Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化羥基紅花黃色素A 納米粒處方工藝及體外釋放評(píng)價(jià)

肖奕菲，杜利新，魏起東，陸慧玲，郭志華，李雅（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

羥基紅花黃色素A （hydroxysafflor yellow A，HSYA）是菊科植物紅花的主要水溶性成分，自《中國(guó)藥典》2005年版起，HSYA 被規(guī)定作為紅花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)成分之一[1]。大量研究表明HSYA 具有改善心肌缺血/再灌注損傷、改善缺血性腦卒中損傷、抗高血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用[2-3]，已廣泛用于治療心腦血管疾病，且已被國(guó)家藥品食品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)為新型心血管藥物[4]。目前HSYA 多采用靜脈注射給藥，由于長(zhǎng)期頻繁注射給患者帶來(lái)諸多不便，亟需研發(fā)口服給藥劑型。但根據(jù)生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)，HSYA 屬于高溶解性、低滲透性的Ⅲ類藥物，其極性強(qiáng)，膜通透性差，難以跨過(guò)胃腸道上皮細(xì)胞屏障[5]；且易于光、高溫、堿性條件下發(fā)生氧化、水解、聚合反應(yīng)[6]；由于酚羥基的存在[7]，HSYA 以質(zhì)子化的形式存在于天然或堿性水溶液中，嚴(yán)重影響其跨膜能力，導(dǎo)致其口服生物利用度低，阻礙了其臨床應(yīng)用。因此，目前對(duì)HSYA 給藥系統(tǒng)的研究主要通過(guò)研究如何提高其脂溶性，增強(qiáng)理化性質(zhì)和提高生物利用度[8]。研究表明納米粒、微乳劑、自乳化體系均可提高HSYA 的跨膜能力[9-12]，其中納米粒的優(yōu)點(diǎn)包括控制藥物釋放、提高藥物穩(wěn)定性和藥物負(fù)載效率、改良藥物的溶解性、生物相容性[13-16]。乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolicacid，PLGA）]是納米粒常用的載體之一，具有良好的生物相容性；且在體內(nèi)發(fā)生水解時(shí)降解為可被人體正常排出的乳酸和羥基乙酸，相較于其他載體的安全性高，現(xiàn)已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局和歐洲藥品局批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床[17]。故本研究擬采用PLGA 為載體，制備HSYA 納米粒，以提高HSYA 口服生物利用度，為HSYA口服制劑的研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器Agilent 1200s 高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent 公司；C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），大連依利特分析儀器有限公司；十萬(wàn)分之一電子天平，德國(guó)梅特勒-托利多儀器公司；ZNCL-B-L 磁力攪拌器，鞏義市中天儀器科技有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Zetasizer Nano-ZS90 激光粒度分析儀，英國(guó)Malvern儀器有限公司；Hitachi H-7650 透射電子顯微鏡，日本Hitachi 公司；Bruke D8 Advance X 射線衍射（XRD）儀，德國(guó)Bruke 公司；Nicolet iS20 傅立葉紅外光譜（FT-IR）儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Gold SIM公司。

1.2 試劑羥基紅花黃色素A 對(duì)照品（成都埃法生物科技有限公司，含量98%，批號(hào)：AFCA1001）；PLGA（濟(jì)南代罡生物科技有限公司，分子量：30 000）；透析袋（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，截留分子量為8～14 kDa）；泊洛沙姆188（上海畢得醫(yī)藥科技有限公司，貨號(hào)：BD105932）；甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20210308）；丙酮（湖南匯虹試劑有限公司，批號(hào)：20210903-2）；乙腈（色譜純，美國(guó)TEDIA天地試劑公司，批號(hào)：22105166）。

2 方法與結(jié)果

2.1 HSYA 納米粒的制備精密稱取處方量HSYA 原料藥加入0.2 mL 磷酸緩沖溶液溶解，作為內(nèi)水相；精密稱取處方量PLGA加入2 mL丙酮超聲溶解，作為油相；將內(nèi)水相注入到油相中超聲形成初乳；將初乳緩慢注入到5 mL 含0.2%泊洛沙姆的外水相中，超聲3 min；再用注射器將超聲后的混懸液在1 200 r·min-1磁力攪拌速度下緩慢注入到10 mL 0.1%的泊洛沙姆水溶液中，即得HSYA 納米粒（HSYA Nanoparticles，HSYA NPs）。

