HPLC-柱后衍生熒光法測(cè)定水產(chǎn)品中河豚毒素含量結(jié)果的不確定度評(píng)定

＊袁巧杰

（譜尼測(cè)試集團(tuán)上海有限公司 上海 201613）

河豚毒素是自然界中所發(fā)現(xiàn)的毒性最大的神經(jīng)毒素之一，高效液相色譜-柱后衍生熒光法靈敏度高，檢測(cè)限可達(dá)50μg/kg[1]。

不確定度是科學(xué)評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果的參數(shù)之一[2]，日常檢測(cè)中，除了給出測(cè)量值，還應(yīng)同時(shí)給出不確定度。本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜（HPLC），并依據(jù)GB 5009.206—2016第三法[1]對(duì)水產(chǎn)品中河豚毒素進(jìn)行分析檢測(cè)。參照CNAS-GL06:2006[2]，JJF 1059—2012[3]《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》中的計(jì)算方式，計(jì)算水產(chǎn)品中河豚毒素測(cè)定過程中各分量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度[4-5]，并對(duì)各分量進(jìn)行比較，以最大可能降低檢測(cè)過程中的不確定度，保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.材料與方法

（1）材料與試劑。魚；河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度100μg/mL；甲醇；乙腈；甲酸；冰乙酸；乙酸銨；十二水合磷酸氫二鈉；二水合磷酸二氫鈉；氯化鈉；氫氧化鈉；庚烷磺酸鈉；碳酸鈉。

（2）儀器與設(shè)備。島津LC-20AT高效液相色譜儀，配柱后衍生裝置；密理博A10純水機(jī)系統(tǒng)；固相萃取儀；色譜柱：Agilent SB C18（4.6×250mm，5μm）；KQ500B超聲波振蕩器；循環(huán)水真空泵；氮吹儀；河豚毒素免疫親和柱，柱規(guī)格3mL，最大柱容量1000ng。

（3）方法。參照GB 5009.206—2016第三法液相色譜-熒光檢測(cè)法進(jìn)行[1]：

①色譜條件。A.色譜柱：Agilent SB C18（4.6×250mm，5μm）；B.流動(dòng)相：乙腈-乙酸銨緩沖液（5+95，體積比）；C.流速：1.0mL/min；D.激發(fā)波長：385nm；發(fā)射波長：505nm；E.柱溫：40℃；F.進(jìn)樣量：40μL；G.柱后衍生溶液：氫氧化鈉（4mol/L）；流速：0.5mL/min；溫度：110℃。

②標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。A.河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確移取1mL河豚毒素液標(biāo)于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，濃度為10μg/mL。B.河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液：以河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液為原液，用移液器移取適當(dāng)體積至10mL容量瓶，用1%乙酸溶液定容，即得濃度為0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

③實(shí)驗(yàn)步驟。稱取2g試樣，加入乙酸-甲醇溶液提取，旋蒸濃縮，用2mL乙酸溶液復(fù)溶后，加入8mL PBS緩沖液稀釋，氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7～8，上免疫親和柱凈化，洗脫，氮吹干后用1%的乙酸溶液定容至1.00mL，過0.22μm的水相濾膜，上HPLC檢測(cè)。

④定量方法。將河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液和檢測(cè)試樣溶液上液相色譜儀檢測(cè)，測(cè)定其峰面積，以河豚毒素的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以保留時(shí)間定性，峰面積定量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得試樣中河豚毒素的濃度，并根據(jù)計(jì)算公式得到樣品中河豚毒素的含量。

⑤試樣中河豚毒素的含量式（1）計(jì)算：

式中，X—試樣中河豚毒素的含量，μg/kg；C—試樣待測(cè)液中河豚毒素的濃度，μg/L；C0—空白待測(cè)液中河豚毒素的濃度，μg/L；V—定容體積，mL；f—稀釋倍數(shù)；m—試樣的稱樣量，g。

2.結(jié)果與討論

(1)不確定度來源分析

河豚毒素檢測(cè)結(jié)果的不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)品的校準(zhǔn)過程、樣品稱量、實(shí)驗(yàn)過程移取及定容體積、樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的誤差、前處理過程中的回收率不同等[3,5]。

(2)不確定度分量

①校準(zhǔn)過程產(chǎn)生不確定度Urel（cal）A.標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程產(chǎn)生的不確定度

a.標(biāo)準(zhǔn)品純度的不確定度Urel（C1）。根據(jù)供應(yīng)商目錄所給純度，河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為100μg/mL，擴(kuò)展不確定度為5%，包含因子k=2，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

b.配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的不確定度Urel（C2）。

第一，根據(jù)JJG 646—2006移液器檢定規(guī)程[6]，使用標(biāo)稱容量為1mL的移液器，移取1mL液體時(shí)，容量允許誤差為±1%，移液器移取所產(chǎn)生的不確定度為

第二，使用A級(jí)10mL單標(biāo)線容量瓶定容，根據(jù)JJG 196—2006常用玻璃量器規(guī)定[7]，容量允許差為±0.020mL，配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容產(chǎn)生的不確定為

