再造煙葉煙氣中29種有機(jī)酸的定量測定

李偉雪，顧麗莉*，楊發(fā)容，劉 洋，蔡潔云，王惠平

1.昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，昆明市呈貢區(qū)景明南路727 號 650500

2.云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站，昆明市高新開發(fā)區(qū)科醫(yī)路41 號 650106

再造煙葉由煙末和煙梗等煙草廢料經(jīng)過一定處理后加工而成，因其在卷煙“減害、降焦、降耗”等方面的重要貢獻(xiàn)成為卷煙產(chǎn)品的重要原料［1-5］，其中所含致香成分的種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)對卷煙產(chǎn)品的內(nèi)在品質(zhì)具有重要影響。有機(jī)酸作為煙草中重要的香味物質(zhì)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高低對煙草的吸味具有重要影響，研究煙草中的有機(jī)酸對提升煙草質(zhì)量，改善吸食口感具有重要作用［6-11］。

卷煙煙氣的捕集常采用劍橋濾片［12-13］、靜電捕集［14-15］和冷阱捕集［16-17］等方法。劍橋濾片法捕集的重復(fù)性較好，但其成本較高，分析處理復(fù)雜；靜電沉降捕集法具有實驗重復(fù)性好和分析時背景干擾低等優(yōu)點，但該法易形成臭氧及人為產(chǎn)物，分析結(jié)果不準(zhǔn)確；冷阱捕集法可減少副反應(yīng)的發(fā)生且準(zhǔn)確性較高，但要求樣品中不含水分，使其應(yīng)用受限。煙草中有機(jī)酸的檢測方法主要有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法［18-19］和高效液相色譜（HPLC）法［20-21］。HPLC法多用于測定難揮發(fā)性有機(jī)酸，對揮發(fā)性有機(jī)酸測定的研究較少，而GC-MS/MS 具有分離效率高、靈敏度高、分析速度快和分析范圍廣等優(yōu)點，能夠很好地分析煙草中的有機(jī)酸。因此，本研究中搭建了捕集再造煙葉煙氣的全新裝置，并結(jié)合GC-MS/MS建立了煙氣中29種有機(jī)酸的分析方法，采用硅烷化衍生-GC-MS/MS 技術(shù)測定了不同條件下再造煙葉煙氣中有機(jī)酸的釋放量，對不同種類再造煙葉中的有機(jī)酸進(jìn)行了比較研究，旨在為再造煙葉致香成分的開發(fā)提供檢測手段和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

選取云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站提供的初烤煙葉及由其采用造紙法制成的再造煙葉作為實驗原料，具體種類及編號：云煙87 紅河蒙自C3F 烤煙（1號）；紅大大理鶴慶C3F烤煙（2號）；研和上部朱砂煙9（3 號）；GP557 石林中部烤煙（4 號）；GP557 研和烤煙（5 號）；K326 紅河彌勒C3F 烤煙（6 號）；NC297 紅河彌勒C3F 烤煙（7 號）；云煙105 研和上部烤煙（8號）；研和中部朱砂煙9（9 號）；云煙105 陸良中部朱砂煙9（10 號）；陸良中部朱砂煙2（11 號）；云煙87 紅河彌勒C3F 烤煙（12 號）；K326 玉溪紅塔C3F 烤煙（13 號）；云煙87 陸良中部烤煙（14 號）；紅大紅河彌勒C3F烤煙（15號）；研和中部朱砂煙2（16號）；陸良上部朱砂煙2（17號）；云煙87陸良上部烤煙（18號）；云煙105 研和中部烤煙（19 號）；云煙87 研和中部烤煙（20號）；云煙100陸良朱砂煙7（21號）；云煙87玉溪江川C3F烤煙（22號）；研和上部朱砂煙2（23號）；云煙115 曲靖宣威C3F 烤煙（24 號）；云煙87 研和上部烤煙（25號）。

