高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器法測(cè)定復(fù)配消毒液中3種雙鏈季銨鹽的含量

睢超霞,袁 鵬,張文豪*,劉吉起,楊寧輝

(1.河南省醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,鄭州 451191;2.河南省疾病預(yù)防控制中心,鄭州 450003)

季銨鹽是一種陽(yáng)離子表面活性劑,可通過(guò)靜電力、氫鍵和疏水作用改變細(xì)胞膜通透性,抑制或破壞細(xì)胞內(nèi)生物氧化、呼吸代謝,從而使蛋白酶變性,在消毒領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。迄今為止,國(guó)際上已開發(fā)了四代季銨鹽消毒產(chǎn)品[1]：第一代是單鏈烷基二甲基芐基氯(溴)化銨,其中烷基鏈碳原子數(shù)為12～16時(shí)的殺菌效果最佳;第二代是在第一代產(chǎn)品的苯環(huán)或氨基上進(jìn)行取代反應(yīng)得到的衍生物;第三代是雙烷基二甲基氯(溴)化銨,其中雙烷基碳原子數(shù)為8～10時(shí)的殺菌效果最佳,其殺菌能力遠(yuǎn)高于單鏈季銨鹽的;第四代是第三代雙鏈季銨鹽與單鏈季銨鹽、聚六亞甲基雙胍、乙醇、戊二醛等消毒成分的復(fù)配產(chǎn)品,其殺菌效果較傳統(tǒng)的單配方季銨鹽消毒產(chǎn)品增強(qiáng)2～8倍,逐漸成為市場(chǎng)上的主流產(chǎn)品。

復(fù)配消毒液具有合成工藝簡(jiǎn)單、氣味小、對(duì)新型冠狀病毒殺滅效果好等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于新型冠狀病毒的預(yù)防性消毒[2]。為保障消毒效果,需要建立合適的檢測(cè)方法測(cè)定復(fù)配消毒液中雙鏈季銨鹽的含量。傳統(tǒng)的容量分析法(銀量法或四苯硼鈉法)常應(yīng)用于單配方消毒液中雙鏈季銨鹽含量的測(cè)定,而復(fù)配消毒液成分復(fù)雜,干擾多,采用該方法時(shí)得到的測(cè)定結(jié)果偏差較大[3]。液相色譜法采用分離后測(cè)定的模式,可用于復(fù)配消毒液成分的檢測(cè)[4]。文獻(xiàn)[5]和文獻(xiàn)[6]采用高效液相色譜法,以通用型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定消毒液中雙鏈季銨鹽的含量,缺點(diǎn)是線性范圍較窄,檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性較差;此外,蒸發(fā)光散射檢測(cè)器需要額外配備氮?dú)獍l(fā)生裝置,氣體壓力波動(dòng)易造成基線漂移或出現(xiàn)鬼峰。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]和離子色譜法[8]也應(yīng)用于季銨鹽含量的測(cè)定,但昂貴的儀器和復(fù)雜的操作限制了其在基層實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。示差折光檢測(cè)器是基層實(shí)驗(yàn)室普遍配備的通用型檢測(cè)器。因此,本工作提出了高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器法測(cè)定復(fù)配消毒液中二癸基二甲基氯化銨、二辛基二甲基氯化銨、辛基癸基二甲基氯化銨等3種雙鏈季銨鹽含量的方法,為復(fù)配消毒液中雙鏈季銨鹽化學(xué)成分的檢測(cè)提供方法參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀,配1260 Infinity II示差折光檢測(cè)器;CT15RE型高速離心機(jī);BP211D型電子天平;PB-10型酸度計(jì);PS3200型超聲波振蕩器;LL1C61型純水機(jī)。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：采用四硼酸鈉滴定法[9]測(cè)定二癸基二甲基氯化銨、辛基癸基二甲基氯化銨、二辛基二甲基氯化銨標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量分?jǐn)?shù),分別為97.2%,98.7%,98.3%;取102.9 mg二癸基二甲基氯化銨、101.3 mg辛基癸基二甲基氯化銨、101.7 mg二辛基二甲基氯化銨等3種雙鏈季銨鹽標(biāo)準(zhǔn)品,用流動(dòng)相溶解并定容至100 mL,配制成3種目標(biāo)物質(zhì)量濃度均為1 000 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于4 ℃冰箱保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列：分別取0.50,1.00,3.00,5.00,10.00 mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用流動(dòng)相稀釋并定容至10 mL,搖勻,配制成質(zhì)量濃度為50,100,300,500,1 000 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

二癸基二甲基溴化銨、辛基癸基二甲基氯化銨、二辛基二甲基氯化銨、丁烷磺酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品的純度均不小于98.0%;二癸基二甲基氯化銨標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于95.0%;乙腈為色譜純;試驗(yàn)用水為超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)。

