基于“肺主皮毛”理論在歷代古方中挖掘最具美白祛斑潛力中藥“二白一辛”

蘇琳，鄔宗周，余茜，鄒純樸，覃悅，張曉宇，朱楊壯壯，陳曉，胥孜杭（.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 003；.上海市皮膚病醫(yī)院，上海 00050）

“肺主皮毛”理論首見于《素問·痿論》，其高度概括了肺與皮毛的諸多關(guān)聯(lián)，肺的宣發(fā)衛(wèi)氣及輸布精微的功能是維持皮膚正常生理功能的基礎(chǔ)，而皮膚的狀態(tài)往往能夠提示肺受邪毒的內(nèi)在情況，所以不論是古籍醫(yī)案還是現(xiàn)代臨床，都不乏從肺論治皮膚的記載[1-3]。

中醫(yī)藥美白祛斑具有悠久的歷史和豐富的內(nèi)涵，在現(xiàn)存最早的方書《五十二病方》中，就收錄了祛疣除瘢、美容外用方。隨后在宋元、明清時(shí)期，美白祛斑方藥得以進(jìn)一步發(fā)展，如一直沿用至今的《太平圣惠方》中的“七白膏”、《醫(yī)宗金鑒·外科心法要訣》中的“玉容散”等，方中常用入肺經(jīng)及祛風(fēng)藥如白芷、白附子、細(xì)辛、白及、辛夷等，以期美白祛斑，依循了“肺主皮毛”理論，其功效更受到了現(xiàn)代科學(xué)的驗(yàn)證與肯定。但繁博的美白祛斑方至今尚未有深入挖掘和系統(tǒng)的整理，其用藥規(guī)律及核心藥物的美白祛斑機(jī)制是否遵循了“肺主皮毛”理論，還有待探索和驗(yàn)證。故本文對(duì)古籍中美白祛斑方挖掘整理，并基于“肺主皮毛”理論，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物學(xué)研究方法對(duì)美白祛斑方中核心藥物的機(jī)制加以探索，以期探究美白方的用藥規(guī)律，借助系統(tǒng)生物學(xué)豐富“肺主皮毛”理論在美白祛斑方中的科學(xué)內(nèi)涵。

1 資料與方法

本研究的思路與方法示意圖見圖1。

圖1 研究思路及方法示意圖Figure 1 Schematic diagram of the research idea and methodology

1.1 數(shù)據(jù)收集分別以面光白、面光潤、面光悅、面光澤、面光潤、面光如鏡、面白如玉、面白如脂、面黑令白、白凈如玉、令人面白；面皯、面皯、面皯黯、面多皯、面生皯、除皯、面生黑皯皰、面?皰、?、面黑皯、黧黑斑、黧黑皯、面塵、面皯、雀斑、面生黑斑等為關(guān)鍵詞，輸入《中華醫(yī)典》進(jìn)行全面檢索。 納入含有中藥組方或方名的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)；剔除無方無藥、組方以及出處不詳、重復(fù)出現(xiàn)者后，共得到相關(guān)文獻(xiàn)194 篇，其中外用171 篇；內(nèi)服23 篇，后續(xù)研究以外用方為主。

1.2 數(shù)據(jù)整理分析依據(jù)《中華人民共和國藥典》《中華本草》將藥物名稱進(jìn)行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化處理，同一藥材源自不同用藥部位、同一藥材的不同炮制品種給予保留。

1.3 數(shù)據(jù)分析采用Excel 2021 對(duì)每個(gè)方劑的來源、功效、組方配伍、用藥數(shù)量分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。運(yùn)用IBM SPSS Modeler 18.0 軟件中關(guān)聯(lián)規(guī)則Apriori 算法對(duì)高頻藥物進(jìn)行藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，將最低支持度設(shè)定為10%，最小置信度為80%，最大前項(xiàng)數(shù)為5，按藥物組合出現(xiàn)頻數(shù)進(jìn)行排序。