2.2 溶液的制備精密稱取10.0 mg HSYA 對(duì)照品置100 mL 棕色容量瓶中，加入25%甲醇溶液超聲溶解，冷卻后定容至刻度線，即得100 μg·mL-1HSYA對(duì)照品溶液；分別取1 mL 按“2.1”項(xiàng)下方法制備的空白NPs 溶液、HSYA NPs 溶液置10 mL 容量瓶中，加甲醇超聲破乳30 min，靜置過(guò)夜后，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得NPs陰性溶液和HSYA NPs樣品溶液。

2.3 HSYA 含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件[1]色譜柱：Hyperdil BDS C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）。流動(dòng)相，流動(dòng)相A：甲醇∶乙腈=13∶1；流動(dòng)相B：0.7%磷酸溶液；A∶B = 28∶72。流速：1.0 mL·min-1。檢測(cè)波長(zhǎng)：403 nm。柱溫：30 ℃。進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 專屬性考察 取“2.2”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液、陰性溶液及NPs樣品溶液按“2.3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定。由圖1 可知，陰性溶液在HSYA 保留時(shí)間處未出現(xiàn)色譜峰，表明未干擾HSYA的測(cè)定。

圖1 羥基紅花黃色素A納米粒（HSYA NPs）的高效液相色譜圖Figure 1 HPLC chromatogram of hydroxysafflor yellow a nanoparticle（HSYA NPs）

2.3.3 線性關(guān)系考察 取“2.2”項(xiàng)下制備的HSYA 對(duì)照品溶液，用25%的甲醇溶液稀釋得0.05、0.5、1、25、50、100 μg·mL-1濃度的系列溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。以HSYA 濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r）。得方程為Y= 33.293X-0.819 2，r= 1。表明HSYA 在濃度為0.05～100 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取1、25、100 μg·mL-1的HSYA對(duì)照品溶液作為低、中、高濃度，按“2.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，各濃度分別連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)各濃度峰面積計(jì)算得RSD 分別為0.83%、0.75%、0.45%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下方法制備的樣品溶液，分別放在室溫下放置0，2、4、8、12、24 h，按“2.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定其峰面積，計(jì)算得RSD 為0.51%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.2”項(xiàng)下方法制備HSYA NPs 樣品溶液6 份，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果峰面積的RSD 為0.69%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 取9份已知濃度的HSYA NPs溶液，每份0.5 mL，分別加入相當(dāng)于樣品質(zhì)量濃度50%、100%、150%的對(duì)照品溶液，制成低、中、高質(zhì)量濃度樣品，每個(gè)濃度各3份。按照“2.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果回收率均在95%～105%之間，且RSD均小于0.7%，表明該方法回收率合格。

2.4 HSYA NPs 包封率及載藥量測(cè)定

2.4.1 包封率的測(cè)定 采用反透析法測(cè)定HSYA NPs包封率，量取5 mL 純水置于透析袋中密封，將透析袋放入100 mL 含有5%HSYA NPs 的水溶液中；以100 r·min-1恒溫磁力攪拌。分別于1、2、4、6、8、10、12 h從透析袋內(nèi)吸取1 mL溶液（透析袋中補(bǔ)加同溫同體積的純水），過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，按照“2.3.1”項(xiàng)下條件測(cè)定。測(cè)得10 h 后透析袋內(nèi)濃度不再增加，表明透析袋內(nèi)外游離藥量濃度平衡，故通過(guò)測(cè)定10 h時(shí)透析袋內(nèi)濃度計(jì)算HSYA游離藥量。精密移取HSYA NPs 混懸液1.0 mL 至10 mL 容量瓶中，加入甲醇超聲破乳，冷卻后定容至刻度線，靜置過(guò)夜，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，測(cè)定后計(jì)算得總藥量和包封率。包封率（%）=（總藥量－游離藥量）/總藥量×100%。