二氯甲烷（色譜純，云南利妍科技有限公司）；石油醚、正己烷、乙醇、乙腈（AR，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；丙酮（AR，成都市科龍化工試劑廠）；甲醇（AR，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；三氯甲烷［AR，重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司］；氮氣（＞99%，昆明鵬翼達(dá)氣體產(chǎn)品有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)品：乙酸（97.0%）、2-甲基丙酸（98.0%）、丁酸（98.0%）、3-甲基丁酸（99.0%）、戊酸（98.0%）、4-甲基戊酸（99.0%）、己酸（98.0%）、庚酸（97.0%）、十三酸（99.5%）、十四酸（99.1%）、十六酸（99.8%）、十七酸（99.5%）、十八酸（98.4%）、亞麻酸（99.0%）、亞油酸（98.9%）、甘油酸（98.5%）、3-羥基丁酸（98.5%）、反-2-己烯酸（98.0%）、N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺［N，O-Bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA，98.0%］、吡啶（AR）（百靈威科技有限公司）；2-呋喃甲酸（98.0%）、乙酰丙酸（97.7%）、羥基乙酸（99.5%）、苯甲酸（99.9%）、間甲基苯甲酸（99.6%）、3-羥基苯甲酸（99.7%）、十二酸（99.4%）、十五酸（99.3%）、辛酸（99.7%）、壬酸（97.3%）、癸酸（99.6%）、油酸（99.3%）、肉桂酸（99.9%）（壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；N-叔丁基二甲基硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺（N-（tert-Butyldimethylsilyl）-N-methyltrifluoroacetamide，MTBSTFA，97.0%）、N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺（［N-Methyl-N-（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，MSTFA，97.0%］、三甲基氯硅烷（Trimethylchlorosilane，TMCS，98.0%）（昆明楚昊經(jīng)貿(mào)有限公司）；飽和食鹽水（實驗室自制）。

BTF-1200C-S 型管式爐（安徽貝意克設(shè)備技術(shù)有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市城東新瑞儀器廠）；7890B-5977A 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測儀（美國Agilent公司）；BJ-800A高速多功能粉碎機(jī)（德清拜杰電氣有限公司）；有機(jī)相微孔濾膜（0.22 μm，天津津騰實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 再造煙葉煙氣中有機(jī)酸捕集裝置的搭建

煙氣捕集裝置為實驗室自制，裝置示意圖如圖1所示。

圖1 管式爐及煙氣捕集和吸收裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of a tube furnace and smoke capture and absorption device

煙氣捕集裝置的特征：管式爐加熱煙草原料產(chǎn)生煙氣，從進(jìn)氣口通入一定流量的空氣或氮氣，分別提供有氧或無氧環(huán)境并將煙氣吹進(jìn)浸沒在結(jié)冰飽和食鹽水的吸收瓶中，串聯(lián)兩個吸收瓶以使吸收溶劑盡可能地將煙氣捕集完全。

1.2.2 煙氣捕集

（1）為減少稱量過程中因煙葉含水率的不同而造成的實驗誤差，將初烤煙葉在40 ℃緩慢烘干，經(jīng)高速多功能粉碎機(jī)間歇多次粉碎后，過孔徑0.425 mm（40 目）篩，得到初烤煙葉粉末，即為初烤煙葉樣品。將初烤煙葉粉末采用造紙法制成再造煙葉，得到再造煙葉樣品。

（2）稱取0.1 g 初烤/再造煙葉樣品均勻鋪于60 mm×30 mm的石英舟中，將石英舟置于爐管中央，蓋上爐蓋，按照圖1將裝置連接完成。

（3）有氧操作。打開進(jìn)氣閥和出氣閥，以10 mL/min 的流量從進(jìn)氣口通入空氣；設(shè)置升溫程序，以10 ℃/min的升溫速率加熱至250 ℃，保持10 min，用空氣吹掃60 min；以60 mL 吸收劑捕集煙氣得到吸收液，將吸收液用有機(jī)相微孔濾膜過濾；取1 mL 濾液，加入150 μL BSTFA，于60 ℃衍生50 min后進(jìn)行GC-MS/MS分析。

