桂郁金多糖結(jié)構(gòu)表征及其體外抗氧化活性研究

關(guān) 媛，嚴(yán)淑昕，錢少林，王雪盈，陸芽春，李 霞（桂林理工大學(xué)，廣西 桂林 541000）

郁金是郁金屬植物溫郁金、姜黃、廣西莪術(shù)的干燥塊根［1］，它及其所含生物活性成分可調(diào)控多種凋亡蛋白、炎癥因子、酶和非酶抗氧化劑［2］。該植物性寒，歸肝、心、肺經(jīng)，具有活血止痛、行氣解郁、癲癇痰閉、利膽退黃等功效［3］，其提取物具有抗炎、抗菌、抗抑郁、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功能［4］。

機體氧化應(yīng)激會導(dǎo)致皮膚衰老、免疫功能下降、內(nèi)分泌紊亂、腸炎等［5-6］風(fēng)險。桂郁金中富含多糖類成分，具有降血糖［7］、抗脂質(zhì)過氧化、抗凝血活性［8］，但目前對該類成分分離純化、結(jié)構(gòu)、活性等方面的研究較少。Xu 等［9］通過水提法得到莪術(shù)多糖，能加快糖尿病小鼠的創(chuàng)面收縮，促進皮膚再生。Dong 等［10］從莪術(shù)中提取多糖，能提高小鼠抗免疫調(diào)節(jié)能力，具有抑制腫瘤作用。侯敏娜等［11］以姜黃郁金為原料，研究了它對DPPH、ABTS 自由基的清除能力。本實驗從桂郁金中分離得到2 種多糖，初步表征其結(jié)構(gòu)特征，研究其體外抗氧化活性，旨在為開發(fā)新型天然抗氧化劑提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 濃硫酸（批號210916，純度95.0% ～98.0%）、氨基磺酸（批號210205，純度≥99.5%）、七水合硫酸亞鐵（批號161012，純度99.0% ～101.0%）、磷酸氫二鈉（批號180619，純度≥99.0%）（汕頭市西隴科學(xué)股份有限公司）； 抗壞血酸［批號J2120100，阿拉丁試劑（上海）有限公司，純度≥99.0%］； 3，5-二硝基水楊酸（批號RH249811，純度98%）、鐵氰化鉀（批號S61033，純度98%）（上海源葉生物科技有限公司）； 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，批號W3008E46572，美國Sigma 公司）； 其他試劑均為分析純。桂郁金（批號160401，產(chǎn)地廣西欽州，廣西南寧生源中藥飲片責(zé)任有限公司），經(jīng)桂林理工大學(xué)副研究員李靜鑒定為廣西莪術(shù)Curcuma Kwangsiensis。

1.2 儀器 SQP 電子天平 （德國 Sartorius 公司）；ALPHA1-2 LD 型冷凍干燥機 （德國Martin Christ 公司）；Nicolet iS 10 型傅里葉紅外變換光譜儀（上海亞榮生化儀器廠）； YK722PC 型紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）； XD-5210A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、YJD20D-GL 型十功能自動煎藥機（上海賢德實驗儀器有限公司）； 98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）； DL-5-B 型大型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）； BT100-2J 型恒流泵（保定蘭格恒流泵有限公司）。

2 方法

2.1 多糖制備 參考文獻［12-13］報道，將桂郁金與75%乙醇以1 ∶20 比例浸泡過夜，電熱套加熱5 h 以去除脂溶性雜質(zhì)。乙醇提取后的藥材于通風(fēng)處晾曬至干燥后，與蒸餾水以1 ∶16 比例在100 ℃下提取3 h，共2 次。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，加入無水乙醇至終體積分?jǐn)?shù)為60%，靜置24 h后4 000 r／min 離心15 min，收集沉淀，蒸餾水溶解，冷凍干燥，得到粗多糖，取2 g 至200 mL 蒸餾水中溶解，得到10 mg／mL溶液，在-20 ℃下冷凍24 h 后4 ℃下解凍，8 000 r／min 離心10 min，取上清，采用DEAE52 柱層析進行分離，蒸餾水洗脫得到中性糖部分WPCK-N，0.7 mol／L NaCl 洗脫得到酸性糖部分WPCK-A。

