小分子藥物篩選技術(shù)研究現(xiàn)狀及其應(yīng)用進(jìn)展

武瑞君,李瑋琦,楊陽,王晶,張鑫,方子寒,張小奕,蘇月

(中國生物技術(shù)發(fā)展中心,北京 100039)

近年來,以抗體藥物為代表的生物大分子藥物研究熱度持續(xù)增高,但小分子藥物因具有分子量小、給藥途徑多、免疫原性低、可以穿透細(xì)胞膜、研發(fā)成本低、生產(chǎn)工藝成熟、易于儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)勢[1],依然是創(chuàng)新藥物研發(fā)的主戰(zhàn)場。先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)與優(yōu)化在小分子藥物研發(fā)過程中處于至關(guān)重要的環(huán)節(jié),高質(zhì)量的活性先導(dǎo)化合物能夠大大縮短藥物研發(fā)周期、節(jié)約成本、提高研發(fā)成功率[2]。隨著生命組學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)等新興學(xué)科以及高性能計(jì)算、大數(shù)據(jù)分析、人工智能等信息技術(shù)深度融入藥物研發(fā),小分子藥物篩選新技術(shù)伴隨著藥物的發(fā)現(xiàn)正在不斷更新和拓展,在基于已知活性化合物(Known)的藥物發(fā)現(xiàn)和高通量篩選(high-throughput screening,HTS)[2]等傳統(tǒng)篩選技術(shù)的基礎(chǔ)上,基于結(jié)構(gòu)的藥物發(fā)現(xiàn)(structure-based drug discovery,SBDD)、基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)(fragment-based drug discovery,FBDD)、DNA編碼化合物庫(DNA encoded compound library,DEL)、蛋白降解靶向聯(lián)合體(proteolysis targeting chimeras,PROTAC)等藥物篩選新技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生[3-7]。筆者在本文將介紹目前小分子藥物篩選技術(shù)整體現(xiàn)狀,系統(tǒng)綜述HTS、SBDD、FBDD、DEL、PROTAC等技術(shù)平臺(tái)及其優(yōu)劣勢,分析小分子藥物篩選新技術(shù)研發(fā)的重要性,為小分子藥物篩選新技術(shù)的未來發(fā)展提供參考。

1 小分子藥物篩選技術(shù)整體發(fā)展現(xiàn)狀

新藥研發(fā)具有周期長、投入大、風(fēng)險(xiǎn)高等特點(diǎn)。以小分子藥物為例,研發(fā)周期平均需要約10年,包括發(fā)現(xiàn)苗頭化合物(Hit)并經(jīng)過層層結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到先導(dǎo)化合物的藥物發(fā)現(xiàn)階段(2～4年)、針對候選化合物(candidate)的臨床前研究階段(1～3年)和臨床階段(3～7年)。其中,藥物發(fā)現(xiàn)階段是小分子藥物研發(fā)中最重要的基礎(chǔ)環(huán)節(jié),且藥物篩選技術(shù)直接關(guān)系到先導(dǎo)化合物質(zhì)量、研發(fā)效率、研發(fā)成本以及成藥可能性,是新藥研發(fā)持續(xù)進(jìn)行的關(guān)鍵。1985年之前,先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)主要是通過人工進(jìn)行,每周處理的樣本數(shù)僅有數(shù)百個(gè)[8]。隨著分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)等現(xiàn)代科學(xué)的快速發(fā)展,小分子藥物發(fā)現(xiàn)進(jìn)入基于靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)時(shí)代,傳統(tǒng)藥物篩選方法如基于Known的藥物發(fā)現(xiàn)由于效率低、較難研發(fā)出原創(chuàng)性成果、容易陷入專利陷阱等缺點(diǎn),無法滿足新藥研發(fā)需求,藥物篩選新技術(shù)不斷更新迭代,HTS大大縮短先導(dǎo)化合物開發(fā)在藥物研發(fā)中的時(shí)間,SBDD、FBDD等也逐漸成為小分子藥物研發(fā)的常見手段[2-5]。通過對2022年至今在JournalofMedicinalChemistry期刊上發(fā)表的文章進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)基于HTS、SBDD、FBDD、DEL和PROTAC的應(yīng)用占比分別約為17.4%、51.2%、19.5%、4%、6.3%,在一定程度上反映目前SBDD、FBDD等新策略在新藥研發(fā)領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。