（4）無氧操作。以100 mL/min 流量的氮氣吹掃捕集裝置20 min 后再進(jìn)行煙氣捕集，除加熱和吸收過程均通入氮氣外，其他步驟同有氧操作。

1.2.3 GC-MS/MS分析條件

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：分別準(zhǔn)確稱取10 mg 29 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品于不同的燒杯中，分別用二氯甲烷溶解后定量轉(zhuǎn)移至10 mL 不同的容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的29 種有機(jī)酸的單標(biāo)儲備液。分別移取100 μL各單標(biāo)儲備液至同一個25 mL 容量瓶中，用二氯甲烷定容，得4 μg/mL 的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4 ℃冷藏，避光保存。

混合內(nèi)標(biāo)儲備液的配制：分別準(zhǔn)確稱取10 mg反-2-己烯酸和肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)品于不同的燒杯中，分別用二氯甲烷溶解后定量轉(zhuǎn)移至不同的10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL 的內(nèi)標(biāo)儲備液。分別準(zhǔn)確移取100 μL內(nèi)標(biāo)儲備液至同一個50 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容，得2 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)儲備液，4 ℃冷藏、避光保存。

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定：準(zhǔn)確移取25、50、100、150、200、250、500、750、1 000、1 250 μL 有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別置于10個10 mL容量瓶中，并各加入250 μL混合內(nèi)標(biāo)儲備液，用二氯甲烷定容，配制成終質(zhì)量濃度為10、20、40、60、80、100、200、300、400、500 ng/mL的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。各取1 mL不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入25 μL BSTFA，60 ℃水浴衍生50 min，冷卻至室溫后，進(jìn)行GC-MS/MS分析。

1.2.5 有機(jī)酸定量分析方法的建立

MS1 Scan掃描模式確認(rèn)母離子：取高濃度有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行MS1 Scan模式全掃描，掃描范圍為35～400 amu，優(yōu)化色譜條件使各化合物色譜峰分離，通過保留時間和譜庫檢索，確定各有機(jī)酸硅烷化產(chǎn)物及其保留時間，選擇豐度最高的離子作為母離子。

Product ion 掃描模式選擇子離子：根據(jù)MS1 Scan 掃描中確定的母離子進(jìn)行Product ion 掃描，確定各有機(jī)酸硅烷化產(chǎn)物的時間片斷和駐留時間，觀察各組分母離子的子離子掃描圖，選擇豐度最高的特征子離子作為MRM方法的子離子。

MRM 方法的建立：對各硅烷化產(chǎn)物的子、母離子對分別設(shè)定不同碰撞池電壓（5～60 V）的運行序列，優(yōu)選各子離子的最佳碰撞能量，并采用優(yōu)化的子、母離子和碰撞能量建立MRM方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙氣捕集條件的優(yōu)化

以有機(jī)酸種類和色譜峰面積為指標(biāo)，考察了6種有機(jī)溶劑（二氯甲烷、丙酮、石油醚、甲醇、正己烷和三氯甲烷）對再造煙葉煙氣捕集的吸收效果，基于所選溶劑進(jìn)一步對吸收溶劑用量（30、40、50、60、70、80 mL）、氣體吹掃時間（30、45、60、75、90、105 min）和加熱升溫速率（5、10、15、20、25、30 ℃/min）等因素進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，二氯甲烷和三氯甲烷的提取效果相較其他溶劑均較好?？紤]到三氯甲烷屬于易制毒有機(jī)溶劑，最終選擇二氯甲烷作為吸收溶劑。二氯甲烷的體積為60 mL時對煙氣中有機(jī)酸的吸收效果最好；隨著吹掃時間的不斷增加，有機(jī)酸種類呈現(xiàn)先增加后不變的變化趨勢，當(dāng)氣體吹掃時間大于60 min 后，增加吹掃時間對吸收效果基本無影響；隨著升溫速率的增大，有機(jī)酸的種類呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢，升溫速率為10 ℃/min時對煙氣中有機(jī)酸的吸收效果最好。故最終確定的捕集條件：二氯甲烷為吸收劑、其用量為60 mL，氣體吹掃時間為60 min，加熱升溫速率為10 ℃/min。

