基于宏基因組的煙田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能分析

申曉晴，高華軍，拓陽(yáng)陽(yáng)，耿召良，蔡 斌，李紅麗*，王 巖

1.鄭州大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，鄭州市高新區(qū)科學(xué)大道100 號(hào) 450001

2.中國(guó)煙草總公司海南省公司?？谘┣蜒芯克?，海口市瓊山區(qū)紅城湖路120 號(hào) 571100

3.四川省煙草公司涼山州公司德昌分公司，四川省西昌市三岔口東路432 號(hào) 615500

煙草黑脛病和青枯病是典型的土傳病害，其直接影響煙葉的品質(zhì)和產(chǎn)量，每年給煙葉生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。煙草根腐病危害面廣，防治難度大，常與黑脛病、青枯病混合發(fā)生，近年來全國(guó)核心煙區(qū)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［3］。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在維持生態(tài)平衡、物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)等方面發(fā)揮著重要作用［4］。有研究表明［1-2，5］，煙草土傳病害的發(fā)生與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能多樣性降低、有益微生物減少以及有害病原菌富集均會(huì)提高病害發(fā)生率。另外，土壤微生物在碳氮平衡中也具有重要作用。自然界中的氮素進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)循環(huán)，需要微生物將氮?dú)廪D(zhuǎn)化為氨或銨鹽；以CO2為中心的碳循環(huán)中，微生物能通過光合作用和化能合成作用固定CO2［6］。碳氮代謝為植物生長(zhǎng)發(fā)育提供物質(zhì)基礎(chǔ)［7］，土壤酶活性是表征土壤質(zhì)量及微生物代謝活性的關(guān)鍵指標(biāo)［8-9］，兩者交互作用協(xié)同調(diào)控?zé)煵莸纳L(zhǎng)發(fā)育。因此，明確健康和易感病煙田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異，對(duì)病害防控尤為重要。邸慧慧等［10］研究發(fā)現(xiàn)，煙草病害土壤與非病害土壤樣本間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，同源性低，且發(fā)病植煙土壤中含有大量病原菌。孫美麗等［11］研究表明，感病與健康煙葉細(xì)菌代謝通路均主要為代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理3類。母少東等［12］分析了不同植煙區(qū)土壤的碳氮代謝，發(fā)現(xiàn)天柱地區(qū)煙葉碳氮代謝品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)較威寧地區(qū)和龍崗地區(qū)協(xié)調(diào)，有利于提高煙葉品質(zhì)。左梅等［13］選擇不同發(fā)病程度的煙株根際土壤進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)隨著煙株發(fā)病程度的增加，土壤脲酶、過氧化氫酶活性依次降低，磷酸酶和蔗糖酶活性無(wú)顯著差異。丁亞茹等［14］研究了不同發(fā)病率煙田根際土壤微生物群落組成，發(fā)現(xiàn)已發(fā)病煙田中存在較多潛在病原菌，健康煙田中蛋白酶和過氧化氫酶的活性高于易感病煙田。然而，關(guān)于不同健康狀態(tài)煙田的有益細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及功能基因的研究還鮮見報(bào)道。為此，選取涼山彝族自治州1 塊健康煙田和2 塊易感病煙田為研究對(duì)象，利用宏基因組測(cè)序技術(shù)，比較不同健康狀態(tài)的煙田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、功能基因、碳氮代謝及酶活性的差異性，以期為煙田土壤健康調(diào)控提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 煙田基本情況

供試煙田位于涼山彝族自治州德昌縣德州鎮(zhèn)鳳凰村（以下簡(jiǎn)稱鳳凰村），北緯27°25′40′′，東經(jīng)102°11′17′′，海拔1 565 m，亞熱帶高原季風(fēng)氣候，年平均氣溫17.7 ℃，年均降水1 049 mm，無(wú)霜期300 d 以上。試驗(yàn)地為煙草連作10年的煙田，黃壤沙土。選取健康煙田D1，易感?。ê诿劜　⑶嗫莶『透』旌习l(fā)生，發(fā)病率50%以上）煙田D2 和D3 進(jìn)行試驗(yàn)。每個(gè)處理面積220 m2。D1、D3前作種植油菜，D2前作種植大蒜，種植煙草品種為云煙87。

