依匹哌唑?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和SW620細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成的影響及其機(jī)制

李婷，龍小藝，劉肖潔，陳衛(wèi)

川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)研究所，四川 南充 637000

結(jié)直腸癌是世界上最常見的三大癌癥之一，發(fā)病率和死亡率都很高［1］。在目前手術(shù)、化療、放療等標(biāo)準(zhǔn)治療下，結(jié)直腸癌患者5年相對(duì)生存率為65%。然而，在IV 期結(jié)直腸癌患者中，這一比例降至12%［2］。因此，尋找新的抗癌機(jī)制和藥物對(duì)結(jié)直腸癌的防治具有重要意義。到目前為止，已有多項(xiàng)研究［3］發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌與血清高膽固醇水平之間存在關(guān)聯(lián)，這意味著結(jié)直腸癌的發(fā)生進(jìn)展與膽固醇合成代謝密切相關(guān)。膽固醇是細(xì)胞的能量來(lái)源之一，可由哺乳動(dòng)物細(xì)胞通過甲羥戊酸途徑合成［4］。此外，膽固醇還參與細(xì)胞膜的合成，并作為信號(hào)分子參與信號(hào)級(jí)聯(lián)［5-6］。因此，膽固醇合成代謝在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［7］。近年來(lái)，非典型抗精神病藥物被報(bào)道對(duì)多種癌癥有潛在的治療效果［8］，比如新型抗精神病藥物依匹哌唑。2015年，依匹哌唑被FDA批準(zhǔn)用于治療重度抑郁和成人精神分裂癥，不良反應(yīng)小且安全性好［9］。研究［10-12］表明，依匹哌唑具有一定的抗癌作用，可在胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的癌細(xì)胞和癌癥干細(xì)胞中發(fā)揮抗癌效應(yīng)。然而依匹哌唑在結(jié)直腸癌中的作用及其機(jī)制尚不明確。2022年10月—2013年2月，我們觀察了依匹哌唑?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116 和SW620 細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 依匹哌唑、細(xì)胞、試劑 依匹哌唑購(gòu)于上海畢得醫(yī)藥科技有限公司。人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116 和SW620 均購(gòu)買于武漢普諾賽生命科技有限公司。McCoy's 5A 培養(yǎng)基購(gòu)自索萊寶公司；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、雙抗購(gòu)自Gibco公司。CCK-8試劑購(gòu)自Dojindo 公司。逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、PCR 擴(kuò)增試劑（TB Green?Premix Ex Taq? Ⅱ）購(gòu)于日本TaKaRa 公司。所用引物由Primer6 軟件設(shè)計(jì)并由上海生工公司合成?？偰懝檀迹═C）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HCT116、SW620 細(xì)胞分別選用McCoy's 5A 培養(yǎng)基、DMEM 高糖培養(yǎng)基在5%CO2、37 ℃的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中均添加有10% FBS 及1% 雙抗。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116、SW620 細(xì)胞，分別分為依匹哌唑組和對(duì)照組，依匹哌唑組加入含20 μmol/L 依匹哌唑的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等量完全培養(yǎng)基，各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 兩組細(xì)胞中總膽固酮（TC）檢測(cè) 采用微板法。取兩組細(xì)胞，胰酶消化、PBS 重懸后加入96 孔板中，使用超聲破碎機(jī)破碎細(xì)胞20 min，加入TC 測(cè)定試劑，使用酶標(biāo)儀于510 nm 處測(cè)定細(xì)胞OD 值，計(jì)算各組細(xì)胞中TC含量。

1.4 兩組細(xì)胞中人3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（HMGCR）、人3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶1（HMGCS1）mRNA和蛋白檢測(cè)

1.4.1 兩組細(xì)胞中HMGCR、HMGCS1 mRNA 檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。取兩組細(xì)胞，使用TRIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA，取1 μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，使用SYBR Premix Ex TaqTM 試劑進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列如下：HMGCR 上游引物為5′-TGATTGACCTTTCCAGAGCAAG-3′，下游引物為5′-CTAAAATTGCCATTCCACGAGC-3′；HMGCS1 上游引物為5′-CATTAGACCGCTGCTATTCTGTC-3′，下游引物為5′-TTCAGCAACATCCGAGCTAGA-3′；內(nèi)參基因GAPDH 上游引物為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物為3′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-5′。反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA 模板2 μL，滅菌水8.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.2 兩組細(xì)胞中HMGCR、HMGCS1 蛋白檢測(cè)采用Western Blotting 法。取兩組細(xì)胞，用RIPA 裂解液（含PMSF、磷酸酶抑制劑）于4 ℃裂解30 min 后離心提取總蛋白。通過SDS-PAGE 膠分離出蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，快速封閉液封閉10 min，4 ℃分別敷育一抗，β-actin（1∶2000）、HMGCR（1∶2000）、HMGCS1（1∶1000）過夜。次日，洗膜后敷育二抗1 h后，將顯影液滴加在PVDF 膜上，用ECL 化學(xué)發(fā)光儀顯影并拍照。以β-actin 為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 兩組細(xì)胞中PI3K/Akt-SREBP2 信號(hào)通路蛋白p-PI3K、p-AKT、SREBP2 表達(dá)檢測(cè) 采用Western Blotting 法。檢測(cè)步驟參照“1.4.2”，一抗?jié)舛确謩e為p-PI3K（1∶1000）、p-AKT（1∶1000）、SREBP2（1∶1000），以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0 和Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料呈正態(tài)分布時(shí)以±s表示，比較用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞中TC 含量比較 對(duì)照組、依匹哌唑組HCT116 細(xì)胞中TC 含量分別為（0.210± 0.054）、（0.039± 0.022）gprot/L，兩組相比，P＜0.05。對(duì)照組、依匹哌唑組SW620 細(xì)胞中TC 含量分別為（0.140± 0.025）、（0.014± 0.007）gprot/L，兩組相比，P＜0.05。