1.2 儀器工作條件

Welchrom C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫30 ℃;流動(dòng)相為體積比70…30的乙腈-0.01 mol·L-1丁烷磺酸鈉溶液的混合溶液(pH 3.5),等度洗脫;流量1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量10.0 μL;示差折光檢測(cè)器,折射率單位(RIU)模式,溫度30 ℃。

1.3 試驗(yàn)方法

取5.0 mL復(fù)配消毒液樣品,用流動(dòng)相稀釋至50 mL,超聲10 min,靜置至室溫,用0.45 μm尼龍濾膜過(guò)濾,濾液按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。以色譜保留時(shí)間定性,標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)器

常見的單鏈季銨鹽,如十二烷基二甲基芐基溴化銨含有芐基基團(tuán)在260 nm附近出現(xiàn)芐基生色團(tuán)的特征紫外吸收峰(圖1中曲線1),因此采用液相色譜-紫外檢測(cè)器法可以測(cè)定單鏈季銨鹽的含量[10]。復(fù)配消毒液中常用的雙鏈季銨鹽有二癸基二甲基氯化銨、二癸基二甲基溴化銨、辛基癸基二甲基氯化銨、二辛基二甲基氯化銨等。以二癸基二甲基溴化銨為例,該化合物是飽和單鍵碳?xì)浠衔?只能產(chǎn)生σ→σ*躍遷,在紫外-可見光區(qū)沒有吸收峰(圖1中曲線2),也無(wú)熒光信號(hào),因此無(wú)法采用液相色譜-紫外檢測(cè)器法或熒光檢測(cè)器法進(jìn)行檢測(cè),需要選擇通用型檢測(cè)器。

1-十二烷基二甲基芐基溴化銨;2-二癸基二甲基溴化銨圖1 單鏈和雙鏈季銨鹽的紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 UV-Vis absorption spectra of single-chain and double-chain quaternary ammonium salts

復(fù)配消毒液中雙鏈季銨鹽的含量較高(質(zhì)量濃度大于1.0 g·L-1),無(wú)需采用靈敏度高、價(jià)格昂貴的蒸發(fā)光散射檢測(cè)器或質(zhì)譜檢測(cè)器。示差折光檢測(cè)器是根據(jù)物質(zhì)折射率的差異進(jìn)行測(cè)定,優(yōu)點(diǎn)是通用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便,適用于常量分析,并且價(jià)格便宜、普及性高,適宜在基層實(shí)驗(yàn)室推廣。因此,試驗(yàn)選擇采用示差折光檢測(cè)器測(cè)定雙鏈季銨鹽的含量。

2.1.2 流動(dòng)相

采用高效液相色譜法檢測(cè)時(shí),極性季銨鹽陽(yáng)離子在非極性C18色譜柱上不易被保留,易出現(xiàn)與樣品雜質(zhì)共流出的現(xiàn)象;同時(shí)季銨鹽陽(yáng)離子與色譜柱固定相表面殘存的帶負(fù)電荷的硅羥基相互作用,吸附在固定相表面,造成色譜峰拖尾。在流動(dòng)相中加入烷基磺酸鈉離子對(duì)試劑,使磺酸根陰離子基團(tuán)與季銨鹽陽(yáng)離子基團(tuán)結(jié)合形成電中性的離子對(duì),增加其在非極性固定相中的溶解度,增強(qiáng)極性離子的色譜保留,從而達(dá)到改善色譜分離效果的目的。因此,試驗(yàn)對(duì)比了丁烷磺酸鈉對(duì)二癸基二甲基溴化銨色譜保留行為的影響,結(jié)果如圖2所示。

圖2 丁烷磺酸鈉對(duì)二癸基二甲基溴化銨色譜保留行為的影響Fig.2 Effect of sodium butane sulfonate on chromatographic retention behavior of didecyl dimethyl ammonium bromide

由圖2可知：加入丁烷磺酸鈉離子對(duì)試劑后,二癸基二甲基溴化銨保留時(shí)間從6.35 min延長(zhǎng)到11.23 min,色譜峰拖尾現(xiàn)象消失。

