基于高效液相色譜指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量法分析廣西鵝掌柴質(zhì)量*

楊馨,徐念智,符文鳳,張文濤,殷漢智,李兵

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南寧 530200)

廣西鵝掌柴(SchefflerakwangsiensisMerr.ex Li)為五加科鵝掌柴屬植物,性味微苦、性溫,別名漢桃葉、七葉蓮、七加皮、白花鵝掌柴等,主產(chǎn)于廣西。民間多以根、皮、莖葉入藥,有祛風(fēng)止痛、舒筋活絡(luò)的功能[1]?！吨腥A本草》描述該屬植物多可“祛風(fēng)除濕、活血消腫。用于治療風(fēng)濕痹痛,跌打腫痛,骨折,頭痛、腰痛、脘腹疼痛等多種疼痛癥”[2]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)廣西鵝掌柴的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制等研究較少,研究表明,其主要的化學(xué)成分主要是三萜皂苷類(lèi)[3-4],另外該屬植物中還含有甾醇、長(zhǎng)鏈烯烴、有機(jī)酸、揮發(fā)油[5-6]等成分。中藥指紋圖譜作為中藥應(yīng)用較為廣泛的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式之一[7],采用多維多息指紋圖譜技術(shù),能全面反映中藥所包含的化學(xué)信息,但主要集中于整體相似度評(píng)價(jià),差異性不夠突出,化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)則強(qiáng)調(diào)數(shù)據(jù)之間的差異性,恰好可以彌補(bǔ)中藥指紋圖譜的不足,兩者結(jié)合可在整體評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上體現(xiàn)出差異性成分的信息[8]。筆者在本研究建立廣西鵝掌柴高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜,從整體角度得到該藥材的較多化學(xué)成分信息。特征圖譜的建立為廣西鵝掌柴的應(yīng)用提供可靠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制方法。

1 儀器與材料

1.1儀器 島津高效液相色譜儀(LC-2030 Plus);CPA225D 型電子天平(德國(guó)賽多利斯公司,感量:0.01 mg);KQ5200B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2材料 甲醇、乙腈為色譜級(jí);紅景天苷對(duì)照品(批號(hào):110818-200404)、4,5-二-O-咖啡?？鼘幩釋?duì)照品(批號(hào):111894-201102)、咖啡酸對(duì)照品(批號(hào):110885-201703)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;柚皮素對(duì)照品(批號(hào):20130306,含量≥98.0%)購(gòu)于廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司;水為超純水,其余試劑均為分析純。10批廣西鵝掌柴藥材均采自廣西各地區(qū),見(jiàn)表1,經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為五加科鵝掌柴屬植物廣西鵝掌柴(SchefflerakwangsiensisMerr.ex Li)的根、莖部分。

表1 10個(gè)產(chǎn)地廣西鵝掌柴藥材來(lái)源

表2 10個(gè)不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表3 10個(gè)不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴共有峰相對(duì)峰面積

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為 COSMOSIL 5C18-PAQ 柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇(C)-0.1% 磷酸溶液(D),梯度洗脫(0～10 min,5%C;10～15 min,5%→15%C;15～25 min,15%→30% C;25～45 min,30%→40% C;45～70 min,40%→60%C;70～90 min,60%→75% C;90～110min,75%→100%C;110～130 min,100%C);流速為 0.7 mL·min-1,柱溫為30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為 287 nm,進(jìn)樣量為 20 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取紅景天苷、4,5-二-O-咖啡?？鼘幩?、咖啡酸、柚皮素對(duì)照品適量,置10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過(guò),即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取10批廣西鵝掌柴樣品粉末各 2 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,分別加入甲醇15 mL,稱定質(zhì)量,超聲(200 W,40 kHz) 提取40 min,放冷,補(bǔ)重,濾過(guò),濾液經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過(guò),即得。

2.2.3空白溶液 取甲醇溶液作為空白溶液,即得。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1專屬性實(shí)驗(yàn) 為排除空白試劑干擾,取“2.2.3節(jié)”空白溶液,按 “2.1節(jié)”色譜條件進(jìn)樣,結(jié)果表明甲醇溶劑對(duì)色譜峰的出峰情況沒(méi)有干擾。