2 不同小分子藥物篩選技術(shù)的最新研究進(jìn)展與應(yīng)用

2.1HTS HTS技術(shù)出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代末和90年代初,是指以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ),以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體,以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗(yàn)過程,以靈敏快速的檢測儀器采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù),運(yùn)用計(jì)算機(jī)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫支持運(yùn)轉(zhuǎn)的技術(shù)體系。該技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)對數(shù)以千萬的樣品進(jìn)行檢測,具有高度標(biāo)準(zhǔn)化、篩選速度快、靈敏度高、自動(dòng)化程度高、特異性強(qiáng)、所需樣品量小等優(yōu)點(diǎn)[9]。經(jīng)過幾十年的發(fā)展,HTS已經(jīng)發(fā)展成為目前主流的小分子藥物篩選方法之一,大量獲批藥物均由該技術(shù)篩選得到,例如治療糖尿病的二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-4,DPP-4)抑制劑西格列汀(sigliptin)、治療乳腺癌的酪氨酸激酶抑制劑拉帕替尼(lapatinib)、治療胃腸道基質(zhì)腫瘤和轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌的酪氨酸激酶抑制劑舒尼替尼(sunitinib)等[10]。但該技術(shù)仍具有篩選成本較高、耗時(shí)較長、分子多樣性受制于化合物篩選庫、較難對某些復(fù)雜靶點(diǎn)進(jìn)行篩選等缺點(diǎn)。目前各研發(fā)團(tuán)隊(duì)仍在積極創(chuàng)新HTS技術(shù),并廣泛應(yīng)用于創(chuàng)新藥物研發(fā)。

根據(jù)待測樣品的種類,HTS可分為分子水平篩選和細(xì)胞水平篩選兩大類。分子水平的篩選主要是檢測受體功能的改變、蛋白質(zhì)結(jié)合的抑制以及受體-配體結(jié)合的結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)和親和力等,常見的檢測方法有熒光法(熒光偏振、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、酶聯(lián)免疫吸附等)和非熒光法[表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)、質(zhì)譜分析(mass spectrum,MS)等]。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所聯(lián)合皖南醫(yī)學(xué)院開發(fā)一種基于熒光偏振和生物素-親和素反應(yīng)的新冠病毒主蛋白酶(Mpro)小分子抑制劑高通量篩選方法。研究團(tuán)隊(duì)合成一種異硫氰酸熒光素和生物素雙標(biāo)記的小分子肽(FITC-S-Biotin)作為熒光偏振示蹤劑和Mpro的水解底物,活性化合物可以通過抑制Mpro對FITC-S-Biotin的水解作用,改變熒光強(qiáng)度。研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用該模型從天然產(chǎn)物化合物庫中篩選到新冠病毒Mpro競爭性抑制劑二鵝掌菜酚(Dieckol),半數(shù)抑制濃度(IC50)為(4.5±0.4) μmol·L-1[11]。上?？萍即髮W(xué)研究團(tuán)隊(duì)建立一種高通量、無標(biāo)簽的親和質(zhì)譜篩選技術(shù),用于篩選靶向G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCR)的小分子配體,通過對4 333個(gè)化合物進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)了1個(gè)5-羥色胺(5-ydroxytryptamine,5-HT)受體拮抗劑和4個(gè)胰高血糖素樣肽-1受體(glucagon-like peptide-1 receptor,GLP-1R)陽性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑[12]。

細(xì)胞水平的篩選是在細(xì)胞個(gè)體水平完成的檢測,常見的檢測方法有離子通道檢測、報(bào)告基因檢測和細(xì)胞增殖檢測,分別用于原發(fā)性電障礙等離子通道類疾病、瑞特綜合征(rett syndrome,RTT)和阿爾茲海默病等腦部疾病、腫瘤和病毒感染等疾病的藥物篩選[13]。中國科學(xué)院上海藥物研究所研究人員利用表達(dá)鉀離子通道蛋白家族KCNQ2的倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO),建立一種改進(jìn)的HTS方法,通過鉈通量測定法從80 000個(gè)化合物中篩選出565個(gè)比陽性化合物活性更強(qiáng)的KCNQ2通道激動(dòng)劑,然后使用384孔自動(dòng)化膜片鉗和傳統(tǒng)膜片鉗,篩選得到ZG1732和ZG208,半數(shù)有效濃度(EC50)分別為(31.04±0.18),(1.37±0.06)μmol·L-1[14]。麻省理工學(xué)院懷特黑德生物醫(yī)學(xué)研究所研究人員使用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù),將熒光素酶報(bào)告基因插入人胚胎干細(xì)胞內(nèi)源性K+/Cl-共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(KCC2)基因位點(diǎn)中,通過檢測熒光強(qiáng)度,從900個(gè)化合物中篩選得到14個(gè)KCC2表達(dá)增強(qiáng)化合物(KEECs),有望用于RTT的治療[15]。美國默克公司研究團(tuán)隊(duì)以β干擾素(IFN-β)的分泌為表型,在單核細(xì)胞系THP-1中進(jìn)行高通量篩選,發(fā)現(xiàn)口服非核苷酸干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)激動(dòng)劑MSA-2,能夠以二聚體形式結(jié)合并激活STING,靶向腫瘤組織發(fā)揮持久高效的抗腫瘤免疫活性[16]。

