化膿隱秘桿菌動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

黃艷爽，胡惠銘，慕依林，沈克飛，徐登峰，王孝友，張素輝*

（1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，重慶 榮昌 402460；2.西南大學(xué)，重慶 北碚 400715）

化膿隱秘桿菌（Trueperella pyogenes）是動(dòng)物皮膚、上呼吸道和泌尿生殖道黏膜微生物群落的一部分，是一種重要的條件致病菌，可在家畜間廣泛傳播，導(dǎo)致廣泛多樣的皮膚、內(nèi)臟器官和關(guān)節(jié)的非特異性化膿性感染，常造成動(dòng)物肺炎、乳房炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肝膿腫、子宮炎以及流產(chǎn)、不孕等，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)化膿隱秘桿菌感染的防控仍以抗菌藥物治療為主［1］，隨著細(xì)菌的進(jìn)化和抗菌藥物的長(zhǎng)期使用，導(dǎo)致耐藥性加劇，從而影響治療效果［2］，故亟需建立化膿隱秘桿菌感染動(dòng)物模型，用于研究其致病機(jī)制、篩選藥物及開(kāi)發(fā)疫苗。本文就化膿隱秘桿菌動(dòng)物模型的研究現(xiàn)狀及成果進(jìn)行綜述。

1 動(dòng)物模型的選擇

可用來(lái)建立模型的動(dòng)物種類(lèi)繁多，對(duì)于普通細(xì)菌感染動(dòng)物模型來(lái)講，所選動(dòng)物必須滿足以下條件：（1）動(dòng)物來(lái)源充足，操作經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)單；（2）感染持續(xù)時(shí)間夠長(zhǎng)，易于開(kāi)展長(zhǎng)期或較長(zhǎng)期的觀察；（3）純系動(dòng)物，易控制各種處理因素；（4）模型可重復(fù)性強(qiáng)，便于國(guó)際間對(duì)比和交流。近年來(lái)，已建立的化膿隱秘桿菌感染動(dòng)物模型包括小鼠模型、大鼠模型、家兔模型、山羊模型、妊娠母豬模型、荷斯坦母牛模型等。

2 各類(lèi)化膿隱秘桿菌動(dòng)物模型

2.1 小鼠模型 小鼠與人的基因具有95%的同源性，與其他經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的基因也有高度的同源性，且生理結(jié)構(gòu)大致相同，例如小鼠乳腺與奶牛乳腺生理結(jié)構(gòu)幾乎相同［3］，小鼠還具有價(jià)格低廉，繁殖性能強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，因而小鼠模型在疾病研究中被廣泛使用。

Qin Lei 等［4］從患有肺炎和嚴(yán)重腹部積液的病保育豬的肺部分離出一株化膿隱秘桿菌菌株20121，并且成功構(gòu)建了小鼠化膿隱秘桿菌感染模型，在感染小鼠中觀察到肺充血、肝細(xì)胞廣泛變性、十二指腸黏膜下淋巴組織中淋巴細(xì)胞大量壞死、回腸中潘氏細(xì)胞變性、脾臟白髓萎縮等一系列癥狀，肺部檢測(cè)出細(xì)菌（＞104CFU/g）。該模型初步證明化膿隱秘桿菌在感染的早期階段會(huì)降低免疫功能，其作用機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

疫苗研發(fā)是防治化膿隱秘桿菌感染的新方向。Yang Lingxiao 等［5］構(gòu)建了tPLOA1和tPLOA2兩種重組抗原，通過(guò)將兩種重組抗原與不完整的弗氏佐劑或綿羊紅細(xì)胞膜混合來(lái)制備疫苗，以清潔雌性昆明小鼠為模型，經(jīng)過(guò)3次疫苗免疫后，用化膿隱秘桿菌進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，分析免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示：免疫兩種重組抗原的小鼠未表現(xiàn)出任何不適，且未觀察到注射部位周?chē)钠つw病變；雖然重組抗原對(duì)動(dòng)物是安全的，但疫苗只能保護(hù)約50%的小鼠。這一結(jié)果表明抗原和疫苗制劑的效力不足，有待進(jìn)一步研究。