2.3.2精密度實(shí)驗(yàn) 取廣西鵝掌柴(S3) 粉末2 g,精密稱定,按“2.2.2節(jié)”方法制備供試品溶液。按 “2.1節(jié)”下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,以18號(hào)柚皮素色譜峰為參照峰(S),計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD值,結(jié)果均小于3.0%,表明儀器精密度良好。

2.3.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批廣西鵝掌柴粉末(S3) 6份,每份約2 g,精密稱定,按“2.2.2節(jié)”方法制備供試品溶液,按“2.1節(jié)”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,以18號(hào)柚皮素色譜峰為參照峰(S),計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD值,結(jié)果顯示均小于3.0%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批廣西鵝掌柴粉末 (S3)2 g,精密稱定,按“2.2.2節(jié)”方法制備供試品溶液,按“2.1節(jié)”色譜條件,分別在0、4、8、12、16、24 h 進(jìn)樣,以18號(hào)柚皮素色譜峰為參照峰(S),計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD值,結(jié)果顯示均小于3.0%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4HPLC指紋圖譜的建立及共有峰的指認(rèn) 取10個(gè)不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴,按“2.2.2節(jié)”方法制備樣品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,將色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012 版)”,以S3號(hào)樣品圖譜為參照,中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜,設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.1,進(jìn)行圖譜匹配,得到 HPLC 指紋圖譜疊加圖及生成的對(duì)照?qǐng)D譜(圖1、圖2),共標(biāo)定有22個(gè)共有峰。通過(guò)與對(duì)照品色譜圖(圖3) 比對(duì),確定1號(hào)為紅景天苷、13號(hào)為4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、14號(hào)為咖啡酸、18 號(hào)為柚皮素。以18號(hào)柚皮素色譜峰為參照峰,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積,結(jié)果見(jiàn)表1～3。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD數(shù)值為0.006%～0.15%,表明不同產(chǎn)地藥材共有峰出峰時(shí)間較穩(wěn)定,而相對(duì)峰面積的RSD數(shù)值為1.36%～33.42%,說(shuō)明不同產(chǎn)地藥材指紋圖譜中的色譜峰之間的相對(duì)峰面積不同,各化學(xué)成分含量有一定差異。10個(gè)不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴樣品指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表4,各產(chǎn)地樣品的相似度在0.922～0.999,表明各產(chǎn)地藥材的質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定,其化學(xué)成分基本一致。

圖1 10個(gè)不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴色譜峰圖

圖2 廣西鵝掌柴對(duì)照指紋共有模式圖

1.紅景天苷;13.4,5-二-O-咖啡?？鼘幩?14.咖啡酸;18.柚皮素。

表4 10個(gè)不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴指紋相似度結(jié)果

2.5聚類(lèi)分析(cluster analysis,CA) 采用SPSS 24.0版軟件,以10個(gè)廣西鵝掌柴樣品的22個(gè)共有峰峰面積為變量,采用組間聯(lián)接,平方Euclidean 距離作為度量標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行聚類(lèi)分析,結(jié)果見(jiàn)圖4。當(dāng)歐氏距離約為12時(shí),樣品分成4類(lèi),S4、S5、S6、S7 號(hào)樣品為一類(lèi);S9號(hào)樣品為一類(lèi);S1、S2號(hào)樣品為一類(lèi);S3、S8、S10為一類(lèi)。聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn),10個(gè)不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴存在一定的差異,該差異可能與采集地點(diǎn)、采集時(shí)間、氣候等外界因素有一定的關(guān)系,其具體差異性原因有待進(jìn)一步分析。

圖4 10個(gè)不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴樣品聚類(lèi)分析圖

2.6主成分分析(principal component analysis,PCA) 以廣西鵝掌柴22個(gè)共有峰面積為變量,采用SPSS 24.0版軟件進(jìn)行主成分分析,計(jì)算其特征值和方差貢獻(xiàn)率,以特征值>1為標(biāo)準(zhǔn),得到4個(gè)主成分,其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為95.39%,結(jié)果見(jiàn)表5,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率較全面地體現(xiàn)出廣西鵝掌柴化學(xué)成分的基本特征。結(jié)合樣品PCA碎石圖(圖5)分析,圖中的曲線自第5個(gè)主成分開(kāi)始存在1個(gè)明顯的拐點(diǎn),而剩余其他成分的斜率相對(duì)較平緩,表明提取前4個(gè)主成分進(jìn)行分析較為適宜。