2.2SBDD SBDD技術(shù)起源于20世紀(jì)末,是指從配體和靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)出發(fā),以分子識(shí)別為基礎(chǔ)而進(jìn)行的藥物設(shè)計(jì)方法,主要目的是預(yù)測與靶點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生最佳相互作用的化合物,可分為基于受體結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)和基于配體結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)兩大類。其中,基于受體結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)是根據(jù)受體大分子的三維結(jié)構(gòu),通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)(computer aided drug design,CADD)等方法,確定小分子與受體的結(jié)合構(gòu)象,評價(jià)結(jié)合活性,篩選出有潛力的配體小分子;基于配體結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)是依據(jù)現(xiàn)有藥物的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)與活性關(guān)系的分析,建立定量構(gòu)效關(guān)系或藥效基團(tuán)模型,設(shè)計(jì)新的化合物或具有新骨架的活性分子[17]。1995年,基于該策略有2個(gè)藥物首次獲得美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn),分別為用于降低開角型青光眼和高眼壓癥眼壓增高的碳酸酐酶抑制劑多佐胺、治療艾滋病的人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)蛋白酶抑制劑沙奎那韋[18]。在CADD等技術(shù)的輔助下,SBDD顯著提高了藥物篩選命中率,具有開發(fā)成本較低、可從少量化合物篩選獲得先導(dǎo)化合物、可直接預(yù)測受體和配體結(jié)合能力等優(yōu)點(diǎn)。截至目前,FDA批準(zhǔn)的藥物大多基于該技術(shù)演化而來。但該技術(shù)需要受體完整的三維立體結(jié)構(gòu),且僅考慮受體和配體的結(jié)合強(qiáng)度而不能預(yù)測藥效。

隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)、人工智能與深度學(xué)習(xí)等不斷突破,SBDD也在快速發(fā)展。麻省理工學(xué)院研發(fā)團(tuán)隊(duì)使用含有2 335個(gè)已知抗菌活性的分子集合訓(xùn)練深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),該算法無需對藥物進(jìn)行標(biāo)記,就可以分析化合物的分子結(jié)構(gòu)并篩選潛在的抗生素。研究人員利用該算法篩選出的抗生素Halicin,與傳統(tǒng)抗生素結(jié)構(gòu)不同,顯示出對包括結(jié)核分枝桿菌和碳青霉烯類耐藥腸桿菌科在內(nèi)的廣泛病原菌系統(tǒng)發(fā)育譜的殺菌活性,并能有效治療小鼠模型中難辨梭狀芽孢桿菌和泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染。Halicin是首次在沒有任何人為假設(shè)的前提下,從零開始發(fā)現(xiàn)的全新抗生素[19]。印度TCS公司研發(fā)團(tuán)隊(duì)利用深度學(xué)習(xí)開發(fā)一種由圖注意力網(wǎng)絡(luò)和遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組合形成的條件生成模型,該模型利用圖注意力網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)活性位點(diǎn)的殘基結(jié)構(gòu)和相互作用,在藥物靶向親和力預(yù)測模型的指導(dǎo)下產(chǎn)生特定于靶向活性位點(diǎn)的小分子。研究人員在Janus激酶2(JAK2)和多巴胺受體D2(DRD2)上驗(yàn)證該方法,生成類似已知蛋白抑制劑的分子[20]。