疫苗開(kāi)發(fā)的另一種思路是構(gòu)建減毒活疫苗，該類(lèi)疫苗能夠模仿自然感染和天然佐劑特征，誘導(dǎo)機(jī)體長(zhǎng)期免疫力，并從天然細(xì)菌入侵途徑進(jìn)行管控。Beikzadeh B 等［6］構(gòu)建減毒活菌作為候選疫苗，通過(guò)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）評(píng)估PLO 和FimA 兩種毒力基因的表達(dá)情況，與對(duì)照組相比，PLO 和FimA 基因表達(dá)下調(diào)；通過(guò)腹膜注射途徑對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，小鼠脾臟外觀正常，而接種疫苗的小鼠和對(duì)照組的脾、肝、心和腹液細(xì)菌計(jì)數(shù)無(wú)顯著差異。該試驗(yàn)成功構(gòu)建了自然感染無(wú)致病性化膿隱秘桿菌的小鼠模型，為化膿隱秘桿菌提供了一種新的減毒疫苗，接下來(lái)需要對(duì)免疫反應(yīng)及安全性進(jìn)行更多的研究。

2.2 大鼠模型 大鼠的體型較家兔等哺乳動(dòng)物小，內(nèi)臟器官更容易觀察和分析，且研究成本較低，但大鼠模型可能無(wú)法成功誘導(dǎo)目的疾病。例如使用化膿隱秘桿菌懸浮液進(jìn)行大鼠子宮灌注可能會(huì)導(dǎo)致子宮炎或陰道炎，而不是子宮內(nèi)膜炎，故需要更精細(xì)的操作。Zhang Luyao等［7］建立大鼠子宮內(nèi)膜炎模型時(shí)，在灌注化膿隱秘桿菌前，連續(xù)3 d 將3%乙酸注射到子宮角，以化學(xué)損害子宮，在細(xì)菌首次接種后將硅水凝膠透鏡植入大鼠子宮以形成生物膜，通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察硅水凝膠鏡片上形成的生物膜證明化膿隱秘桿菌在大鼠子宮中的存在。同時(shí)，觀察大鼠的臨床癥狀、體溫、白細(xì)胞分類(lèi)改變、子宮內(nèi)細(xì)菌含量、形態(tài)和病理改變，判斷模型誘導(dǎo)是否成功。大鼠作為動(dòng)物模型具有一定的局限性，其病理過(guò)程和其他動(dòng)物可能不完全一致，具體的疾病機(jī)制還需探索。

2.3 家兔模型 Hijazin M等［8］首次從家兔的肺部病變中分離出化膿隱秘桿菌，Shahbazfar A A等［9］首次從家兔肝、脾、肺、腦中分離得到化膿隱秘桿菌。谷長(zhǎng)勤等［10］使用鴨源化膿隱秘桿菌菌懸液通過(guò)腹腔和皮下注射家兔，建立攻毒模型，運(yùn)用病理學(xué)技術(shù)觀察鴨源化膿隱秘桿菌對(duì)家兔的致病特點(diǎn)，除以往學(xué)者報(bào)道的哺乳動(dòng)物感染后的病變外，還觀察到脾內(nèi)白髓面積減少，表明該菌會(huì)對(duì)免疫系統(tǒng)造成損傷，但同時(shí)觀察到部分家兔的心包積液增多，這與Qin Lei等［4］構(gòu)建的小鼠模型有一定差異。

劉威等［11］通過(guò)構(gòu)建家兔的高免血清模型進(jìn)行免疫熒光分析（IFA）、特異性試驗(yàn)等，成功建立了一種檢測(cè)化膿隱秘桿菌的間接免疫熒光方法，該方法能對(duì)化膿隱秘桿菌在感染動(dòng)物組織細(xì)胞中定位，有利于全面和系統(tǒng)地了解化膿隱秘桿菌的發(fā)病機(jī)理和流行狀況。

2.4 妊娠母豬模型 建立化膿隱秘桿菌妊娠母豬模型，可研究存在于母豬乳汁中的生理活性物質(zhì)對(duì)化膿隱秘桿菌的免疫潛質(zhì)。Kostro K等［12］使用適量的苯酚溶液滅活化膿隱秘桿菌制備自體疫苗（菌懸液密度為6×108CFU/mL），在妊娠母豬預(yù)期分娩前六周和三周分別免疫（3mL/頭·次），結(jié)果顯著增加了初乳和牛奶中T 淋巴細(xì)胞CD4＋、CD8＋和CD25＋的百分比以及干擾素IFN-γ、腫瘤壞死因子TNF-α和白細(xì)胞介素IL-10 的水平，表明分娩前免疫化膿隱秘桿菌疫苗，可提高初乳免疫潛力，增強(qiáng)仔豬在斷奶期間對(duì)化膿隱秘桿菌感染的抵抗力，從而減少化膿隱秘桿菌感染引起的豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)損失。