圖5 廣西鵝掌柴主成分分析碎石圖

表5 廣西鵝掌柴主成分分析特征值和方差貢獻(xiàn)率

用SPSS 24.0版軟件進(jìn)行因子分析時(shí),得到的是因子載荷矩陣,見(jiàn)表6,主成分的貢獻(xiàn)大小取決于載荷的絕對(duì)值大小。由表6可知,峰7、8、9、11、12、14、15、18、19、20、21在主成分1 有較高的載荷,峰2、6在主成分2有較高的載荷,說(shuō)明以上各色譜峰對(duì)該廣西鵝掌柴的質(zhì)量貢獻(xiàn)較大。提示可將其作為廣西鵝掌柴的質(zhì)量控制指標(biāo)性成分。計(jì)算主成分得分時(shí),需要用未旋轉(zhuǎn)的因子載荷矩陣的系數(shù)除以對(duì)應(yīng)成分特征根的平方根作為指標(biāo)的系數(shù)權(quán)重,即特征向量。特征向量U由因子載荷矩陣A以及特征值λ計(jì)算而來(lái),即Ui=(Ai/λi)1/2,求得特征向量[9],結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 廣西鵝掌柴主成分分析因子載荷矩陣

表7 廣西鵝掌柴主成分分析特征向量

以X1、X2、X3、X4 代表4個(gè)主成分作為 10 個(gè)廣西鵝掌柴樣品成分所表達(dá)的信息,以標(biāo)準(zhǔn)化的共有峰峰面積(A1～A22)為變量,建立起品質(zhì)評(píng)價(jià)模型,計(jì)算其綜合得分。X1=0.218Z1+0.163Z2+0.208Z3+0.180Z4+0.017Z5+0.122Z6+0.273Z7+0.228Z8+0.238Z9-0.056Z10+0.253Z11+0.254Z12+0.198Z13+0.257Z14+0.252Z15+0.193Z16-0.075Z17+0.251Z18+0.253Z19+0.265Z20+0.257Z21+0.213Z22;X2=-0.207Z1+0.351Z2+0.197Z3+0.118Z4+0.386Z5+0.395Z6-0.022Z7-0.156Z8+0.098Z9-0.276Z10+0.098Z11-0.122Z12-0.264Z13+0.108Z14+0.102Z15-0.322Z16-0.133Z17+0.118Z18+0.102Z19-0.108Z20-0.164Z21-0.254Z22;X3=-0.033Z1+0.230Z2+0.295Z3+0.005Z4+0.377Z5+0.252Z6-0.027Z7+0.002Z8-0.099Z9+0.474Z10-0.117Z11+0.146Z12+0.224Z13-0.128Z14-0.079Z15+0.111Z16+0.512Z17-0.132Z18-0.131Z19+0.004Z20+0.033Z21+0.008Z22;X4=-0.124Z1+0.054Z2-0.034Z3-0.53Z4-0.063Z5-0.079Z6-0.063Z7+0.317Z8-0.369Z9+0.043Z10+0.242Z11-0.079Z12+0.201Z13+0.160Z14+0.260Z15-0.116Z16+0.181Z17+0.225Z18+0.230Z19-0.108Z20-0.035Z21-0.286Z22;綜合得分X=(0.598 47X1+0.176 51X2+0.122 54X3+0.056 37X4)/0.953 88,廣西鵝掌柴成分得分及排名見(jiàn)表8,其中S1、S3、S8得分最高。為進(jìn)一步分析10個(gè)廣西鵝掌柴樣品的組間差距,將廣西鵝掌柴22個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 13.0版軟件繪制 PCA 得分圖(圖6),10個(gè)廣西鵝掌柴樣品被分為四類(lèi),其中S4、S5、S6、S7 號(hào)樣品為一類(lèi);S9號(hào)樣品為一類(lèi);S1、S2號(hào)樣品為一類(lèi);S3、S8、S10為一類(lèi)。該結(jié)果與聚類(lèi)分析結(jié)果一致。