2.3FBDD 1981年JENCKS等[21]提出FBDD技術(shù)的概念和理論框架,認(rèn)為某個(gè)類藥性分子可以視為兩個(gè)或多個(gè)具有生物活性小分子碎片的疊加。FBDD是利用NMR、SPR、X-射線單晶衍射(X-ray)以及TSAs等方法篩選出與靶蛋白具有相互作用的小分子弱活性片段,然后基于其結(jié)構(gòu)信息對活性片段進(jìn)行優(yōu)化,得到具有更高活性的先導(dǎo)化合物的方法。該技術(shù)主要包括片段庫的構(gòu)建、活性小片段的篩選、片段的結(jié)構(gòu)優(yōu)化等步驟。其中,在構(gòu)建片段庫階段,ERLANSON等[22]在先導(dǎo)化合物設(shè)計(jì)類藥“五原則”的基礎(chǔ)上,提出構(gòu)建片段庫的“三法則”,即片段的分子量<300,脂水分配系數(shù)<3,氫鍵供體與受體的數(shù)量分別<3。除此之外,片段庫的大小需要根據(jù)所選擇的篩選方法進(jìn)行考慮,例如采用NMR或X-ray時(shí),片段庫的大小通常為1×102～1×103;采用SPR時(shí),因其具有高通量的特點(diǎn),片段庫大小可以達(dá)到1×105。片段的篩選是FBDD技術(shù)的核心,由于片段與靶點(diǎn)的結(jié)合作用較弱,因此需要高靈敏度和高穩(wěn)定性的篩選方法檢測,以滿足所需的靈敏度和穩(wěn)定性。隨著技術(shù)的發(fā)展,微量熱泳動(dòng)、熱遷移分析(TSAs)、弱親和色譜等檢測手段對NMR、SPR、X-ray等經(jīng)典方法進(jìn)行補(bǔ)充。通常經(jīng)過篩選得到的初始片段活性很低,所以篩選后的關(guān)鍵是通過片段自組、片段連接或片段生長對片段進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,改善片段對靶標(biāo)的選擇性、生物利用度、生物轉(zhuǎn)化等性質(zhì),使之成為候選藥物,這也是FBDD技術(shù)最具挑戰(zhàn)的環(huán)節(jié)[22]。

與HTS比較,FBDD有以下優(yōu)點(diǎn),一是收集、維護(hù)和篩選片段庫比化合物庫更加容易,且篩選包含幾千個(gè)片段的片段庫就可以達(dá)到篩選化合物庫的效果,研發(fā)周期更短;二是具有更高的篩選命中率,可以實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜靶標(biāo)尤其涉及蛋白-蛋白相互作用靶點(diǎn)的處理;三是片段的尺寸小、溶解度高,通常具有更好的藥物屬性,后期易于結(jié)構(gòu)優(yōu)化,有潛力成為活性高、選擇性高的藥物分子。截至目前,共有4個(gè)獲批上市的藥物利用FBDD技術(shù)篩選得到,分別為治療黑色素瘤的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B-raf(BRAF)抑制劑維莫非尼(vemurafenib)、治療慢性淋巴細(xì)胞白血病的B細(xì)胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)抑制劑維奈克拉(venetoclax)、治療尿路上皮癌的成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor,FGFR)抑制劑厄達(dá)替尼(erdafitinib)、治療腱鞘巨細(xì)胞瘤的集落刺激因子1/干細(xì)胞因子受體(CSF1R/cKit)抑制劑Pexidartinib,其中維莫非尼從片段篩選到獲批上市僅用6年時(shí)間[23-24]。該技術(shù)同樣具有一定的局限性,如技術(shù)門檻要求較高,需要有較好的片段儲(chǔ)備,且很大程度依賴于靶蛋白的三維結(jié)構(gòu)信息,對純化蛋白的需求量較大,片段經(jīng)過結(jié)構(gòu)優(yōu)化后得到的先導(dǎo)化合物可能與片段分子結(jié)合位點(diǎn)不同,對篩選所需檢測手段的靈敏度要求較高。