1.4 美白祛斑方核心中藥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.4.1 化學(xué)成分篩選 檢索Symmap（http：//www.sym?map.org/）[4]、 TCMSP（https：//old.tcmsp- e.com/tcmsp.php[5]、 TCMID（http：//www.megabionet.org/tcmid）[6]、TCM-ID（http：//bidd.nus.edu.sg/group/TCMsite/）[7]數(shù)據(jù)庫中中藥的化學(xué)成分，通過PubChem（https：//pub?chem.ncbi.nLm.nih.gov/）獲取成分的Canonical SMILES，通過Swiss ADME（http：//www.swissadme.ch/index.php）對(duì)活性成分進(jìn)行篩選。

1.4.2 藥物與疾病靶點(diǎn)獲取 通過Swiss Target Predic?tion（http：//www.swisstargetprediction.ch/）平臺(tái)對(duì)“二白一辛”中藥活性成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，篩選ProbabiLity≥0 的靶點(diǎn)，并使用UniProt（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。以“skin whit?ening”（皮膚美白）、“skin pigmentation”（皮膚色素沉著）、“melasma/chloasma”（黃褐斑）、“freckle re?moving”（祛斑）、“photoaging”（光老化）、“melanin synthesis”（黑色素合成）、“melanin transport”（黑色素運(yùn)輸）、“melanin degradation”（黑色素降解）、“an?tioxidant”（抗氧化）為關(guān)鍵詞，分別檢索Genecards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www.omim.org/）和DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫獲得目標(biāo)靶點(diǎn)并導(dǎo)入Excel，篩選關(guān)聯(lián)性≥10 的靶點(diǎn)，得到美白祛斑靶點(diǎn)1 268個(gè)。

1.4.3 交集靶點(diǎn)獲取及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將“1.4.2”項(xiàng)下的靶點(diǎn)導(dǎo)入 Eveen（http：//www.ehbio.com/test/venn/），得到交集靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)上傳至STRING（https：//cn.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，設(shè)置信度＞0.400，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）；導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件中規(guī)范PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，收集度值（Degree值）≥10的靶點(diǎn)。

1.4.4 GO 功能及KEGG 通路富集分析 將Degree≥10 的交集靶點(diǎn)上傳至Metascape（https：//metascape.org/）中，進(jìn)行GO 和KEGG 生物富集分析并對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.4.5 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò) 根據(jù)“1.4.4”項(xiàng)下的靶點(diǎn)，反向查找“1.4.2”項(xiàng)下的活性成分，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件中構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò)圖，計(jì)算Degree值。

1.4.6 安全性預(yù)測(cè) 將上述Degree 值排前30位的成分通過化合物成分預(yù)測(cè)網(wǎng)站Pro Tox-II（https：//tox-new.charite.de/protox_II/）進(jìn)行半數(shù)致死量［LD50（mg·kg-1）］和安全等級(jí)分析：Ⅰ級(jí)（致命毒；LD50≤5）、Ⅱ級(jí)（有毒；5＜LD50≤50）、Ⅲ級(jí)（有毒；50＜LD50≤300）、Ⅳ級(jí)（可能有毒；300＜LD50≤2 000）、Ⅴ級(jí)（可能有毒；2 000＜LD50≤5 000）、Ⅵ級(jí)（無毒；LD50＞5 000）。

非計(jì)劃拔管的發(fā)生有醫(yī)生、病人、管理、環(huán)境等多方面的主、客觀因素,準(zhǔn)確評(píng)估患者的各種導(dǎo)管,采取正確的固定方法、充分有效的溝通、適度鎮(zhèn)靜和約束管理,積極開展醫(yī)護(hù)一體化和加速康復(fù)外科,可以有效預(yù)防并減少非計(jì)劃性拔管的發(fā)生,保證患者安全。

1.4.7 分子對(duì)接 將上述Dgree 值排前30 位的靶點(diǎn)在PDB（https：//www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫中檢索酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（TYRP1）蛋白結(jié)構(gòu)，在PubChem（https：//pubchem.ncbi.nLm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫獲取化合物的SDF格式文件，使用PyMol軟件對(duì)靶點(diǎn)清除水分子和小分子配體，用AutoDock Tools 進(jìn)行加氫與電荷處理。利用PyRx軟件進(jìn)行分子對(duì)接，計(jì)算結(jié)合能。