2.4.2 載藥量的測(cè)定 取一定量HSYA NPs 溶液置于稱量瓶中，真空冷凍干燥，得HSYA NPs 凍干粉。精密稱取適量HSYA NPs 凍干粉，并按照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液處理方法處理后進(jìn)樣，測(cè)定凍干粉中的總藥量，計(jì)算載藥量。載藥量=（總藥量/凍干粉凈質(zhì)量）×100%。

2.5 HSYA NPs 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)據(jù)前期單因素預(yù)試篩選出緩沖溶液pH 值（A）、PLGA 與藥物的質(zhì)量濃度比（B）、投藥量（C）、外水相濃度（D）、外水相體積（E）及超聲乳化時(shí)間（F）6 個(gè)因素及范圍；采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)（Plackett-Burman design，PBD）方法，以包封率（Y1）、粒徑（Y2）、PDI（Y3）、Zeta 電位（Y4）及載藥量（Y5）為響應(yīng)值，從6 個(gè)因素中篩選出3 個(gè)關(guān)鍵變量； 再通過(guò)Box-Behnken 設(shè)計(jì)（Box-Behnken design，BBD）法設(shè)計(jì)3 因素3 水平實(shí)驗(yàn)，獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果并確定最優(yōu)工藝處方。

2.5.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

2.5.1.1 PBD 因素及水平設(shè)計(jì) Plackett- Burman design 法是一種基于不完全平衡塊原理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，可利用最少實(shí)驗(yàn)次數(shù)評(píng)估一個(gè)因素的影響，并能夠在眾多因素中快速地篩選出最重要的因素，以供進(jìn)一步研究[18]。本實(shí)驗(yàn)以緩沖溶液pH 值（A）、PLGA 與藥物的質(zhì)量濃度比（B）、投藥量（C）、外水相濃度（D）、外水相體積（E）及超聲乳化時(shí)間（F）為考察因素，各因素設(shè)置2 個(gè)水平，分別用+1 和-1 表示，運(yùn)用Design-Expert 軟件設(shè)計(jì)。PBD 實(shí)驗(yàn)的因素水平見(jiàn)表1。

表1 羥基紅花黃色素A 納米粒PBD 實(shí)驗(yàn)的因素水平Table 1 The factor levels of PBD experiments for HSYA NPs

2.5.1.2 PBD 結(jié)果及分析 PBD 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。利用Design-Expert 軟件進(jìn)行分析，納米粒包封率、粒徑、PDI、電位、載藥量方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3～表7。各模型P＜0.05，表明模型差異均顯著，其中因素A、B、C、F 對(duì)包封率影響顯著（P＜0.05）；B、C對(duì)粒徑和PDI影響顯著（P＜0.05）；A、C對(duì)電位影響顯著（P＜0.05）；B、D 對(duì)載藥量影響顯著（P＜0.05）。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取緩沖溶液pH（A）、PLGA與藥物的質(zhì)量濃度比（B）、投藥量（C）為BBD 實(shí)驗(yàn)的影響因素，做進(jìn)一步考察。

表2 羥基紅花黃色素A 納米粒PBD 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the PBD experiments for HSYA NPs

表3 羥基紅花黃色素A 納米粒包封率方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 3 ANOVA and significance test of rate for HSYA NPs

表4 羥基紅花黃色素A 納米粒粒徑方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 4 ANOVA and significance test of particle size for HSYA NPs

表5 羥基紅花黃色素A 納米粒PDI 方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 5 ANOVA and significance test of PDI for HSYA NPs

表6 羥基紅花黃色素A 納米粒Zeta 電位方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 6 ANOVA and significance test of Zeta potential for HSYA NPs

表7 羥基紅花黃色素A 納米粒載藥量方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 7 ANOVA and significance test of nanoparticle drug loading for HSYA NPs

2.5.2 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

2.5.2.1 BBD 實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素和PBD 實(shí)驗(yàn)確定實(shí)驗(yàn)因素和水平，采用3 因素3 水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)評(píng)價(jià)各因素水平對(duì)HSYA NPs 的影響，優(yōu)選出最佳制備工藝。BBD設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的因素水平見(jiàn)表8。