1.2 土壤樣品采集

于2020年3月，即前茬作物采收后煙苗移栽前，依照5點(diǎn)取樣法取耕層5～20 cm的土壤樣品1 kg，將樣品混勻并裝袋編號(hào)。每塊煙田取3個(gè)平行樣，在田間將土樣過篩（孔徑0.25 mm），去除根莖、石頭等雜質(zhì)。取過篩后樣品置于50 mL 帶蓋離心管中，儲(chǔ)存于有冰袋的保溫箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-20 ℃冰柜中保存，并及時(shí)送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行宏基因組測(cè)序。其余樣品部分風(fēng)干用于土壤化學(xué)性質(zhì)指標(biāo)和酶活性分析，部分冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 土壤化學(xué)性質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

采用電位法測(cè)定土壤pH 值［15］；采用重鉻酸鉀-油浴法測(cè)定有機(jī)質(zhì)（Organic matter，OM）［15］；采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定堿解氮（Alkaline nitrogen，AN）［15］；采用乙酸胺提取-原子吸收法測(cè)定速效鉀（Available potassium，AK）［15］；采用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法測(cè)定有效磷（Available phosphorus，AP）［15］。

1.3.2 土壤酶活性測(cè)定

采用對(duì)硝基苯酚比色法［16］測(cè)定酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）活性；采用靛酚藍(lán)比色法［17］測(cè)定脲酶（Urease，URE）活性；采用3，5-二硝基水楊酸比色法［17］測(cè)定蔗糖酶（Invertase，INV）活性；采用容量法［18］測(cè)定過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性；采用福林試劑比色法［18］測(cè)定蛋白酶（Protease，PR）活性。

1.3.3 土壤樣品DNA提取、測(cè)序

使用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（Omega Bio-tek）試劑盒對(duì)土壤樣品的基因組DNA進(jìn)行提取，隨后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和純度。通過Covaris M220（Gene Company Limited）將DNA片段化，篩選約400 bp 的片段，用于構(gòu)建PE 文庫(kù)。通過上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的PE150 策略，在Illumina HiSeq X Ten 測(cè)序平臺(tái)對(duì)每個(gè)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

參照劉臻岳等［19］的方法進(jìn)行生物信息學(xué)分析。采用Microsoft Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和制圖，采用IBM SPSS Statistics 22.0 進(jìn)行方差分析，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)對(duì)土壤細(xì)菌群落進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，采用Duncan’s 新復(fù)極差法對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)指標(biāo)、酶活性進(jìn)行差異顯著性分析，采用R 語(yǔ)言（pheatmap package）進(jìn)行相關(guān)性分析，采用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的生信云平臺(tái)進(jìn)行宏基因組數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙田土壤細(xì)菌群落層級(jí)聚類分析

健康和易感病煙田屬水平土壤細(xì)菌群落的層級(jí)聚類分析如圖1所示。健康煙田D1 與易感病煙田D2、D3 的土壤細(xì)菌群落具有明顯差異，易感病煙田D2和D3的土壤細(xì)菌群落相似。

圖1 屬水平上健康和易感病煙田土壤細(xì)菌群落的層級(jí)聚類分析Fig.1 Hierarchical cluster analysis of soil bacterial communities in healthy and susceptible tobacco fields at genus level

2.2 不同處理間土壤細(xì)菌群落組成及差異分析

健康和易感病煙田在門水平上的土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度如圖2所示。相對(duì)豐度大于4%的優(yōu)勢(shì)菌門有放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）。其中，健康煙田D1 中放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）的相對(duì)豐度較高，比易感病煙田D2和D3 分別高1.042 百分點(diǎn)和1.187 百分點(diǎn)、1.062 百分點(diǎn)和2.214 百分點(diǎn)、1.009 百分點(diǎn)和1.014 百分點(diǎn)。健康煙田D1中變形菌門（Proteobacteria）的相對(duì)豐度較低，比易感病煙田D2和D3分別低1.349百分點(diǎn)和3.342百分點(diǎn)。

圖2 門水平上健康和易感病煙田土壤細(xì)菌群落的相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of soil bacteria communities in healthy and susceptible tobacco fields at phylum level

健康煙田D1 和易感病煙田D2、D3 在屬水平上的土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度如圖3所示。D1、D2、D3中土壤細(xì)菌相對(duì)豐度排名前4的菌屬分別為慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）和分枝桿菌屬（Mycobacterium）。D1中固定桿菌屬（Conexibacter）的相對(duì)豐度比D2和D3分別高0.121百分點(diǎn)和0.323百分點(diǎn)。對(duì)D1 和D2、D3 土壤細(xì)菌在屬水平上有顯著性差異的物種分析（圖4）可知，具有顯著性差異的菌屬有15 個(gè)。健康煙田 D1 中慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、纖線桿菌屬（Ktedonobacter）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）的相對(duì)豐度均極顯著高于易感病煙田D2、D3。而易感病煙田D2、D3中羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）的相對(duì)豐度極顯著高于健康煙田D1。