1.5 美白祛斑實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.5.1 細(xì)胞株、藥物和試劑 人黑色素瘤細(xì)胞A375購自中科院上海細(xì)胞庫。α-促黑激素（α-MSH）、大黃酚、沒食子酸、咖啡酸，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)分別為：S48622、B20238、B20851、B20660；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、胰蛋白酶，上海億澤豐生物科技有限公司，批號(hào)分別為：YBM-D、YS-FB500B、RA-10；MTT，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ST316。

1.5.2 儀器 A2 生物安全柜、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo 公司；CKX41 顯微鏡，日本Olympus 公司；5810R 臺(tái)式多功能冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；SpectraMax190 型酶標(biāo)儀，美國Molecular公司。

1.5.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375 細(xì)胞接種到96孔板中，細(xì)胞密度為每孔2×103個(gè)，過夜后更換為含藥培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入5 mg·mL-1MTT試劑10 μL，繼續(xù)孵育4 h。棄上清，加入二甲亞砜（DMSO），振搖數(shù)次充分溶解紫色結(jié)晶，使用酶標(biāo)儀在570 nm 處測(cè)定吸光度值。

1.5.4 黑色素含量檢測(cè) 按每孔2×105個(gè)將A375 細(xì)胞鋪于6 孔板，過夜后除正常對(duì)照組外，每孔加入1 μmol·mL-1α-MSH 刺激24 h，用不同濃度的大黃酚、沒食子酸或咖啡酸處理細(xì)胞48 h。收獲細(xì)胞并用PBS洗滌兩次，用含10% DMSO的1 mol·L-1NaOH重懸，在80 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀在405 nm 處檢測(cè)吸光度值。

1.5.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，所得結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)性的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白芷、白附子、細(xì)辛在美白祛斑方用藥中頻數(shù)最高經(jīng)檢索，《中華醫(yī)典》中古代涉及美白祛斑的有效方劑共194 首，其中外用方劑共171 首，涉及261 味藥物，中藥出現(xiàn)總頻數(shù)為1 309 次，其中出現(xiàn)頻數(shù)≥10 次的藥物共計(jì)33 味，使用最多的前3 位中藥分別為白芷、白附子、細(xì)辛；其中，歸肺經(jīng)的中藥共計(jì)16味，在頻數(shù)≥10次的藥物中約占50%，結(jié)果見表1。

表1 美白祛斑方中藥物使用頻數(shù)（頻數(shù)≥10 次）Table 1 The frequency of Chinese medicinals used in whitening and freckle-removing external prescriptions（≥10 times）

2.2 辛溫、肺經(jīng)藥物在美白祛斑方中最常用見圖2。對(duì)美白祛斑方中的261 味中藥進(jìn)行藥味、藥性、歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，辛、溫、歸肺經(jīng)的藥物占比最高。

圖2 美白祛斑方中藥物的藥味、藥性和歸經(jīng)Figure 2 The flavors，properties and meridian tropism of Chinese medicinals in whitening and freckle-removing external prescriptions

表2 美白祛斑方中藥物組合關(guān)聯(lián)規(guī)則TabLe 2 Association rules of Chinese medicinals combination in whitening and freckle-removing external prescriptions

圖3 美白祛斑用藥關(guān)聯(lián)規(guī)則網(wǎng)絡(luò)展示圖Figure 3 Network display of the association rules for whitening and freckle-removing external prescriptions

2.4 古方挖掘中最具美白祛斑潛力中藥“二白一辛”的美白祛斑功能驗(yàn)證

2.4.1 “二白一辛”的成分、靶點(diǎn)及與現(xiàn)代美白祛斑靶點(diǎn)的交集 通過Symmap、TCMSP、TCMID、TCMID 數(shù)據(jù)庫對(duì)美白祛斑方中用藥頻數(shù)最高的白芷、白附子和細(xì)辛的有效成分進(jìn)行檢索，并通過SwissADME 對(duì)活性成分進(jìn)行篩選。分別通過Swiss Target Prediction 獲取上述活性成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，得到白芷995 個(gè)、白附子357 個(gè)、細(xì)辛820 個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，將其與美白淡斑相關(guān)的1 268 個(gè)靶點(diǎn)取交集，獲得白芷155個(gè)、白附子59個(gè)、細(xì)辛127個(gè)交集靶點(diǎn)。見圖4。