2.5.2.2 BBD 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將緩沖溶液pH（A）、PLGA 與藥物的質(zhì)量濃度比（B）、投藥量（C）3 個(gè)因素為自變量，以包封率（Y1）、粒徑（Y2）、PDI（Y3）、Zeta 電位（Y4）及載藥量（Y5）的總評(píng)歸一值（overall desirability，OD）為響應(yīng)值[19]。其中Y1、Y5以及Y4的絕對(duì)值越大越好，故選用di =（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）；Y2、Y3值越小越好，故選用di =（Ymax-Yi）/（Ymax-Ymin）。其中di為歸一值，OD=（d1×d2…×dk）1/k。BBD實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 羥基紅花黃色素A 納米粒BBD 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 9 Results of the BBD experiments for HSYA NPs

2.5.2.3 BBD 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 利用Design-Expert 軟件對(duì)BBD 結(jié)果進(jìn)行多元二次回歸方程擬合及方差分析，結(jié)果見(jiàn)表10。OD 值對(duì)各因素的多元二次回歸模型方程為OD=13.017 9A+0.174 4B-0.925 8C-0.007 6AB+0.216 6AC+0.048 7BC+0.249 5A2-0.020 1B2-0.161 1C2，R2=0.917 1，模型P＜0.01，表明各因素之間具有良好的相關(guān)性，且模型具有顯著性意義；缺失項(xiàng)F值為0.977 2，P值為0.486 8（P＞0.05），表明擬合程度良好，可信度高，能夠真實(shí)反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表10 羥基紅花黃色素A 納米粒BBD 實(shí)驗(yàn)方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 10 ANOVA and significance test of BBD experiments for HSYA NPs

三維響應(yīng)面圖和等高線圖見(jiàn)圖2。其可直觀評(píng)價(jià)各因素對(duì)OD 值的影響，緩沖溶液pH（A）、投藥量（C）、PLGA 與藥物的質(zhì)量濃度比（B）的響應(yīng)面圖陡峭，表明各因素對(duì)OD 值均有顯著影響；此外，A 與B、B 與C 交互的響應(yīng)面陡峭，表明緩沖溶液pH 和PLGA 與藥物的質(zhì)量濃度比、PLGA 與藥物的質(zhì)量濃度比和投藥量對(duì)OD 值影響明顯。由多元二次回歸模型預(yù)測(cè)最優(yōu)工藝處方為pH=6.95，載體與藥物比=6.5∶1，投藥量=2.8 mg。

圖2 羥基紅花黃色素A 納米粒等高線圖和三維響應(yīng)面Figure 2 3D response surface and contour plots for HSYA NPs

2.5.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)BBD 優(yōu)選出的最佳工藝處方，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備HSYA NPs，平行3 份。測(cè)得其平均粒徑為（176.4±1.29）nm，平均PDI為（0.152±0.014），平均Zeta電位為（-17.6±0.46）mV，平均包封率為（78.5±0.49）%，平均載藥量為（7.3±0.07）%。OD 值為0.560 1，與預(yù)測(cè)值方差相差小于5%，表明模型預(yù)測(cè)性良好，優(yōu)化方法可行。

2.6 納米粒表征

2.6.1 粒徑與Zeta 電位 分別取“2.1”項(xiàng)下制備的樣品1 mL，用去離子水稀釋至5 mL，取適量于激光粒度分析儀測(cè)定其粒徑、PDI、Zeta 電位。測(cè)得HSYA NPs 平均粒徑為176.4 nm，PDI 為0.152，Zeta電位為-17.6 mV，表明HSYA NPs 混懸液粒徑大小適宜，分散性及穩(wěn)定性良好。見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 羥基紅花黃色素A 納米粒粒徑分布圖Figure 3 Particle size distribution map of HSYA NPs

圖4 羥基紅花黃色素A 納米粒電位圖Figure 4 Zeta potential of map HSYA NPs

2.6.2 HSYA NPs 形態(tài)觀察 HSYA NPs 呈帶有乳光的亮黃色，無(wú)沉淀及絮凝現(xiàn)象，如圖5-A 所示。取10 μL HSYA NPs 滴加于銅網(wǎng)上，滴加10 μL 醋酸雙氧鈾，干燥后以80～120 kV 進(jìn)行電鏡檢測(cè)成像。結(jié)果如圖5-B所示，納米粒形態(tài)圓整，大小均一，無(wú)粘連現(xiàn)象，與“2.6.1”粒徑測(cè)定結(jié)果一致。