各研發(fā)團(tuán)隊(duì)仍在積極開展相關(guān)研究工作。上?？萍即髮W(xué)和復(fù)旦大學(xué)研究人員構(gòu)建一種基于親和質(zhì)譜的FBDD篩選技術(shù),與基于SPR或NMR的FBDD比較,該技術(shù)通過使用親和質(zhì)譜富集特定結(jié)合物,可減少2～4倍目標(biāo)蛋白質(zhì)和片段庫化合物的使用量,分析速度可以提高2～3倍。研究人員利用該技術(shù)成功篩選到一種潛在的GPCR負(fù)變構(gòu)調(diào)節(jié)劑Fg754,Fg754能夠與鈉離子變構(gòu)位點(diǎn)特異性結(jié)合,且結(jié)合模式不同于已知的負(fù)變構(gòu)調(diào)節(jié)劑[25]。印度昌迪加爾醫(yī)學(xué)教育研究所研究人員以新冠病毒Mpro為靶點(diǎn),利用FBDD技術(shù)對一個(gè)含有約20萬化合物片段的片段庫進(jìn)行篩選,并將任何與相鄰子口袋具有高親和力的片段進(jìn)行連接,最終得到17個(gè)與Mpro關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)具有較高結(jié)合活性的分子,為新冠病毒候選藥物研發(fā)提供更多選擇[26]。

2.4DEL DEL技術(shù)是一項(xiàng)基于組合化學(xué)和DNA技術(shù)的藥物篩選方法,于1992年由美國Sydney Brenner和Richard Lerner提出,主要包括DNA編碼化合物庫的構(gòu)建、DEL篩選以及先導(dǎo)化合物的產(chǎn)生等步驟[27]。該技術(shù)首先將每個(gè)化合物與一段特定的DNA分子序列進(jìn)行連接,進(jìn)行DNA編碼,用作可擴(kuò)增的識(shí)別條形碼,構(gòu)建經(jīng)DNA編碼的化合物庫;然后將活性靶蛋白和經(jīng)DNA編碼的化合物庫進(jìn)行親和篩選,洗脫除去與靶蛋白親和力弱或不結(jié)合的化合物,得到親和力強(qiáng)的化合物集合;由于化合物與DNA編碼信息一一對應(yīng),篩選完成后利用高通量測序?qū)Y選出化合物連接的DNA序列進(jìn)行識(shí)別,確定編碼對應(yīng)的化合物分子;最后重新合成不帶DNA標(biāo)簽的化合物進(jìn)行活性驗(yàn)證及結(jié)構(gòu)優(yōu)化,得到先導(dǎo)化合物[28]。

DEL技術(shù)使用DNA標(biāo)簽作為條形碼,可構(gòu)建和篩選規(guī)模達(dá)幾百萬至數(shù)十億種化合物的化學(xué)文庫,具有庫容量巨大、分子多樣性好、對靶標(biāo)蛋白需求量少等優(yōu)點(diǎn),DEL技術(shù)并非傳統(tǒng)的一對一篩選,是將靶蛋白和整個(gè)編碼化合物庫同時(shí)孵育,具有顯著的時(shí)間和成本優(yōu)勢,篩選周期為3～6個(gè)月,每個(gè)化合物篩選成本平均0.002美元。但DEL技術(shù)要求較高,暫無利用該技術(shù)獲批上市的藥物,且大體積的DNA編碼標(biāo)簽以及組合化學(xué)在一定程度上增加篩選的復(fù)雜性和不確定性,需要進(jìn)一步開發(fā)和優(yōu)化與DNA相容的化學(xué)反應(yīng)以保持化合物的類藥性和庫的純度。此外,該技術(shù)的篩選對象主要針對純化的生物靶點(diǎn),對于難以表達(dá)的靶點(diǎn)或者活細(xì)胞體系等功能性靶點(diǎn)篩選較為困難[28-29]。