2.2 衍生化試劑及介質(zhì)的選擇與衍生條件的優(yōu)化

共選擇了BSTFA、MTBSTFA、MSTFA、BSTFA+1% TMCS 4 種衍生化試劑，分別選取二氯甲烷、乙腈和吡啶3種溶劑作為衍生化介質(zhì)，對所選衍生化試劑分別在20、30、40、50、60、70、80 ℃的條件下衍生20、30、40、50、60、70、80 min，加入衍生化試劑的量分別為25、50、75、100、125、150、175、200 μL，采用29種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液對不同衍生條件的衍生效果進(jìn)行實驗，每組實驗重復(fù)5次，取平均值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①BSTFA 衍生產(chǎn)物的出峰干凈，雜峰少，響應(yīng)值較高，適合作為有機(jī)酸的衍生化試劑；②二氯甲烷作為衍生介質(zhì)的效率相對其他衍生試劑和介質(zhì)均較高，衍生化較完全；③衍生溫度為60 ℃，衍生時間為50 min，BSTFA用量為150 μL時，衍生化效率最高。

2.3 有機(jī)酸定量分析方法的建立

按照1.2.5 節(jié)所述進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化，確定每種有機(jī)酸對應(yīng)的母離子和子離子，并對碰撞能量進(jìn)行優(yōu)選，建立了MRM方法。優(yōu)化后的具體質(zhì)譜掃描參數(shù)見表1，29種有機(jī)酸的分離色譜圖見圖2。

表1 有機(jī)酸的質(zhì)譜掃描參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry parameters for the target organic acids

圖2 29種有機(jī)酸的分離色譜圖Fig.2 An example of a separation chromatogram of the 29 organic acids

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限（LOD）和定量限（LOQ）

采用內(nèi)標(biāo)法定量，以各目標(biāo)物的色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比對各目標(biāo)物濃度進(jìn)行線性回歸分析，得到各目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)。將最低濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液重復(fù)進(jìn)樣10次，計算其標(biāo)準(zhǔn)偏差，分別以3 倍和10 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為方法的檢出限和定量限，結(jié)果見表2。

表2 29種有機(jī)酸的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Tab.2 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients,limits of detection（LOD）and limits of quantification（LOQ）for the 29 organic acids

表2 表明，在所測定的濃度范圍內(nèi)，有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)大多在0.995 以上，線性關(guān)系良好，檢出限和定量限分別在0.83～17.57 ng/g 和2.77～58.56 ng/g范圍內(nèi)。

2.4.2 加標(biāo)回收率和精密度實驗

選擇某一再造煙葉樣品，按照1.2.2 節(jié)所述方法進(jìn)行煙氣捕集和檢測前處理，分別添加不同水平（本底量的約0.5、1.0、2.0倍）的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加水平下分別制備6個平行樣品，采用建立的MRM方法分析；根據(jù)各組樣品中各有機(jī)酸的測定結(jié)果，計算方法的加標(biāo)回收率和精密度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各有機(jī)酸的加標(biāo)回收率在85.68%～108.32%范圍內(nèi)，RSD值在1.19%～7.66%范圍內(nèi)。這表明該方法的回收率較好，適用于煙草中有機(jī)酸的定量測定。

2.4.3 重復(fù)性實驗

對同種再造煙葉樣品采用建立的MRM 方法進(jìn)行6 次平行測定后，計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示，29種有機(jī)酸的RSD值在0.63%～5.37%范圍內(nèi)，表明該方法的重復(fù)性較好。

2.5 實際樣品的檢測

2.5.1 有氧和無氧氛圍下再造煙葉煙氣中有機(jī)酸成分的對比分析

依據(jù)前述方法，以25 種初烤煙葉制成的再造煙葉為原料，分別在有氧和無氧氛圍下對其煙氣中的29種有機(jī)酸進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 有氧和無氧氛圍下25種再造煙葉樣品煙氣的有機(jī)酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.3 Total mass fractions of organic acids in smoke from 25 reconstituted tobacco samples detected in aerobic and anaerobic atmosphere

圖3 顯示，25 種再造煙葉樣品煙氣的有機(jī)酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大，同種再造煙葉樣品煙氣在不同氛圍下的有機(jī)酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)也有一定差異；整體上看，有氧條件更利于有機(jī)酸的釋放。這可能是氮氣條件下再造煙葉只發(fā)生熱解反應(yīng)；而在有氧條件下，除發(fā)生熱解反應(yīng)外，還發(fā)生了氧化反應(yīng)，很多有機(jī)酸是氧化反應(yīng)的產(chǎn)物［22］。