2.5 荷斯坦母牛模型 小鼠模型在動(dòng)物模型構(gòu)建中得到大量使用，但事實(shí)上從經(jīng)濟(jì)動(dòng)物所面臨的疾病困擾來(lái)說(shuō)，小鼠模型并不完全適用于所有疾病?；诖?，Piersanti R L 等［13］使用致病性大腸桿菌和化膿隱秘桿菌，以荷斯坦小母牛為模型，通過(guò)載體或活菌宮內(nèi)輸注的方法，成功構(gòu)建了一個(gè)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的臨床子宮內(nèi)膜炎體內(nèi)感染模型。該模型可用于研究子宮內(nèi)膜炎相關(guān)生殖衰竭的機(jī)制和子宮內(nèi)膜炎介導(dǎo)的低生育力，并且規(guī)避了在哺乳期奶牛中觀察到的分娩和哺乳的許多混雜效應(yīng)。

2.6 山羊模型 構(gòu)建山羊模型可以更好地理解致病菌在宿主中的生命周期、傳播和菌群動(dòng)態(tài)，這對(duì)于研究細(xì)菌感染的病理過(guò)程和發(fā)展非常有幫助。王晨驍［14］從患病山羊膿汁中分離篩選出一株同時(shí)含有七種毒力基因的化膿隱秘桿菌，每只皮下注射3×108CFU 的菌液進(jìn)行致病性試驗(yàn)，感染一周后接種部位有明顯腫包產(chǎn)生，注射器刺破后有膿液流出，采集膿液進(jìn)行病原分離鑒定，再次分離到化膿隱秘桿菌。該模型的構(gòu)建有利于探究化膿隱秘桿菌對(duì)山羊的致病性及致病機(jī)制。

2.7 其他動(dòng)物模型

2.7.1 白勒霍恩雞模型 2017 年Yang Lingxiao等［15］將純化的重組PLO與弗氏完全佐劑混合，皮下注射免疫白勒霍恩雞，兩周后注射第二劑相同劑量的重組PLO與弗洛因德不完全佐劑混合物，在第二次免疫接種10 d后，處死動(dòng)物，收集血清，進(jìn)行蛋白免疫印跡試驗(yàn)。該模型的構(gòu)建為PLO結(jié)構(gòu)與功能的驗(yàn)證研究提供了一些新的信息，并且作為禽類(lèi)模型具有體外孵化易于控制、試驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。

2.7.2 豬的精確切割肺切片（PCLS）3D模型 Qin Lei等［4］首次使用化膿隱秘桿菌20121菌株感染豬的肺切片（PCLS）培養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)化膿隱秘桿菌可誘導(dǎo)嚴(yán)重的支氣管收縮并導(dǎo)致細(xì)支氣管管腔面積變窄，表明PCLS 是研究化膿隱秘桿菌感染合適的3D 模型。此外，PCLS 可用于尋找更有效的化膿隱秘桿菌感染的治療藥物。

3 小結(jié)

前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，重慶地區(qū)某規(guī)模場(chǎng)山羊感染化膿隱秘桿菌的抗體陽(yáng)性率達(dá)到31%［16］?？梢?jiàn)化膿隱秘桿菌作為一種引起各種化膿性感染的機(jī)會(huì)性動(dòng)物病原體，給畜牧業(yè)造成了比較大的經(jīng)濟(jì)損失。建立化膿隱秘桿菌感染動(dòng)物模型，對(duì)于其致病機(jī)制研究、藥物篩選及疫苗研制具有重要意義。目前大多數(shù)關(guān)于化膿隱秘桿菌感染保護(hù)性免疫的研究是在小鼠模型上進(jìn)行的，小鼠模型較其他動(dòng)物模型成熟，但在病理發(fā)展機(jī)制的研究、疫苗效力評(píng)價(jià)等方面仍有尚未解決的問(wèn)題。大鼠和荷斯坦牛模型主要側(cè)重于子宮內(nèi)膜炎疾病模型的構(gòu)建。家兔模型與山羊模型在疫苗研制過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，有較大的開(kāi)發(fā)潛力。可根據(jù)動(dòng)物特性嘗試構(gòu)建更多相關(guān)模型，進(jìn)一步探究化膿隱秘桿菌在體內(nèi)的感染機(jī)制，以進(jìn)行藥物篩選和疫苗評(píng)價(jià)。