2.2 兩組細(xì)胞中HMGCR、HMGCS1 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.2.1 兩組細(xì)胞中HMGCR、HMGCS1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 對(duì)照組、依匹哌唑組HCT116 細(xì)胞中HMGCR mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為1.00± 0.00、0.61± 0.02，兩組相比，P＜0.05；對(duì)照組、依匹哌唑組HCT116 細(xì)胞中HMGCS1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為1.00± 0.00、0.56± 0.03，兩組相比，P＜0.05。對(duì)照組、依匹哌唑組SW620 細(xì)胞中HMGCR mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為1.00± 0.00、0.70± 0.02，兩組相比，P＜0.05；對(duì)照組、依匹哌唑組SW620 細(xì)胞中HMGCS1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為1.00± 0.00、0.53± 0.03，兩組相比，P＜0.05。

2.2.2 兩組細(xì)胞中HMGCR、HMGCS1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 對(duì)照組、依匹哌唑組HCT116 細(xì)胞中HMGCR 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為2.10± 0.10、0.50± 0.14，兩組相比，P＜0.05；對(duì)照組、依匹哌唑組HCT116 細(xì)胞中HMGCS1 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為3.00± 0.20、1.10± 0.09，兩組相比，P＜0.05。對(duì)照組、依匹哌唑組SW620 細(xì)胞中HMGCR 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.30± 0.02、0.33± 0.04，兩組相比，P＜0.05；對(duì)照組、依匹哌唑組SW620 細(xì)胞中HMGCS1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.10± 0.06、0.36± 0.06，兩組相比，P＜0.05。

2.3 兩組細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT、SREBP2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 對(duì)照組、依匹哌唑組HCT116 細(xì)胞中p-PI3K 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為2.20± 0.18、0.28±0.12，兩組相比，P＜0.05；對(duì)照組、依匹哌唑組HCT116 細(xì)胞中p-AKT 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.60± 0.14、0.46± 0.25，兩組相比，P＜0.05；對(duì)照組、依匹哌唑組HCT116細(xì)胞中SREBP2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為2.20± 0.05、1.60± 0.02，兩組相比，P＜0.05。對(duì)照組、依匹哌唑組SW620 細(xì)胞中p-PI3K 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.87± 0.13、0.10± 0.05，兩組相比，P＜0.05；對(duì)照組、依匹哌唑組SW620細(xì)胞中p-AKT 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.62± 0.07、0.29±0.05，兩組相比，P＜0.05；對(duì)照組、依匹哌唑組SW620 細(xì)胞中SREBP2 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.95± 0.07、0.20± 0.04，兩組相比，P＜0.05。

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個(gè)緩慢、隱匿、多步驟的發(fā)展過程，從癌前病變到結(jié)直腸癌需要5～10年時(shí)間［13］，并且與患者一些風(fēng)險(xiǎn)因素（年齡、性別和家族易感體質(zhì)）和環(huán)境（飲食、超重和吸煙）密切相關(guān)［14］。高膽固醇血癥已被認(rèn)為是癌癥的重要危險(xiǎn)因素。除血清膽固醇外，細(xì)胞內(nèi)膽固醇也被證明在腫瘤進(jìn)展的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。研究［15］顯示，在腫瘤組織中細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平也升高，并促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。靶向膽固醇合成途徑已被認(rèn)為是一種抗腫瘤的策略［16］。

本研究證實(shí)，依匹哌唑能顯著降低結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)TC 含量，并下調(diào)膽固醇合成關(guān)鍵酶HMGCR 和HMGCS1 的表達(dá)，這些結(jié)果表明依匹哌唑能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成。多項(xiàng)研究證實(shí)HMGCR 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胃癌和前列腺癌細(xì)胞中有致癌作用，另有研究［17-18］表明HMGCR 還與結(jié)直腸癌的預(yù)后有關(guān)。此外，有報(bào)道［19-20］稱HMGCS1 在乳腺癌和胃癌中促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。相反，抑制HMGCS1 可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖［21-22］。

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBPs）是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，由SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP2組成。SREBP前體（SREBP-P）在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上合成。在成熟時(shí)，SREBP 進(jìn)入細(xì)胞核并促進(jìn)脂肪生成基因的轉(zhuǎn)錄。SREBP2 主要通過調(diào)節(jié)膽固醇合成關(guān)鍵酶（如HMGCR 和HMGCS1）的表達(dá)進(jìn)而影響膽固醇代謝［23］。Western Blotting 結(jié)果顯示，依匹哌唑顯著下調(diào)了SREBP2 蛋白表達(dá)。SREBP2 已被證實(shí)在多種癌癥中高表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。最近的一項(xiàng)研究［24］闡明了SREBP2 介導(dǎo)的膽固醇生物合成對(duì)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)是必不可少的。PI3K/Akt 通路激活后通過調(diào)節(jié)SREBPs 的表達(dá)在脂質(zhì)合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，許多研究也表明SREBPs 與PI3K/Akt 通路密切相關(guān)，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活［25］。本研究結(jié)果表明，依匹哌唑可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞p-PI3K、p-AKT和SREBP2蛋白的表達(dá)。

綜上，依匹哌唑可抑制HCT116 和SW620 細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成，其機(jī)制可能與依匹哌唑抑制PI3K/Akt-SREBP2信號(hào)通路蛋白的表達(dá)有關(guān)。本研究為挖掘依匹哌唑新的藥用價(jià)值提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，然而，依匹哌唑是否通過調(diào)節(jié)膽固醇合成發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用，仍需深入探究。此外，本研究?jī)H局限在細(xì)胞層面，后續(xù)還將進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。