2.5.2 初烤煙葉和再造煙葉煙氣中有機(jī)酸成分的對比分析

依據(jù)前述方法，以25 種初烤煙葉及由其制成的再造煙葉樣品為原料，在有氧氛圍中對兩種原料煙氣中的29種有機(jī)酸進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 初烤煙葉和再造煙葉樣品煙氣中有機(jī)酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的對比Fig.4 Total mass fractions of organic acids in smoke from cured tobacco and reconstituted tobacco samples

由圖4 可知，整體上看，25 種初烤煙葉和再造煙葉樣品加熱產(chǎn)生的煙氣中有機(jī)酸的釋放量差異均較大。該差異可能是由煙葉的產(chǎn)地和等級不同造成的。對比初烤煙葉及由其制成的再造煙葉樣品可知，25 種初烤煙葉樣品煙氣含有的29 種有機(jī)酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于由其制成的再造煙葉樣品?？梢?，再造煙葉的制作過程會使有機(jī)酸類成分的釋放量增加。

2.5.3 不同溫度下再造煙葉樣品煙氣中有機(jī)酸成分的對比分析

依據(jù)前述方法，以10 種初烤煙葉制成的再造煙葉樣品為原料，在有氧氛圍中分別加熱至150、200、250、300、350、400 ℃，并用二氯甲烷對每個溫度下產(chǎn)生的煙氣捕集后進(jìn)行衍生，最后采用MRM方法對29種有機(jī)酸進(jìn)行定量分析。結(jié)果如圖5和圖6所示。

圖5 10種再造煙葉樣品在不同溫度下釋放的有機(jī)酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.5 Total mass fractions of organic acids released from 10 reconstituted tobacco samples at different temperatures

圖6 有氧氛圍、不同溫度下12號再造煙葉樣品煙氣中各有機(jī)酸的釋放量對比Fig.6 Releases of organic acids in smoke from reconstituted tobacco sample No.12 at different temperatures in an aerobic atmosphere

由圖5 可知，隨著加熱溫度的升高，再造煙葉煙氣中有機(jī)酸的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增加后降低。不同種類再造煙葉樣品煙氣的有機(jī)酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的峰值略有差別，但均集中在250～300 ℃區(qū)間，表明在此溫度區(qū)間有機(jī)酸得到大量釋放。原因可能是該溫度區(qū)間達(dá)到了大多數(shù)有機(jī)酸的沸點，如十二酸的沸點為299 ℃，十四酸的沸點為250 ℃。

圖6為云煙87紅河彌勒C3F烤煙制成的再造煙葉樣品在有氧氛圍、不同溫度下煙氣中29種有機(jī)酸的釋放量對比。由圖6可知，在不同溫度下各有機(jī)酸間的釋放量差異均較大。其中，羥基乙酸在各個溫度下的釋放量均為最高，甘油酸次之，乙酸、4-甲基戊酸、己酸、庚酸和壬酸等揮發(fā)性有機(jī)酸的釋放量較低，辛酸及亞麻酸、亞油酸、十七酸和十八酸等高級脂肪酸的釋放量較高。

3 結(jié)論

（1）搭建了管式爐煙氣捕集裝置并建立了再造煙葉煙氣中29種有機(jī)酸的分析方法，采用硅烷化衍生聯(lián)合GC-MS/MS 技術(shù)可測定不同條件下再造煙葉煙氣中的有機(jī)酸釋放量。

（2）在不同溫度和環(huán)境氛圍下再造煙葉樣品煙氣的檢測結(jié)果表明，25 種初烤煙葉及由其制成的再造煙葉樣品煙氣中的有機(jī)酸總釋放量，再造煙葉大于初烤煙葉，且有氧氛圍相對無氧環(huán)境更有利于有機(jī)酸的釋放。

（3）對不同溫度下再造煙葉煙氣中有機(jī)酸釋放量進(jìn)行對比分析發(fā)現(xiàn)，250～300 ℃區(qū)間有機(jī)酸的總釋放量最大。