圖3 屬水平上健康和易感病煙田土壤細(xì)菌群落的相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of soil bacteria communities in healthy and susceptible tobacco fields at genus level

圖4 屬水平上健康和易感病煙田的土壤細(xì)菌群落差異分析Fig.4 Differential Analysis of soil bacterial community between healthy and susceptible tobacco fields at genus level

2.3 土壤細(xì)菌相對(duì)豐度與化學(xué)性質(zhì)指標(biāo)及酶活性的相關(guān)性分析

由表1可知，健康煙田D1中PR活性顯著高于易感病煙田D2、D3，URE、ACP活性均低于易感病煙田D2、D3。健康煙田D1與易感病煙田D2中INV活性無(wú)顯著差異，而易感病煙田D3中INV活性顯著高于健康煙田D1。CAT活性在3塊煙田中相差不大。健康煙田D1中土壤OM、AN、AK、AP含量均顯著低于易感病煙田D2、D3。

表1 不同煙田土壤酶活性、化學(xué)性質(zhì)指標(biāo)的差異分析①Tab.1 Differential analysis of soil enzyme activity and chemical properties between different tobacco fields

在屬水平上，對(duì)煙田土壤細(xì)菌相對(duì)豐度與土壤化學(xué)性質(zhì)、酶活性進(jìn)行Spearman相關(guān)性熱圖分析，結(jié)果如圖5所示。pH 值、OM、AN、AP、AK、PR、URE、ACP是土壤細(xì)菌群落在屬水平上具有顯著影響的因子。慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、固定桿菌屬（Conexibacter）的相對(duì)豐度與AN、AP、AK、URE呈極顯著正相關(guān)，與PR呈極顯著負(fù)相關(guān)。纖線桿菌屬（Ktedonobacter）與PR 呈極顯著正相關(guān)，與AN、AP、AK、URE 呈極顯著負(fù)相關(guān)。羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）和鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）的相對(duì)豐度與pH 值呈極顯著負(fù)相關(guān)，與OM、ACP 呈極顯著正相關(guān)。

圖5 屬水平上煙田土壤細(xì)菌群落與化學(xué)因子及酶活性間的相關(guān)性熱圖Fig.5 Correlation heatmap of soil bacterial community with chemical factors and enzyme activity at genus level in tobacco fields

2.4 煙田土壤樣品功能基因預(yù)測(cè)分析

通過Diamond將非冗余基因集序列與KEGG的基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋，發(fā)現(xiàn)3塊煙田土壤樣品中共含有6類一級(jí)功能代謝通路和46類二級(jí)功能代謝通路。由圖6a可見，KEGG一級(jí)功能代謝通路中，與代謝相關(guān)的基因豐度最高，其次為遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程、人類疾病和有機(jī)系統(tǒng)。其中，D1、D2、D3 中與代謝相關(guān)的基因豐度占各樣品總基因豐度的比例分別為72.36%、71.95%、71.81%。D2 和D3 中6 類一級(jí)功能代謝通路的基因豐度均高于D1。

圖6 KEGG一級(jí)和二級(jí)功能代謝通路Fig.6 KEGG primary and secondary functional metabolic pathways

在二級(jí)KEGG 的基因數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)46 類二級(jí)功能代謝通路中基因豐度排名前12的代謝相關(guān)功能基因進(jìn)行注釋，結(jié)果如圖6b所示。D1、D2、D3 中碳水化合物代謝和全局概覽通路為主要二級(jí)功能代謝通路，其次為氨基酸代謝、能量代謝、核苷酸代謝及輔酶維生素代謝。綜合圖6a 和圖6b 可見，D1、D2、D3 中一級(jí)功能代謝通路與二級(jí)功能代謝通路的基因豐度呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，即D2＞D3＞D1。