目前,DEL技術(shù)已被國內(nèi)外制藥公司廣泛應(yīng)用,成為篩選先導(dǎo)化合物的重要手段,國內(nèi)外DEL技術(shù)較為成熟的公司有4家,分別為英國葛蘭素史克公司(GSK)、美國X-Chem公司、成都先導(dǎo)公司和丹麥Nuevolution公司。其中,GSK是對DEL技術(shù)應(yīng)用最為成熟的企業(yè),DEL庫達(dá)幾十億量級(jí),分子庫篩選的靶點(diǎn)種類繁多,幾乎涵蓋所有疾病類型,但其DEL庫的化學(xué)結(jié)構(gòu)類型只有一種,為三嗪類雜環(huán)化合物,其技術(shù)僅供自用。GSK已有3個(gè)在研藥物處于Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段,分別為用于治療糖尿病或心腦血管疾病等的可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑GSK2256294、用于治療銀屑病或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎以及潰瘍性結(jié)腸炎的ATP競爭型受體相互作用蛋白1(RIP1)抑制劑GSK2982772、用于治療胰腺癌的RIP1抑制劑GSK3145095,其中GSK2256294是第一個(gè)由DEL技術(shù)發(fā)現(xiàn)并進(jìn)入臨床試驗(yàn)的小分子化合物[30]。成都先導(dǎo)公司是國內(nèi)首個(gè)開展DEL研究的制藥公司,目前已建立一個(gè)基于DEL的早期藥物開發(fā)平臺(tái),該DEL庫分子數(shù)量已超過1.2萬億,合成分子骨架的種類超過6 000種,已有3個(gè)在研藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,分別為用于治療骨髓瘤或?qū)嶓w瘤的組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑HG146、用于治療晚期實(shí)體瘤的STING激動(dòng)劑HG381、用于治療具有神經(jīng)營養(yǎng)受體酪氨酸激酶(NTRK)或C-ROS原癌基因1酪氨酸激酶(ROS1)基因融合的原肌球蛋白受體激酶(TRK)抑制劑HG030。美國貝勒醫(yī)學(xué)院和德克薩斯兒童醫(yī)院研究人員致力于篩選人類蛋白溴域和末端外亞群(BET)中第一個(gè)溴域(BD1)的特異性抑制劑,BD1是癌癥等疾病的潛在靶標(biāo)。該團(tuán)隊(duì)利用DEL技術(shù),在一個(gè)試管中同時(shí)對40億個(gè)DNA編碼分子進(jìn)行篩選,得到對BD1具有高度選擇性的化合物CDD-724,該化合物抑制BD1的能力約是抑制其他人類溴化結(jié)構(gòu)域的2 000倍[31]。

2.5PROTAC PROTAC是將靶向蛋白募集到E3泛素連接酶進(jìn)行泛素化標(biāo)記,然后通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)將其降解的新型藥物分子體系的方法。UPS是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑,參與細(xì)胞內(nèi)80%以上蛋白質(zhì)的降解。該系統(tǒng)由泛素(Ub)、3種泛素化酶(泛素活化酶E1,泛素結(jié)合酶E2s,泛素連接酶E3s)、蛋白酶體及其底物蛋白質(zhì)等構(gòu)成,在ATP供能的情況下,蛋白通過一系列酶的作用,被標(biāo)記上多泛素化并轉(zhuǎn)移到蛋白酶體內(nèi)進(jìn)行降解。PROTAC就是利用UPS原理設(shè)計(jì)的一種雙功能小分子,由3部分構(gòu)成,中間的連接體(Linker)一端連接可靶向目標(biāo)蛋白的配體,另一端連接E3泛素連接酶配體分子,利用UPS識(shí)別、結(jié)合并降解疾病相關(guān)的靶蛋白[32]。該技術(shù)是一種全新藥物設(shè)計(jì)策略,理論上可以將任何過表達(dá)和突變的致病蛋白清除,達(dá)到治療疾病的目的[33]。PROTAC的發(fā)展經(jīng)歷了第1代基于多肽片段的設(shè)計(jì),到2008年開始的第2代小分子PROTAC設(shè)計(jì),降解的靶蛋白包括甲硫氨酰氨肽酶2、雄激素受體、細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白、雌激素受體、Tau微管相關(guān)蛋白、激酶類等,涉及的疾病包括癌癥、類風(fēng)濕疾病、神經(jīng)退行性疾病等[32]。

基于作用機(jī)制,PROTAC主要有以下優(yōu)點(diǎn):一是PROTAC分子不直接抑制靶蛋白的功能活性,不需要與靶蛋白發(fā)生長時(shí)間和高強(qiáng)度的結(jié)合,可以靶向轉(zhuǎn)錄因子、支架蛋白和非酶蛋白等對于傳統(tǒng)小分子藥物“無成藥性”的蛋白;二是相比于傳統(tǒng)小分子藥物的“占位驅(qū)動(dòng)”模型,PROTAC分子屬于“事件驅(qū)動(dòng)”,只需要瞬態(tài)結(jié)合就可以直接催化降解靶蛋白,因此使用催化劑量即可發(fā)揮藥物療效,耐藥性更低;三是由于靶蛋白與E3泛素連接酶之間的協(xié)同作用,PROTAC分子具有更高的選擇性。盡管PROTAC技術(shù)從肽到全小分子有了顯著的提升,但是與傳統(tǒng)的小分子藥物相比,PROTAC分子作為三元復(fù)合物,分子量較大,提高水溶性、穩(wěn)定性、口服生物利用度、血管穿透能力等需進(jìn)一步研究。此外,由于泛素化標(biāo)記不僅涉及到蛋白質(zhì)的降解,還關(guān)系到甲基化、乙?；?、磷酸化等過程以及DNA,其脫靶毒性仍是目前面臨的難題[6,32]。