圖4 美白祛斑方中高頻中藥白芷、白附子、細(xì)辛靶點(diǎn)與美白祛斑靶點(diǎn)的韋恩圖Figure 4 Venn diagram of targets of high frequently used Chinese medicinals （Angelica Dahuricae Raix，Typhonii Rhizoma，Asari Radix et Rhizoma）in the whitening and freckle-removing external prescriptions and target of whitening and freckle-removing

2.4.2 “二白一辛” 美白祛斑關(guān)鍵靶點(diǎn) 通過STRING對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行分析，并通過Cytoscape 3.8.2 整理PPI 互作網(wǎng)絡(luò)，計(jì)算Degree 值，并根據(jù)Degree 值對(duì)靶點(diǎn)排序，節(jié)點(diǎn)越大越靠近中心的靶點(diǎn)Degree 值越高，白芷美白祛斑的關(guān)鍵靶點(diǎn)有TP53、AKT1、ALB 等；白附子美白祛斑的關(guān)鍵靶點(diǎn)有EGFR、JUN、STAT3等；細(xì)辛美白祛斑的關(guān)鍵靶點(diǎn)有ALB、AKT1、EGFR等（圖5）。

圖5 美白祛斑方中高頻中藥白芷、白附子、細(xì)辛美白祛斑靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Figure 5 PPI network of whitening and freckle-removing target for high frequently used Chinese medicinals（Angelica Dahuricae Raix，Typhonii Rhizoma，Asari Radix et Rhizoma）in the whitening and freckle-removing external prescriptions

現(xiàn)代研究表明，抑癌基因TP53 可保護(hù)皮膚成纖維細(xì)胞免受紫外線等因素造成的DNA 損傷而引發(fā)凋亡[8-9]；表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）能夠結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子以促進(jìn)表皮細(xì)胞及全層皮膚組織的細(xì)胞增殖，上調(diào)皮膚細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸和糖蛋白[10]，合理調(diào)整皮膚結(jié)構(gòu)，延緩皮膚衰老；白蛋白（ALB）能夠促進(jìn)受損皮膚的修復(fù)[11]，維護(hù)皮膚黏膜的完整性。

2.4.3 “二白一辛”美白祛斑生物富集分析 將上述Degree 值≥10 的交集靶點(diǎn)提交至Metascape，進(jìn)行GO（Gene Ontology）功能注釋及富集分析，包括生物學(xué)過程（Biological Process，BP）、 細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）。“二白一辛”與美白祛斑相關(guān)的生物過程、細(xì)胞定位、分子功能密切相關(guān)：在生物學(xué)過程方面，白芷主要與細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)、對(duì)氧氣水平的反應(yīng)等有關(guān)；白附子主要與對(duì)激素的反應(yīng)、細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞活化等有關(guān)；細(xì)辛主要與細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)磷酸化、對(duì)氧氣水平的反應(yīng)等有關(guān)。在細(xì)胞組分方面，白芷主要與膜筏、受體復(fù)合物、黏著斑等有關(guān)；白附子主要與膜筏、受體復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物等有關(guān)；細(xì)辛主要與受體復(fù)合物、膜筏、黑素體等有關(guān)。在分子功能方面，白芷主要與蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)子結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚化活性等有關(guān)；白附子主要與核受體活性、磷酸酶結(jié)合、激酶結(jié)合等有關(guān)；細(xì)辛主要與蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、抗氧化活性等有關(guān)（圖6）。

圖6 美白祛斑方中高頻中藥白芷、白附子、細(xì)辛美白祛斑靶點(diǎn)GO 分析圖Figure 6 GO analysis diagram whitening and freckle-removing target for high frequently used Chinese medicinals（Angelica Dahuricae Raix，Typhonii Rhizoma，Asari Radix et Rhizoma）in the whitening and freckle-removing external prescriptions