2.2 理化性質(zhì)測定 以葡萄糖為對照品，采用苯酚-硫酸法測定總糖含量［14］，取1 mL 0.1 g／L 樣品溶液至試管中，加入0.5 mL 6%苯酚溶液、2.5 mL 濃硫酸，振蕩，沸水浴反應(yīng)10 min，于490 nm 波長處測定吸光度。以半乳糖醛酸為對照品，采用間羥基聯(lián)苯法檢測糖醛酸含量［15］，在試管中依次加入400 μL 0.1 g／L 樣品溶液、40 μL 氨基磺酸、2.5 mL 濃硫酸，振蕩搖勻，沸水浴20 min，冷卻至室溫后加入40 μL 間羥基聯(lián)苯試劑，室溫反應(yīng)15 min，于525 nm波長處測定吸光度。以牛血清白蛋白（BSA）為對照品，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量。采用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量［16］，取1 mL 樣品溶液，加入1 mL 蒸餾水、1.5 mL DNS，沸水浴5 min，冷卻至室溫后定容至25 mL，于540 nm 波長處測定吸光度。

2.3 單糖組成分析 以1-苯基3-甲基5-吡唑酮（PMP）進行樣品衍生化。稱取10 mg 樣品，5 mL 3 mmol／L 三氟乙酸在105 ℃下水解6 h，加入100 μL 0.3 mmol／L 氫氧化鈉、0.3 mmol／L PMP，在70 ℃下放置1 h，冷卻至室溫，100 μL 0.3 mmol／L 鹽酸中和混合物，氯仿提取3 次，采用HPLC 法對水相進行分析，條件為安捷倫XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相0.05 mmol／L 磷酸鹽緩沖液溶液（A，pH＝6.8）-83%乙腈（B），梯度洗脫（0 ～6 min，90% ～85%A； 7～13 min，85% ～80%A； 30～36 min，65% ～60% A； 60 ～67 min，40% ～35% A）； 體積流量1 mL／min； 柱溫 30 ℃； 檢測波長 254 nm； 進樣量10 μL［16］。

2.4 多糖分子量測定 采用高效凝膠滲透色譜儀，凝膠柱選用TSK-gel G-4000PWxl； 洗脫液0.02 mmol／L 磷酸二氫鉀溶液； 體積流量0.5 mL／min； 檢測器Waters2414 示差折光檢測器； 不同分子量葡聚糖（T1000、T500、T70、T40、T10、T5）校準(zhǔn)色譜柱； 柱溫35 ℃［17-18］。

2.5 紅外光譜測定 取1 mg 樣品，于瑪瑙研缽中與100 mg KBr 混合，在紅外烘燈下烘干研磨，取少量粉末在9.81 GPa 壓力下壓30 s，制成薄片，紅外光譜儀在4 000 ～500 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描［19］。

2.6 XRD 測定 參考文獻［20］報道，采用X 射線粉末衍射儀對樣品進行測定，條件設(shè)置為管壓40 kV； 管流30 mA； 數(shù)據(jù)采集范圍5 ～80°； 步幅0.02°； 計數(shù)時間0.78 s／step。

2.7 掃描電鏡測定 取樣品粉末適量，通過導(dǎo)電膠粘附于掃描電鏡樣品臺上，噴金處理20 s，在掃描電子顯微鏡下觀察外貌形態(tài)，放大倍數(shù)為1 000，并進行拍照。

2.8 體外抗氧化活性研究 以抗壞血酸為陽性對照，樣品濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg／mL，平行3 次。

2.8.1 DPPH 自由基清除能力 參考文獻［21］報道，將50 μL 不同濃度樣品溶液與200 μL 0.004%DPPH 溶液（無水甲醇溶解）混合反應(yīng)，在37 ℃下避光反應(yīng)1 h，12 000 r／min 離心5 min，于517 nm 波長處測定吸光度A1； 用無水甲醇代替DPPH 溶液，測定吸光度A2； 用蒸餾水代替樣品溶液，測定吸光度A0，計算DPPH 自由基清除率，公式為清除率＝ ［1- （A1-A2）］×100%。