第三，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)環(huán)境的要求，溫度嚴(yán)格控制在20±5℃，20℃下，甲醇的體積膨脹系數(shù)約為0.00119，1%乙酸水的體積膨脹系數(shù)約為0.00207[8]，體積膨脹帶來的相對(duì)不確定度為：

綜上，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制過程引入的不確定度為：

c.配制標(biāo)準(zhǔn)工作液的不確定度Urel（C3）。

式中，Urel（）—移液器移取的不確定度，見表1；Urel（）—容量瓶定容至10mL的不確定度；Urel（）—1%乙酸水體積膨脹帶來的不確定度。

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作液移取過程中產(chǎn)生的不確定度

綜上，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程產(chǎn)生的不確定度為：

B.校準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度Urel（A）

根據(jù)高效液相色譜儀的軟件分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為f（x）=11299.9×x+0，其中x為河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的濃度，f（x）為河豚毒素的峰面積，5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度點(diǎn)對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值峰面積Ai分別為921、2286、5033、10952、22947，理論響應(yīng)值峰面積A分別為1130、2260、5650、11300、22600。

對(duì)陰性樣品加標(biāo)，進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，得到的濃度分別為188.015ng/mL、180.289ng/mL、189.302ng/mL、186.614ng/mL、184.071ng/mL、186.787ng/mL，平均值為185.846ng/mL，由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度由式（2）計(jì)算。

式中，Urel（C4）—標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度；S（A）—標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)物質(zhì)信號(hào)殘差的標(biāo)準(zhǔn)差；p—樣品測(cè)定次數(shù)（6次）；n—標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的點(diǎn)數(shù)（5次）；b—標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；c0—待測(cè)樣品中河豚毒素濃度的平均值，ng/mL；ci—標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)河豚毒素濃度理論值，ng/mL；—標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)河豚毒素濃度平均值，ng/mL。其中，S（A）的計(jì)算如式（3）。

式中，n—標(biāo)準(zhǔn)曲線的點(diǎn)數(shù)；Ai—標(biāo)準(zhǔn)溶液各濃度點(diǎn)的峰面積；A—根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出的理論峰面積。

由公式（3）可得，S（A）=471.4，由公式（2）可得，校準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的峰面積標(biāo)準(zhǔn)不確定度為U（A）=3.27，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

綜上，校準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度為：

②樣品稱量產(chǎn)生的不確定度Urel（m）

使用電子分析天平稱取2g樣品，按上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院校準(zhǔn)證書給出的示值誤差為0.1mg，樣品稱量產(chǎn)生的不確定度為：

③樣品定容的產(chǎn)生的不確定度Urel（V）

樣品定容體積為1mL，根據(jù)JJG 646—2006移液器檢定規(guī)程規(guī)定[6]：1mL移液器移取1ml的允許誤差為±1.0%，即0.01mL，按均勻分布[8]計(jì)算，樣品定容產(chǎn)生的不確定度為：

④樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的不確定度Urel（R）

取陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)量為100μg/kg，實(shí)際測(cè)定值分別為90.3μg/kg、89.6μg/kg、90.1μg/kg、92.1μg/kg、91.4μg/kg、90.3μg/kg，平均值R=90.6μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差SR=0.0936μg/kg，計(jì)算樣品重復(fù)性引入的不確定度為：

⑤回收率的不確定度Urel（P）

取陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)量為100μg/kg，回收率分別為94.0%、90.1%、 94.7%、93.3%、92.0%、93.4%，平均值P=92.9%，標(biāo)準(zhǔn)偏差SP=1.61%，計(jì)算回收率引入的不確定度為：

(3)相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

(4)主要不確定度分量對(duì)合成不確定度的貢獻(xiàn)

綜上所述，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、校準(zhǔn)曲線擬合、樣品稱量、樣品定容、樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、回收率的不確定度分別為：0.0311、0.0176、0.0000289、0.00577、0.000422、0.00725，對(duì)合成不確定度的相對(duì)貢獻(xiàn)[u（y1）/u（y）]2分別為71.03%、22.75%、0.00006%、2.45%、0.013%、3.86%。

(5)合成不確定度

在95%置信概率下，擴(kuò)展因子k=2，本實(shí)驗(yàn)中河豚毒素的測(cè)定值為90.6μg/kg，擴(kuò)展不確定度為：

Up（X）=k×Urel（X）×-X=2×90.6μg/kg×0.0369=6.69μg/kg。因此，樣品中河豚毒素的結(jié)果表示為：X=（90.6±6.7）μg/kg，k=2。

3.結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過量化分析水產(chǎn)品中河豚毒素測(cè)定結(jié)果的不確定度分量，并對(duì)各分量相對(duì)貢獻(xiàn)進(jìn)行比較，得出如下結(jié)論：河豚毒素測(cè)量結(jié)果的不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程，其次是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、回收率、樣品定容、樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和樣品稱量的影響最小。