圖7 KEGG 通路分析顯示，白芷主要與HIF-1 信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化、NF-κB 信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、黏著連接等有關(guān)；白附子主要與Th17 細(xì)胞分化、PI3K-Akt 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、長(zhǎng)壽信號(hào)通路等有關(guān)；細(xì)辛主要與Th17 細(xì)胞分化、黏著連接、鈣離子信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、谷胱甘肽代謝等有關(guān)。這些信號(hào)通路通過對(duì)氧氣的感知和反應(yīng)，皮膚免疫調(diào)節(jié)，皮膚細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多種途徑實(shí)現(xiàn)“二白一辛”的美白祛斑功效。

圖7 美白祛斑方中高頻中藥白芷、白附子、細(xì)辛美白祛斑靶點(diǎn)KEGG 分析氣泡圖Figure 7 KEGG analysis bubble diagram of whitening and freckle-removing target for high frequently used Chinese medicinals（Angelica Dahuricae Raix，Typhonii Rhizoma，Asari Radix et Rhizoma）in the whitening and freckle-removing external prescriptions

2.4.4 “二白一辛”美白祛斑活性成分預(yù)測(cè) 根據(jù)上述Degree 值≥10 的交集靶點(diǎn)分別反向查找白芷、白附子、細(xì)辛中的活性成分，篩選出白芷153個(gè)、白附子18個(gè)、細(xì)辛155個(gè)與美白祛斑相關(guān)的活性成分，通過Cytoscape 3.8.2 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖8。計(jì)算Degree 并選取排前30 位的活性成分作為白芷、白附子、細(xì)辛的潛在美白祛斑活性成分，評(píng)估有效成分的安全性并與黑色素形成核心蛋白酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（TYRP1）進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見表3。

表3 美白祛斑方中高頻中藥白芷、白附子、細(xì)辛美白祛斑相關(guān)活性成分預(yù)測(cè)Table 3 Prediction of active compounds of high frequently used Chinese medicinals（Angelica Dahuricae Raix，Typhonii Rhizoma，Asari Radix et Rhizoma）in the whitening and freckle-removing external prescriptions

圖8 美白祛斑方中高頻中藥白芷、白附子、細(xì)辛的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Figure 8 "Components-targets-pathways" network diagram of high frequently used Chinese medicinals（Angelica Dahuricae Raix，Typhonii Rhizoma，Asari Radix et Rhizoma）in the whitening and freckle-removing external prescriptions

2.4.5 “二白一辛”美白祛斑活性成分功效驗(yàn)證 根據(jù)“2.4.4”項(xiàng)下分子對(duì)接結(jié)果，“二白一辛” 與TYRP1結(jié)合最強(qiáng)的成分分別為大黃酚（Chrysophanol）、沒食子酸（Gallic Acid）和α-蓽澄茄油烯（Alpha-Cubebene），但由于α-蓽澄茄油烯的制備原料短缺，無法獲取，故選擇細(xì)辛中結(jié)合能排第2位的咖啡酸（Caffeic Acid）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，大黃酚、沒食子酸和咖啡酸對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞A375 的抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性。大黃酚24、48、72 h 的IC50分別為187.1、142.2、90.8 μmol·L-1；沒食子酸24、48、72 h 的IC50分別為111.5、50.0、29.2 μmoL·L-1；咖啡酸24、48、72 h 的IC50分別為199.1、139.4、66.39 μmoL·L-1，見圖9。

圖9 白芷、白附子、細(xì)辛有效成分大黃酚、沒食子酸、咖啡酸對(duì)A375 的抑制作用Figure 9 Inhibitory effects on A375 of the active ingredients（chrysophanol，gallic acid and caffeic acid）of Angelica Dahurian Radix，Typhonii Rhizome and Asari Radix et Rhizoma

圖10 黑色素含量檢測(cè)顯示，大黃酚、沒食子酸和咖啡酸對(duì)α-促黑激素（α-MSH）誘導(dǎo)的A375的黑色素形成有一定抑制作用，其中，沒食子酸和咖啡酸在50 μmol·L-1時(shí)即對(duì)A375 的黑色素產(chǎn)生發(fā)揮有效抑制作用（P＜0.05）。

圖10 白芷、白附子、細(xì)辛有效成分大黃酚、沒食子酸、咖啡酸對(duì)A375 黑色素表達(dá)的抑制作用Figure 10 Inhibitory effects of the active ingredients（chrysophanol，gallic acid and caffeic acid） of Angelica Dahurian Radix，Typhonii Rhizome and Asari Radix et Rhizoma on the expression of A375 melanin