圖5 羥基紅花黃色素A 納米粒形態(tài)圖Figure 5 Morphology chart of HSYA NPs

2.6.3 HSYA NPs X射線衍射分析 分別將HSYA原料藥（A）、空白NPs（B）、HSYA NPs（C）干燥粉末樣品置于載玻片上，在Cu-Kα 射線光源下，以2°/min 在5～90°范圍內(nèi)掃描，使用X 射線衍射儀進(jìn)行測(cè)試。由圖6 可知，HSYA 原料藥在8.05°、12.07～14.93°、17.08°處有明顯的衍射峰，HSYA NPs 在此度數(shù)下無(wú)衍射峰，而同空白NPs 在19.25°、22.63°處表現(xiàn)出相同的衍射峰，說(shuō)明HSYA已被材料包裹。

圖6 羥基紅花黃色素A 納米粒X-射線衍射譜圖Figure 6 X-ray diffraction graph of HSYA NPs

2.6.4 HSYA NPs紅外光譜分析 分別取HSYA原料藥（A）、空白NPs（B）、HSYA NPs（C）樣品，紅外光譜儀在波數(shù)為4 000～400 cm-1處，采集樣品的紅外光譜。由圖7可知，HSYA原料藥在3 391.63 cm-1處有一個(gè)-OH 的伸縮振動(dòng)峰，且在1 425.25、1 517.13 cm-1處有雙鍵的伸縮振動(dòng)峰，提示酚羥基的存在，而HSYA NPs 在此處吸收峰明顯減弱接近消失；此外，HSYA NPs 在2 887.397、1 759.59、1 111.13 cm-1處分別表現(xiàn)出與空白NPs相同C-H、C=O、C-O-C 的伸縮震動(dòng)吸收峰，表明HSYA 成功被載體包裹，HSYA NPs制備成功。

圖7 羥基紅花黃色素A 納米粒傅里葉紅外光譜圖Figure 7 Fourier transform infrared graph of HSYA NPs

2.7 納米粒穩(wěn)定性考察

2.7.1 4 ℃儲(chǔ)存穩(wěn)定性考察 將HSYA NPs 混懸液置于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存，分別于1、3、5、7、9、11、13、15、20、25、30 d 取樣，測(cè)定其粒徑、PDI 及Zeta 電位，考察HSYA NPs 在4 ℃條件下的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。見(jiàn)表11。HSYA NPs 在4 ℃放置30 d 內(nèi)，粒徑、PDI、Zeta 電位均無(wú)明顯變化，表明納米粒4 ℃儲(chǔ)存穩(wěn)定性良好。

表11 羥基紅花黃色素A 納米粒儲(chǔ)存穩(wěn)定性（±s，n=3）Table 11 Storage stability of HSYA NPs（±s，n=3）

表11 羥基紅花黃色素A 納米粒儲(chǔ)存穩(wěn)定性（±s，n=3）Table 11 Storage stability of HSYA NPs（±s，n=3）

時(shí)間/d 135791 1 13 15 20 25 30粒徑/nm 183.43±6.18 181.08±7.36 180.80±5.43 177.57±7.47 184.00±9.80 185.22±0.56 183.36±7.39 177.54±5.51 181.54±9.32 176.32±6.43 177.83±5.48 PDI 0.136±0.014 0.133±0.012 0.135±0.022 0.136±0.012 0.112±0.010 0.153±0.020 0.126±0.021 0.143±0.035 0.157±0.007 0.160±0.038 0.143±0.032 Zeta 電位/mV-20.09±1.39-19.06±1.36-16.07±1.16-17.03±1.67-17.27±1.79-16.60±4.23-16.72±0.85-18.98±2.23-18.53±1.73-16.63±0.75-17.87±0.66

2.7.2 不同生理介質(zhì)中穩(wěn)定性考察 量取HSYA NPs混懸液1 mL 加入到4 mL PBS 中（n=3），37 ℃恒溫孵育，于0、1、3、5、7、9、12 h 時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定，觀察其粒徑和PDI 變化；同法考察HSYA NPs 在人工腸液、人工胃液中的穩(wěn)定性。由圖8可知，在不同生理介質(zhì)中孵育12 h，NPs 的粒徑、PDI 無(wú)明顯變化，表明HSYA NPs 在PBS、人工腸液、人工胃液中穩(wěn)定。