含碳有機(jī)物質(zhì)是微生物的主要能源和碳源。土壤微生物碳代謝途徑多樣，主要有三羧酸循環(huán)、卡爾文循環(huán)、二羧酸-羥基丁酸循環(huán)和3-羥基丙酸雙循環(huán)［6］。利用宏基因組技術(shù)檢測(cè)到的煙田土壤碳代謝基因調(diào)控三羧酸循環(huán)、糖酵解途徑和糖異生途徑。圖7a為土壤碳代謝基因編碼的酶及其調(diào)節(jié)的代謝途徑，可見甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、磷酸甘油酸激酶（PGK）、磷酸甘油酸變位酶（gpmB、gpml、APGM）、2，3-二磷酸甘油酸依賴性磷酸甘油酸變位酶（PGAM）、烯醇酶（ENO）、丙酮酸激酶（pyK）、丙酮酸脫氫酶（aceE、aceF、PDHA、PDHB）調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生途徑；檸檬酸合成酶（gltA）、異檸檬酸脫氫酶（ICD）、蘋果酸脫氫酶（MDH）調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)（TCA）。這表明糖酵解和糖異生途徑在煙田土壤碳循環(huán)過程中較為活躍。

圖7 土壤碳循環(huán)示意圖（包含糖酵解、糖異生和三羧酸循環(huán)）和碳代謝基因豐度熱圖Fig.7 Soil carbon cycle diagram（including glycolysis，gluconeogenesis and tricarboxylic acid cycle）and carbon metabolism gene abundance heatmap

圖7b 為碳代謝基因豐度熱圖，可見二羧酸-羥基丁酸循環(huán)相關(guān)基因（atoB、coxL、ACSS）和三羧酸循環(huán)相關(guān)基因（pdhD、fdfH、sdhA、gltA、aceF、aceE、korA）豐度占比較高。這表明煙田主要固碳途徑為二羧酸-羥基丁酸循環(huán)和三羧酸循環(huán)。綜合圖7a和圖7b可見，上述酶基因豐度呈現(xiàn)出健康煙田D1高于易感病煙田D2、D3的規(guī)律性。

利用宏基因組技術(shù)檢測(cè)到的煙田土壤氮代謝基因，調(diào)控硝酸鹽還原、異化硝酸鹽還原、硝化、反硝化、固氮和谷氨酸合成［6］。由此，繪制鳳凰村煙田土壤氮循環(huán)示意圖，并標(biāo)注出相關(guān)過程的酶基因，如圖8a所示。調(diào)控亞硝酸鹽還原（Nitrite reduction）和一氧化氮還原（Nitric-oxide reduction）的功能基因占7.90%，調(diào)控硝酸鹽還原（Nitrate reduction）的功能基因占31.70%，調(diào)控羥胺氧化（Hydroxylamine oxidation）和一氧化二氮還原（Nitrous-oxide reduction）的功能基因占3.69%，調(diào)控氨氧化（Ammonia oxidation）和固氮（N fixation）的功能基因占11.20%，調(diào)控谷氨酸合成（Glutamate synthesis）的功能基因占32.70%。煙田土壤中谷氨酰胺合成酶（glnA）、谷氨酸合成酶（gltB、gltD）、谷氨酸脫氫酶（GDH2、gdhA）、同化硝酸鹽還原酶（nasA、narG、narH、narL、nasB）、亞硝酸還原酶（nirK、nirA、nirB）、一氧化氮還原酶（norB）、氧化亞氮還原酶（nosZ）、亞硝酸鹽氧化還原酶（nxrA、nxrB）活性較高。

圖8 土壤氮循環(huán)示意圖和氮代謝基因豐度熱圖Fig.8 Soil nitrogen cycle diagram and nitrogen metabolism gene abundance heatmap

由氮代謝基因豐度熱圖（圖8b）可見，煙田土壤谷氨酸合成基因（glnA、GDH2、gdhA、gltB、gltD）、反硝化基因（narG、narH、nasA、narL、nasB、norB、nirK）、硝化基因（nxrB、nxrA）豐度較高。這表明煙田土壤氮代謝以谷氨酸合成、反硝化和硝化作用為主。在反硝化過程中，健康煙田D1土壤氮代謝基因nasA、narG、narH、narL、napA、nasB、nirK、nirS、norB、norC、nosZ的豐度均低于易感病煙田D2、D3。