3 討論

3.1 “肺主皮毛”理論在歷代美白祛斑方藥中的體現(xiàn)“肺主皮毛”理論出自《素問·痿論》：“肺主身之皮毛”，是中醫(yī)“整體觀”的體現(xiàn)[12]，概括了肺與皮毛的聯(lián)系，對(duì)指導(dǎo)養(yǎng)護(hù)皮膚及防治皮膚病有重要意義?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究[13]證明，肺與皮毛均由外胚層發(fā)育而來，具有組織胚胎學(xué)同源性?；凇胺沃髌っ崩碚摚嗅t(yī)臨床常從肺論治皮膚?。旱詴韵枭朴们逶餄櫡沃ㄖ委熴y屑病、魚鱗病、老年性皮膚瘙癢、慢性濕疹等[14]；陳明嶺運(yùn)用“疏風(fēng)解表，清熱涼血”之法，選方簡(jiǎn)化消風(fēng)散加減以治療急性痘瘡樣苔蘚樣糠疹[15]；此外，麻黃[16]、桂枝[17]、白芷[18]、白附子[19]等歸肺經(jīng)或味辛入肺之藥及其有效成分也常運(yùn)用于皮膚類疾病的治療。但皮膚美白祛斑用藥規(guī)律是否也遵循“肺主皮毛”理論，還鮮有研究。

美白祛斑的中醫(yī)藥應(yīng)用已有兩千多年的歷史，醫(yī)案方藥繁多，如《備急千金要方》的面藥篇、《外臺(tái)秘要》的美容卷、《太平圣惠方》的治面皯諸方篇等。經(jīng)整理，在眾多美白祛斑方中，歸肺經(jīng)的藥物占比最多；而在出現(xiàn)頻率≥10 次的藥物中，歸肺經(jīng)的藥物更是占比近50%，這是從肺論治皮膚的直接體現(xiàn)。此外，在性味方面，辛味藥占比最多，《素問·宣明五氣》：“酸入肝，辛入肺……”辛能入肺，宣發(fā)肺氣，這也能提示“肺主皮毛”是美白祛斑用藥的理論依據(jù)，并進(jìn)一步指導(dǎo)臨床美白祛斑用藥性味的選擇。

3.2 “二白一辛”可能是最具美白祛斑活性的潛力中藥在所納入的美白祛斑方中，白芷、白附子和細(xì)辛是使用頻率最高的核心藥物，其中，白芷、白附子的美白祛斑功效古今皆有研究，如《神農(nóng)本草經(jīng)》記載白芷可“長(zhǎng)肌膚，潤澤，可作面脂”，這也是藥糊面脂劑型最早的記載；現(xiàn)代研究[20]證明，白芷中的香豆素類和揮發(fā)油具有抑制酪氨酸酶活性、抗氧化以及減少黑色素生成的作用，由于白芷中的呋喃香豆素等具有光敏性[18]，所以古方常在夜間涂面，從而減少其副作用的發(fā)生。白附子在《本草綱目》錄有“去面上諸風(fēng)百病。疵皯，酒和貼之，自落”之效，《本草經(jīng)集注》言其可治“面上百病”，經(jīng)實(shí)驗(yàn)[21]證實(shí)，白附子的提取物具有通過抑制酪氨酸酶美白祛斑的作用。

“二白”的研究報(bào)道證明了本古籍挖掘結(jié)果與現(xiàn)代科學(xué)驗(yàn)證的一致性，而“一辛”則是首次以美白祛斑為功效進(jìn)行古方及大數(shù)據(jù)分析。在本古籍文獻(xiàn)挖掘中發(fā)現(xiàn)，細(xì)辛在美白祛斑方中的應(yīng)用頻率僅次于白芷、白附子，七白膏、玉容散、玉屑面脂等效方皆佐以細(xì)辛，且現(xiàn)代數(shù)據(jù)分析證明細(xì)辛具有美白祛斑的潛力。那么，細(xì)辛及其有效化合物成分的美白祛斑功效及在配伍過程中是否具有提高白芷、白附子等美白祛斑中藥的作用，仍需進(jìn)一步結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)加以驗(yàn)證。