圖8 羥基紅花黃色素A 納米粒在不同生理介質(zhì)中的穩(wěn)定性（n=3）Figure 8 HSYA NPs stability in different physiological media of HSYA NPs

2.8 納米粒凍干保護(hù)劑篩選各取HSYA NPs 2 mL于西林瓶中，分別加入不同濃度的蔗糖、葡萄糖、海藻糖作為凍干保護(hù)劑，并設(shè)置空白對(duì)照組。首先將樣品置于-20 ℃冰箱冷凍6 h，隨后立即轉(zhuǎn)入-40 ℃冰箱冷凍12 h，最后置于真空冷凍干燥機(jī)中冷凍至完全干燥，加入2 mL去離子水復(fù)溶，測(cè)定粒徑、PDI以及Zeta 電位。結(jié)果表明，加入1%的葡萄糖保護(hù)劑凍干后樣品的粒徑、PDI、Zeta 電位均優(yōu)于未加凍干保護(hù)劑的樣品，且凍干粉外觀飽滿，色澤一致，故可選用1%葡萄糖作為NPs的凍干保護(hù)劑。見(jiàn)表12。

表12 凍干保護(hù)劑對(duì)羥基紅花黃色素A 納米粒的影響（±s，n=3）Table 12 Effects of lyophilized protectants on HSYA NPs（±s，n=3）

表12 凍干保護(hù)劑對(duì)羥基紅花黃色素A 納米粒的影響（±s，n=3）Table 12 Effects of lyophilized protectants on HSYA NPs（±s，n=3）

凍干保護(hù)劑空白對(duì)照蔗糖葡萄糖海藻糖蔗糖葡萄糖海藻糖蔗糖葡萄糖海藻糖濃度/%-111555 10 10 10粒徑/nm 252.30±5.37 427.27±21.15 178.57±0.80 318.73±7.34 224.10±3.93 290.77±2.68 335.57±4.36 279.57±5.08 285.67±6.30 287.53±2.75 PDI 0.268±0.001 0.577±0.153 0.124±0.028 0.272±0.021 0.202±0.032 0.248±0.007 0.256±0.017 0.211±0.017 0.184±0.021 0.154±0.028 Zeta 電位/mV-15.8±1.04-15.77±0.32-18.33±1.10-18.17±1.69-15.83±0.15-13.47±1.15-12.60±0.43-12.43±1.01-10.80±0.20-17.42±0.62

2.9 體外釋放實(shí)驗(yàn)取HSYA 原料藥溶液和HSYA NPs 溶液各2 mL 置于透析袋中封閉，以100 mL pH7.4 的磷酸緩沖液為透析介質(zhì)，將透析袋放入透析介質(zhì)中，于37 ℃恒溫水浴，100 r·min-1條件下動(dòng)態(tài)透析，每組平行3 份。于0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48 h 時(shí)間點(diǎn)取樣，過(guò)0.22 μm 濾膜，HPLC 法測(cè)定每組HSYA 濃度。以累計(jì)釋放率為縱坐標(biāo)，釋放時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制釋放曲線，并擬合釋藥動(dòng)力學(xué)模型方程。

體外釋放結(jié)果顯示，HSYA 原料藥組在12～24 h時(shí)間段累計(jì)釋放率已達(dá)到100%，表明原料藥釋放完全；而HSYA NPs 組在12 h 時(shí)累計(jì)釋放率僅為69%，48 h體外釋放率為85%，且仍在持續(xù)緩慢釋放，表明將HSYA 制成納米粒后能延長(zhǎng)藥物釋放時(shí)間，具有緩釋作用。見(jiàn)圖9。擬合釋藥動(dòng)力學(xué)模型方程結(jié)果顯示，HSYA NPs 釋放規(guī)律符合一級(jí)釋藥動(dòng)力學(xué)模型。見(jiàn)表13。

表13 羥基紅花黃色素A 納米粒釋藥動(dòng)力學(xué)方程和相關(guān)系數(shù)Table 13 Pharmacokinetic equations and correlation coefficients of HSYA NPs