圖6 10個(gè)不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴PCA-X得分圖

表8 廣西鵝掌柴成分得分及排名

2.7正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA) 在PCA-X的基礎(chǔ)上,以廣西鵝掌柴22個(gè)共有峰面積為變量,采用SIMCA 13.0版軟件進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析。結(jié)果顯示,模型解釋率參數(shù)(R2X、R2Y)分別為0.999、0.997,模型預(yù)測(cè)能力參數(shù)(Q2)為0.891,均>0.5,表明該模型較穩(wěn)定可靠。OPLS-DA得分圖見(jiàn)圖7,10個(gè)廣西鵝掌柴樣品被分為四類(lèi),其中S4、S5、S6、S7 號(hào)樣品為一類(lèi);S9號(hào)樣品為一類(lèi);S1、S2號(hào)樣品為一類(lèi);S3、S8、S10為一類(lèi)。該結(jié)果與聚類(lèi)分析結(jié)果一致。根據(jù)變量重要性投影值(variable importance in the projection,VIP)圖(圖8)可知,VIP>1 的色譜峰有4號(hào)峰(VIP=2.61)、11號(hào)峰(VIP=1.74)、5號(hào)峰(VIP=1.22)、1號(hào)峰(VIP=1.14)、2號(hào)峰(VIP=1.12)、6號(hào)峰(VIP=1.09),表明這6個(gè)共有成分可能是影響該藥材質(zhì)量差異的主要標(biāo)志性成分,其產(chǎn)地的差異性可能是多個(gè)成分共同影響的結(jié)果。

圖7 10個(gè)不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴OPLS-DA得分圖

圖8 10個(gè)不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴20個(gè)共有峰的VIP圖

3 討論

3.1提取工藝的優(yōu)化 分別考察不同提取方式、甲醇濃度、提取時(shí)間和提取溶劑等因素,發(fā)現(xiàn)甲醇15 mL,超聲提取40 min,色譜峰的分離度和峰面積最佳,可作為該供試品溶液的制備方法。

3.2色譜條件的優(yōu)化 對(duì)不同的流動(dòng)相(甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水),流速(0.6、0.7、1.0 mL·min-1),柱溫(25、30、35 ℃),進(jìn)樣量(10、15、20 μL),色譜柱[COSMOSIL 5C18-PAQ 柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm)、welch XB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、UItimate LP-C18色譜柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm)],根據(jù)色譜峰分離情況等確定上述最佳色譜條件。在比較不同色譜條件時(shí),進(jìn)行耐用性考察,各特征峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積基本一致,表明流速、進(jìn)樣量、柱溫、色譜柱等在不同條件變化時(shí),對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較小。

3.3指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量法結(jié)果分析 10個(gè)不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴指紋圖譜相似度為0.922～0.999,說(shuō)明不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量穩(wěn)定性較高,該評(píng)價(jià)手段主要集中于整體相似度評(píng)價(jià),差異性不夠突出。故本文結(jié)合化學(xué)計(jì)量法手段,彌補(bǔ)了指紋圖譜的不足,重點(diǎn)分析10個(gè)不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴色譜峰之間的差異性,聚類(lèi)分析將10個(gè)樣品分成4類(lèi),主成分分析得到4個(gè)主成分,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá) 95.39%,OPLS-DA分析也將10個(gè)不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴分成4類(lèi),與聚類(lèi)分析結(jié)果一致,同時(shí)分析不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴主要差異標(biāo)志性的物質(zhì),指認(rèn)了部分色譜峰。從本文研究結(jié)果可見(jiàn),兩者評(píng)價(jià)手段的結(jié)合,既能全面地體現(xiàn)出廣西鵝掌柴化學(xué)成分的整體信息,又能通過(guò)化學(xué)計(jì)量法手段突出不同產(chǎn)地之間個(gè)體差異性,為廣西鵝掌柴的整體質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了可靠的分析方法。