3 討論

不同健康狀態(tài)的煙田中土壤微生物群落組成不同［20］。健康與易感病煙田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有明顯差異。在鳳凰村健康和易感病煙田土壤中，放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）為優(yōu)勢(shì)菌門，與黃闊等［21］和WU X 等［22］發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)菌門結(jié)果一致。優(yōu)勢(shì)菌屬慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、鏈 霉 菌 屬（Streptomyces）、分 枝 桿 菌 屬（Mycobacterium）為有益菌屬［23-25］，這3個(gè)優(yōu)勢(shì)有益菌屬在健康煙田D1 中的相對(duì)豐度均極顯著高于易感病煙田D2、D3。慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）在農(nóng)田環(huán)境和作物根際中發(fā)揮較大的固氮潛能，為重要的植物根際促生菌［23-24］；鏈霉菌屬（Streptomyces）為拮抗菌，產(chǎn)生多種抗生素，對(duì)煙草土傳病害有一定的生防作用［25］；分枝桿菌屬（Mycobacterium）能夠拮抗多種細(xì)菌產(chǎn)生的病害［25］。非優(yōu)勢(shì)菌屬固定桿菌屬（Conexibacter）、纖線桿菌屬（Ktedonobacter）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）為有益菌屬［26-29］，這3 個(gè)非優(yōu)勢(shì)有益菌屬在健康煙田D1 中的相對(duì)豐度均高于易感病煙田D2、D3。固定桿菌屬（Conexibacter）可增強(qiáng)土壤微生物群落的穩(wěn)定性，在土壤-植物系統(tǒng)的氮循環(huán)中發(fā)揮作用［26］；纖線桿菌屬（Ktedonobacter）為土壤中有益菌屬［27］；鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）可抵抗多種病原菌［28］，具有顯著的生物降解和生物合成能力，在維持土壤氮平衡方面起著重要作用［29］。慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）屬于變形菌門，鏈霉菌屬（Streptomyces）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）和固定桿菌屬（Conexibacter）屬于放線菌門。徐新雯等［30］和Trivedi等［31］等研究發(fā)現(xiàn)，放線菌門豐度越高，煙田土壤抗病能力越大，可能是因?yàn)榇蟛糠治⑸锞哂休^強(qiáng)的抗病性。健康煙田土壤環(huán)境有利于這些有益菌屬的生長(zhǎng)，可在一定程度上抵制病原菌生長(zhǎng)以減少土傳病害的發(fā)生。

本研究中易感病煙田D2、D3的各項(xiàng)土壤化學(xué)性質(zhì)均高于健康煙田D1，這可能是因?yàn)橐赘胁熖锏母祷顒?dòng)下降，吸收養(yǎng)分的能力變?nèi)?，?dǎo)致易感病煙田土壤養(yǎng)分含量過剩，且崔永和［32］研究表明富營(yíng)養(yǎng)化會(huì)導(dǎo)致煙草病害頻發(fā)。土壤酶活性是反映土壤質(zhì)量和生物活性的重要指標(biāo)［33-34］。本研究中易感病煙田D2、D3 的URE、ACP 活性高于健康煙田，易感病煙田D3的INV活性高于健康煙田，初步推測(cè)可能與易感病煙田中各項(xiàng)化學(xué)性質(zhì)指標(biāo)均高于健康煙田有關(guān)，但其作用機(jī)制還有待深入研究。URE 受土壤微生物數(shù)量、有機(jī)質(zhì)含量影響，可反映土壤中氮素情況［35］；ACP參與土壤磷的循環(huán)，可以將有機(jī)形式的磷轉(zhuǎn)化為可被植物利用的無(wú)機(jī)磷［36］；INV 可促進(jìn)土壤中有機(jī)質(zhì)的分解，提升土壤肥力水平［36］。本研究中健康煙田D1 的PR 活性顯著高于易感病煙田D2、D3。PR可將土壤中蛋白質(zhì)分解成氨基酸，是提高煙葉質(zhì)量的一種有效方法［37］。

本研究中3 塊煙田土壤的6 類一級(jí)功能代謝通路中代謝的基因豐度最高，且占比均超過70%，說明土壤微生物的代謝旺盛，與劉坤和等［38］的研究結(jié)果一致。土壤微生物代謝是各菌屬與環(huán)境之間的物質(zhì)和能量交換過程［39］。本研究中易感病煙田D2、D3的功能基因豐度占比較高，這與張仁軍等［40］的研究結(jié)果基本一致，推測(cè)其代謝相關(guān)的功能基因與煙草病害的發(fā)生密不可分，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

宏基因組技術(shù)檢測(cè)分析表明，健康煙田細(xì)菌的組成、相對(duì)豐度與易感病煙田之間存在差異。健康煙田中有益菌屬的相對(duì)豐度高于易感病煙田，而易感病煙田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)失衡，有益菌減少，對(duì)病原菌的拮抗能力減弱。土壤微生物碳代謝途徑以三羧酸循環(huán)、糖酵解和糖異生途徑為主，健康煙田土壤中關(guān)鍵酶基因豐度均高于易感病煙田。土壤微生物氮代謝途徑以谷氨酸合成、硝化和反硝化過程為主，健康煙田反硝化過程中酶基因豐度低于易感病煙田。