圖9 羥基紅花黃色素A 納米粒的體外釋放曲線（n=3）Figure 9 In vitro release profile of HSYA NPs（n=3）

3 討論

本研究以PLGA 為載體，利用復(fù)乳法制備羥基紅花黃色素A納米粒（HSYA NPs），通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)成功篩選出緩沖溶液pH、PLGA與藥物的質(zhì)量濃度比、投藥量3 個(gè)變量作為Box-Behnken 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的影響因素，以包封率、粒徑、PDI、Zate 電位及載藥量的OD 值為響應(yīng)值，通過(guò)三維響應(yīng)面曲線分析3 個(gè)自變量的組合交互與OD 值響應(yīng)之間的關(guān)系，觀察自變量的交互作用對(duì)OD 值的影響，并進(jìn)行多元二次回歸擬合及方差分析預(yù)測(cè)每個(gè)變量的最大OD 值和自變量交互作用下的最佳水平。結(jié)果得出最優(yōu)工藝處方為：pH 為6.95，載體與藥物比為6.5∶1，投藥量為2.8 mg。用該工藝處方制備出的HSYA NPs 與BBD 實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)的OD 值接近，方差相差小于5%，模型預(yù)測(cè)性好。HSYA NPs 表征、穩(wěn)定性考察和體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HSYA NPs 的制備工藝穩(wěn)定可靠，在PBS、人工腸液、人工胃液中穩(wěn)定，具有一定緩釋作用。

由HSYA NPs 4 ℃儲(chǔ)存穩(wěn)定性考察結(jié)果可知，納米粒在4 ℃環(huán)境下存放30 d 內(nèi)粒徑、PDI 及Zeta 電位均無(wú)明顯變化，穩(wěn)定性良好。但長(zhǎng)期以懸浮液的形式存放會(huì)發(fā)生聚集、藥物過(guò)早泄漏、藥物的變性、水解等現(xiàn)象[20]。研究[21]表明可通過(guò)冷凍干燥技術(shù)將納米粒制劑干燥成固體形態(tài)，可提高藥物的穩(wěn)定性，從而延長(zhǎng)納米粒藥物的儲(chǔ)存保質(zhì)期。在凍干過(guò)程中，由于機(jī)械應(yīng)力、局部濃度增加、表面脫水等情況，可導(dǎo)致納米粒的不可逆聚集。為了減少或者避免冷凍干燥過(guò)程中的不可逆聚集，可在待冷凍的混懸溶液中加入凍干保護(hù)劑。本研究對(duì)不同濃度的多種凍干保護(hù)劑進(jìn)行了考察，最終發(fā)現(xiàn)以1%的葡糖糖為凍干保護(hù)劑，冷凍干燥后凍干粉外觀飽滿，色澤一致；且再分散性好，復(fù)溶后粒徑較小，能有效保護(hù)HSYA NPs 不被聚集。葡萄糖能夠保護(hù)納米粒的原因可能是葡萄糖可與納米粒的極性基團(tuán)形成氫鍵，在膜界面代替失去的水，作為納米粒的穩(wěn)定劑，在凍干的過(guò)程中保護(hù)納米粒的微觀結(jié)構(gòu)[22]。

研究HSYA 新型納米制劑，開(kāi)發(fā)出穩(wěn)定且可靠的HSYA 藥物傳遞系統(tǒng)，在提高HSYA 化學(xué)穩(wěn)定性和生物利用度，以及選擇性地將HSYA 靶向到疾病部位具有巨大的潛力。本研究以PLGA 為載體制備的HSYA NPs粒徑大小適宜，分散均勻，穩(wěn)定性良好。但其載藥量偏低，這可能與PLGA 對(duì)親水性藥物的裝載能力有關(guān)，故提高PLGA 的載藥量是未來(lái)研究的關(guān)鍵問(wèn)題之一[23]；目前僅對(duì)納米粒制備部分進(jìn)行研究，后續(xù)將對(duì)其在體內(nèi)的安全性、口服生物利用度以及細(xì)胞、動(dòng)物水平的藥效作用進(jìn)行研究，為HAYA NPs的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。