2.8.2 羥基自由基清除能力 參考文獻［22-23］報道，將50 μL 樣品溶液與100 μL 9 mmol／L 硫酸亞鐵、100 μL 9 mmol／L水楊酸（無水乙醇溶解）混合，加入100 μL 過氧化氫（8.8 mmol／L），在25 ℃下反應(yīng)30 min，12 000 r／min離心5 min，于510 nm 波長處測定吸光度A1； 用蒸餾水代替過氧化氫，測定吸光度A2； 用蒸餾水代替樣品溶液，測定吸光度A0，計算羥基自由基清除率，公式為清除率＝［1- （A1-A2）／A0］×100%。

2.8.3 鐵離子還原能力 參考文獻［24］報道，將1.0 mL 樣品溶液與1.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液混合，在50 ℃下反應(yīng)20 min，冷卻至室溫后，加1.0 mL 10% 三氯乙酸，5 000 r／min 離心15 min，取2.5 mL 上清液與0.15 mL 0.1%氯化鐵混合，于700 nm 波長處測定吸光度。

3 結(jié)果

3.1 多糖組成 表1 顯示，WPCK-N 主要由葡萄糖組成，還含有少量甘露糖、半乳糖，而WPCK-A 主要由半乳糖、葡萄糖組成，還含有少量甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、巖藻糖； 兩者酸性單糖含量均較低。綜上所述，從桂郁金中提取的多糖大多為中性糖。

表1 桂郁金多糖組成分析

3.2 紅外光譜 圖1 顯示，WPCK-N 在3 410 cm-l附近的寬拉伸峰對應(yīng)于O-H 的拉伸振動，2 920 cm-1附近具有弱C-H拉伸振動的特征吸收，1 400 ～1 000 cm-1分別由O-H、C-H伸縮振動導(dǎo)致，678 cm-1為長鏈烷烴骨架振動吸收峰，而WPCK-A 的C＝O 吸收峰集中在1 640 cm-1處，主要是羧基的C＝O 吸收峰，峰的強度和尖銳程度可能體現(xiàn)羧基含量；在3 430 cm-1附近的譜帶強度為O-H 的伸展頻率，此處強度較大； 吸收峰集中于1 120.40 cm-1，在1 600 ～600 cm-1范圍內(nèi)的峰型更清晰集中； 與WPCK-N 相比，WPCK-A 吸收峰主要集中在1 419.06 cm-1處，1 200 ～950 cm-1附近峰歸屬于C-O-H 變角振動或吡喃糖環(huán)中C-O-C 伸縮振動（1 100～1 200 cm-1附近為吡喃糖環(huán)上C-O 吸收峰，1 070、1 023 cm-1附近C-O-H 變角振動）。

圖1 桂郁金多糖紅外光譜圖

3.3 掃描電鏡 圖2 顯示，WPCK-N 主要呈片狀，而WPCK-A 主要由塊狀和少許的片狀組成，兩者表面都比較粗糙。研究表明，中性、酸性多糖外貌形狀差異可能和所帶電荷不同有關(guān)［25］，而WPCK-N 整體上外貌形狀比WPCK-A 小，可能與多糖本身性質(zhì)有關(guān)。

圖2 桂郁金多糖掃描電鏡圖（HE，×1 000）

3.4 XRD 分析 圖3 顯示，2 種多糖的最高峰都出現(xiàn)在20°左右，WPCK-N 在21.32°處有1 個較為寬的衍射峰，而WPCK-A 在20.29°處有1 個不明顯的包峰，其他范圍只有少數(shù)弱衍射峰存在，并且兩者均為無定形結(jié)構(gòu)。

圖3 桂郁金多糖XRD 圖

3.5 體外抗氧化活性研究

3.5.1 DPPH 自由基清除能力 圖4 顯示，在0 ～3.2 mg／mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)2 種多糖均具有DPPH 自由基清除能力，并呈劑量依賴性，但均小于抗壞血酸； 為3.2 mg／mL時清除作用最強，清除率分別為56.78%、32.22%，以WPCK-N 更明顯。另外，相比綿麥冬中性糖［26］、北五味子中性糖［27］、人參果［28］等植物中性糖，WPCK-N 的DPPH自由基清除能力較強。