PROTAC作為一種新興的小分子藥物研究領(lǐng)域,吸引了眾多制藥企業(yè)和學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)開展研究。創(chuàng)立于2013年的美國Arvinas公司是該領(lǐng)域的領(lǐng)頭羊,研發(fā)管線主要包括抗腫瘤藥物和神經(jīng)疾病藥物,目前共有Bavdegalutamide(ARV-110)、ARV-471、ARV-766三款候選藥物處于臨床階段。其中,Bavdegalutamide選擇性靶向降解雄激素受體(androgen receptor,AR),主要用于治療轉(zhuǎn)移性趨勢抵抗性前列腺癌(mCRPC),是全球首個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的口服PRAOTC小分子藥物,目前處于Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段。2022年2月,Arvinas公布的Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示,Bavdegalutamide展現(xiàn)出持續(xù)抗腫瘤活性和患者獲益證據(jù),在攜帶AR T878X/H875Y突變的腫瘤患者中,可以使46%患者的前列腺特異性抗原(prostatic specific antigen,PSA)水平降低≥50%。ARV-471靶向雌激素受體(estrogen receptor,ER),用于治療ER陽性/人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)陰性(ER+/HER2-)的乳腺癌,于2022年12月啟動(dòng)Ⅲ期臨床試驗(yàn),是目前研究進(jìn)展最快的PRAOTC分子。2022年11月,公布的Ⅱ期臨床試驗(yàn)初步結(jié)果顯示,ARV-471具有良好的耐受性,顯示出38%的臨床獲益率(CBR:確認(rèn)完全緩解率、確認(rèn)部分緩解率或疾病穩(wěn)定率>24周),對于ESR1突變患者,CBR為51.2%[34]。國內(nèi)多家藥企也在積極開展相關(guān)研究,如海思科公司的HSK29116、開拓藥業(yè)的GT20029、百濟(jì)神州公司的BGB-16673等均處于Ⅰ期臨床試驗(yàn)階段;珃諾生物公司的RNK05047處于Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段,于2022年8月在美國完成首例患者給藥。上述不同技術(shù)優(yōu)劣勢比較見表1。

表1 不同小分子藥物篩選技術(shù)對比

3 展望

隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展,以重組蛋白質(zhì)藥物、治療性抗體、基因治療、干細(xì)胞治療等為代表的生物技術(shù)藥物成為新藥研發(fā)的熱點(diǎn),小分子藥物受到一定沖擊,小分子藥物分子類型和多樣性的增速降低。但是,小分子藥物作為最傳統(tǒng)的藥物形式,以其難以替代的優(yōu)勢,仍是藥物研發(fā)領(lǐng)域的重要組成部分。通過對上述小分子藥物篩選技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀分析可以發(fā)現(xiàn),美國是該領(lǐng)域的領(lǐng)頭羊,我國雖然在相關(guān)領(lǐng)域取得了一定進(jìn)展,但仍落后于美國。因此,一是要以全面提升我國藥物研發(fā)創(chuàng)新能力為導(dǎo)向,持續(xù)加強(qiáng)基礎(chǔ)研究,積累原創(chuàng)性成果,提高源頭創(chuàng)新力。二是要以更好的解決小分子藥物研發(fā)過程中的共性問題為牽引,對于人工智能藥物設(shè)計(jì)技術(shù)、智能藥物制備技術(shù)、氘代藥物開發(fā)技術(shù)等能夠優(yōu)化我國新藥創(chuàng)制體系的關(guān)鍵共性技術(shù),加強(qiáng)集中攻關(guān),促進(jìn)我國制藥產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)。三是要以直擊現(xiàn)階段小分子藥物研發(fā)的痛點(diǎn)為目的,對于DEL、PROTAC、小分子輔助受體靶向技術(shù)等具有前瞻性、先導(dǎo)性和一定探索性的前沿引領(lǐng)技術(shù),要提前優(yōu)先布局,并不斷將變革性新技術(shù)應(yīng)用于小分子藥物的研發(fā),為生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展注入新動(dòng)力,為未來新藥創(chuàng)制領(lǐng)域技術(shù)更新?lián)Q代和新興產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。