激活CD8+T 淋巴細(xì)胞中的WNT10b 表達(dá)促進(jìn)骨的形成［27］。由此可見，肝硬化患者腸道中產(chǎn)短鏈脂肪酸的菌群減少，會打破腸道免疫系統(tǒng)的平衡，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，影響腸道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和能量供應(yīng)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，相較于健康人群和低營養(yǎng)不良風(fēng)險患者，肝硬化中/高營養(yǎng)不良風(fēng)險患者具有更高水平的血清內(nèi)毒素。肝硬化患者由于免疫功能障礙和門靜脈高壓的存在，易加重內(nèi)毒素血癥，血清內(nèi)毒素可能會通過TNF-α 依賴和獨立途徑引起自噬蛋白分解增加和蛋白質(zhì)合成減少，從而導(dǎo)致營養(yǎng)不良［28-29］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血清內(nèi)毒素水平與糞便中的瘤胃菌科菌屬呈負(fù)相關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚，但至少可以說明腸道菌群的改變能夠影響肝硬化患者的營養(yǎng)狀況。

目前尚不清楚是腸道微生態(tài)失調(diào)導(dǎo)致了肝硬化營養(yǎng)不良的發(fā)展，還是疾病本身或是藥物治療后導(dǎo)致的微生物群失調(diào)。盡管二者因果關(guān)系未明，但肝硬化患者營養(yǎng)狀況的改變確實與獨特的腸道微生物群失調(diào)有關(guān)，這為今后肝硬化營養(yǎng)不良的微生物治療提供了依據(jù)。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2021 年9 月4 日經(jīng)由鄭州人民醫(yī)院倫理委員會審批，批號為2021001016。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：畢炯炯負(fù)責(zé)課題設(shè)計，收集整理數(shù)據(jù)，撰寫論文；馬英杰負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)論文撰寫和修改。