3.5.2 羥基自由基清除能力 圖5 顯示，在0～3.2 mg／mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，2 種多糖對羥基自由基的清除率逐步上升，并具有劑量依賴性； 為0.8 mg／mL 后增長程度趨于平緩； WPCK-A 質(zhì)量濃度為3.2 mg／mL 時清除作用最強，清除率達(dá)23.45%。Chaiwong 等［29］證實，低分子量多糖呈現(xiàn)出較好的羥基自由基清除率，而WPCK-N 分子量較高，為2.88×105Da，WPCK-A 分子量僅為1.39×105Da，故推測可能是后者效果更好的原因。

圖5 桂郁金多糖對羥基自由基的清除能力

3.5.3 鐵離子還原能力 劉宏等［30］報道，還原能力與多糖體外抗氧化能力有一定聯(lián)系，多糖還原性的吸光度越高，其抗氧化能力越強。圖6 顯示，隨著鐵離子濃度升高，抗壞血酸總還原能力變化不大，但總體仍呈上升趨勢； 2 種多糖的還原能力隨著其質(zhì)量濃度升高而逐漸增加，以WPCK-N更明顯。綜上所述，桂郁金多糖具有將Fe3＋還原成Fe2＋的能力，從而增強其體外抗氧化活性。

圖6 桂郁金多糖鐵離子還原能力

4 討論

倪力軍［31］、Chaiwong 等［29］研究表明，多糖單糖組成、含量、分子量會影響其體外抗氧化活性，含有葡萄糖的多糖抗氧化活性明顯高于不含葡萄糖者。實驗結(jié)果顯示，WPCK-N 的DPPH 自由基清除能力及鐵離子還原能力比WPCK-A 更明顯，推測可能與葡萄糖含量差異有關(guān)（WPCK-N 為98.3%，WPCK-A 為21.4%），但羥基自由基清除作用恰好相反，低分子量的WPCK-A 呈現(xiàn)出較好的清除能。前期報道，中性糖、酸性糖存在活性差異，胡彥波［32］對薇菜多糖進行分離純化，發(fā)現(xiàn)中性糖DPPH 清除率、還原能力均高于酸性糖，但羥基自由基抗氧化能力略弱于后者，與本實驗結(jié)果一致。黃妮等［26］發(fā)現(xiàn)，綿麥冬多糖有較強的抗氧化活性，其中性糖的DPPH 自由基清除活性低于酸性糖，羥基自由基活性更高。程麗敏等［33］以金花葵莖可溶性糖為研究對象，發(fā)現(xiàn)其酸性糖抗氧化活性強于中性糖，該差異可能與多糖本身性質(zhì)有關(guān)。

本實驗以熱水提取、乙醇沉淀的方法提取得到粗多糖，再利用DEAE-52 纖維素分離得到桂郁金中的中性多糖（WPCK-N）和酸性多糖 （WPCK-A）。對 WPCK-N 和WPCK-A 進行了理化性質(zhì)檢測和體外抗氧化分析。結(jié)果顯示W(wǎng)PCK-N 主要由葡萄糖組成，WPCK-A 主要由半乳糖、葡萄糖組成，半乳糖醛酸和葡糖糖醛酸的所占比例較低，與紅外光譜分析結(jié)果一致。掃描電鏡進一步顯示，WPCK-N主要是片狀，WPCK-A 主要是塊狀和少許的片狀。體外抗氧化結(jié)果表明，桂郁金多糖具有清除自由基（DPPH 和羥基自由基）的能力和良好的還原能力，且呈濃度依賴性。其中WPCK-N 的DPPH 自由基清除能力較強，質(zhì)量濃度為3.2 mg／mL 時，清除率最高，達(dá)到56.78%。WPCK-A 在質(zhì)量濃度為3.2 mg／mL 的羥基自由基清除率最高為23.45%。WPCK-N 的總還原能力較WPCK-A 明顯。上述結(jié)果表明，桂郁金多糖有較好的抗氧化活性，具有開發(fā)為新型天然抗氧化劑及功能性食品的潛力，并為今后相關(guān)研究提供參考思路。