3.3 驗(yàn)證“二白一辛”的物質(zhì)基礎(chǔ)以豐富“肺主皮毛”理論的科學(xué)內(nèi)涵為了豐富基于“肺主皮毛”理論美白祛斑的科學(xué)內(nèi)涵，本研究基于古方挖掘，利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對(duì)最具美白祛斑潛力的“二白一辛”的美白祛斑作用加以驗(yàn)證。通過PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯Y選出白芷、白附子、細(xì)辛中的TP53、EGFR、ALB 等美白祛斑密切相關(guān)的核心靶點(diǎn)。GO及KEGG 生物富集分析提示了白芷、白附子、細(xì)辛美白祛斑可能與促進(jìn)表皮干細(xì)胞遷移、調(diào)節(jié)皮膚細(xì)胞的生長(zhǎng)及功能、抗氧化、調(diào)節(jié)黑色素代謝等美白相關(guān)通路有關(guān)?；诜肿訉?duì)接的結(jié)果，篩選出“二白一辛”有效成分大黃酚、沒食子酸和咖啡酸，通過分子生物學(xué)研究證明這些有效成分對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的增殖及黑色素產(chǎn)生的抑制作用。根據(jù)美白祛斑靶點(diǎn)所篩選得到的“二白一辛”有效成分，不僅規(guī)避了中藥成分復(fù)雜而導(dǎo)致的皮膚用藥安全性，更為基于“肺主皮毛”理論的臨床皮膚美容用藥和產(chǎn)學(xué)研結(jié)合提供了支持。

3.4 促進(jìn)多學(xué)科交叉合作方能最大程度發(fā)掘古方精華“守中醫(yī)之正，創(chuàng)醫(yī)學(xué)之新”，是推進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的要求，將中醫(yī)藥與現(xiàn)代科學(xué)交叉融合，培育中醫(yī)藥交叉學(xué)科，是實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的有力抓手。清華大學(xué)北京市中醫(yī)藥交叉研究所所長(zhǎng)李梢基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和定量分析方法，建立了中醫(yī)藥分子網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)航系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)生命科學(xué)積累的大數(shù)據(jù)為中醫(yī)藥所用，是多學(xué)科交叉的范例[22]。中醫(yī)古方繁博，唯有利用學(xué)科交叉合作才能最大程度挖掘精華[23]。作為拋磚引玉，本文即是古代文獻(xiàn)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子生物學(xué)的學(xué)科交叉運(yùn)用，而如何進(jìn)一步證明細(xì)辛等藥物及其有效成分的美白祛斑作用并服務(wù)于臨床還有待其他學(xué)科的研究補(bǔ)充：如利用藥劑學(xué)、材料化學(xué)等促進(jìn)藥物透皮吸收；利用中藥炮制學(xué)、藥物化學(xué)等減毒增效；利用臨床醫(yī)學(xué)驗(yàn)證美白祛斑療效等，從而實(shí)現(xiàn)多學(xué)科延伸，促進(jìn)中醫(yī)古方及理論的現(xiàn)代化應(yīng)用。

綜上，經(jīng)古方挖掘證明，美白祛斑方的用藥是“肺主皮毛”理論從肺論治皮膚病的體現(xiàn)，其核心藥物“二白一辛”在現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的驗(yàn)證下，得到了其美白祛斑作用的主要靶點(diǎn)、通路及潛在有效成分，基于學(xué)科交叉運(yùn)用，我們豐富了在美白祛斑用藥中“肺主皮毛”理論的科學(xué)內(nèi)涵。但由于中藥成分復(fù)雜，本研究?jī)H基于已有報(bào)道的化合物進(jìn)行分析，其完整的有效成分無法得到徹底的體現(xiàn)，所以無法充分剖析其美白祛斑的作用機(jī)制；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所得到的有效成分仍然有限，還需結(jié)合藥理學(xué)進(jìn)一步探索驗(yàn)證。但“二白一辛”，尤其是細(xì)辛及其活性成分，仍不失為美白祛斑的新型潛力用藥，值得深入探索。