試驗(yàn)以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為待測(cè)對(duì)象,通過(guò)比較峰形、分離度及噪聲等進(jìn)一步優(yōu)化流動(dòng)相。與甲醇相比,以乙腈為有機(jī)相時(shí),相同條件下噪聲信號(hào)更低。離子對(duì)試劑是表面活性劑,流動(dòng)相中離子對(duì)試劑的濃度一般為0.005～0.02 mol·L-1,濃度過(guò)高會(huì)對(duì)色譜柱固定相造成損傷;當(dāng)丁烷磺酸鈉濃度為0.01 mol·L-1時(shí),目標(biāo)物具有合適的保留時(shí)間,且峰形良好。一般C18色譜柱的酸度適用范圍為pH 2.0～10.0,弱酸環(huán)境有利于目標(biāo)物的分離,流動(dòng)相pH低于2.0時(shí)會(huì)造成色譜柱的損壞;當(dāng)流動(dòng)相酸度為pH 3.5時(shí),目標(biāo)物分離度較好。流動(dòng)相組成改變會(huì)影響物質(zhì)的折射率,采用示差折光檢測(cè)器時(shí)不適用于梯度洗脫;試驗(yàn)改變有機(jī)相與水相的比例, 觀察3種目標(biāo)物的保留時(shí)間和分離度; 當(dāng)有機(jī)相與水相體積比為70…30時(shí),3種目標(biāo)物可在15 min內(nèi)完全分離,并且分離度大于1.5。

綜上分析,試驗(yàn)最終選擇的流動(dòng)相為體積比70…30的乙腈-0.01 mol·L-1丁烷磺酸鈉溶液的混合溶液(pH 3.5)。

2.1.3 色譜柱、柱溫和檢測(cè)器溫度

試驗(yàn)分別考察了Welchrom C8(250 mm×4.6 mm,5 μm)和Welchrom C18兩種烷基色譜柱分離3種雙鏈季銨鹽的效果。結(jié)果表明,兩種色譜柱均能分離3種雙鏈季銨鹽,但Welchrom C18色譜柱的柱效更高。因此,試驗(yàn)選用Welchrom C18色譜柱。

示差折光檢測(cè)器的信號(hào)對(duì)溫度變化較敏感,這可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性。實(shí)驗(yàn)室溫度恒定為25 ℃,柱溫比室溫高時(shí)更易控制,但由于介質(zhì)的折射率隨溫度升高而降低,柱溫過(guò)高會(huì)導(dǎo)致靈敏度下降,因此試驗(yàn)設(shè)置柱溫為30 ℃。同時(shí),為避免檢測(cè)器溫度與柱溫差異較大造成信號(hào)偏差,試驗(yàn)選擇的檢測(cè)器溫度為30 ℃。

2.2 專屬性試驗(yàn)

按照儀器工作條件對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和戊二醛復(fù)配二癸基二甲基氯化銨消毒液進(jìn)行測(cè)定,典型色譜圖見圖3。

圖3 典型色譜圖Fig.3 Typical chromatograms

由圖3可知,3種雙鏈季銨鹽分離效果較好,無(wú)拖尾現(xiàn)象,并且復(fù)配消毒液中的其他成分對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)不造成干擾,說(shuō)明本方法專屬性良好。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)復(fù)配消毒液樣品無(wú)明顯基質(zhì)效應(yīng),標(biāo)準(zhǔn)曲線與工作曲線斜率比為0.98～1.02,因此采用過(guò)程簡(jiǎn)單的標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。按照儀器工作條件對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定,以3種雙鏈季銨鹽的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示：3種雙鏈季銨鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍均為50～1 000 mg·L-1,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限

逐級(jí)稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,觀察待測(cè)組分信噪比(S/N),分別以信噪比為3,10時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限(3S/N)和測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果見表1。

2.4 精密度和回收試驗(yàn)

取復(fù)配消毒液樣品1.0 mL,對(duì)其進(jìn)行低、中、高等3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)(用流動(dòng)相稀釋到10 mL),每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6次,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

由表2可知,3種雙鏈季銨鹽的回收率為91.0%～105%,測(cè)定值的RSD為1.3%～2.2%,表明本方法具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。

2.5 方法對(duì)比

分別采用本方法和高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法[Welchrom C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫35 ℃;流動(dòng)相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸溶液,B為乙腈;流量1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量10.0 μL。梯度洗脫程序：0～1.0 min,A為55%;1.0～25.0 min,A由55%降至0;25.0～25.1 min,A由0跳轉(zhuǎn)至55%,保持2.0 min。霧化溫度50 ℃;蒸發(fā)溫度50 ℃;氣體流量1.6 L·min-1]對(duì)同一復(fù)配消毒液樣品中的二癸基二甲基氯化銨進(jìn)行7次重復(fù)測(cè)定,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩種方法是否有顯著性差異。結(jié)果顯示,二癸基二甲基氯化銨測(cè)定值分別為1.06～1.18 g·L-1(本方法)和1.10～1.19 g·L-1(高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法),兩組測(cè)定結(jié)果t值為1.85,P值為0.089,表明兩種方法無(wú)顯著性差異。

本工作提出了高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器法測(cè)定復(fù)配消毒液中3種雙鏈季銨鹽含量的方法,該方法專屬性好、方便快速、穩(wěn)定性和重復(fù)性高,適用于復(fù)配消毒液中常量雙鏈季銨鹽的測(cè)定。