缺血性腦卒中患者發(fā)生氯吡格雷抵抗的危險因素分析

王亞娟，趙 燕，李維亮，余愛榮 （1.湖北科技學(xué)院, 湖北 咸寧 437000；.中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床藥學(xué)科, 湖北 武漢 430070）

在全球范圍內(nèi)，缺血性腦卒中（IS）仍然是導(dǎo)致 死亡和嚴(yán)重殘疾的最主要原因之一[1]。在IS 的治療過程中，除因出血風(fēng)險而存在禁忌外，幾乎所有IS 的患者都應(yīng)給予抗血小板藥物進行二次卒中預(yù)防[2]， 阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷的雙重抗血小板治療在IS 發(fā)病早期發(fā)揮著重要作用[3]。然而臨床應(yīng)用中，腦血管病患者在服用氯吡格雷藥物治療期間存在個體差異,一些患者在服藥后出現(xiàn)了病情反復(fù)發(fā)作或者病情加重的現(xiàn)象，稱為氯吡格雷抵抗（CR）[4]。研究表明，導(dǎo)致氯吡格雷抵抗的因素是多種多樣的，尚無統(tǒng)一的結(jié)論。包括性別[5-6]、年齡[6]、BMI[6-7]、糖尿病[5,8]、高脂血癥[8]、高同型半胱氨酸[5，8]、藥物間相互作用[8]（鈣離子拮抗劑、質(zhì)子泵抑制劑）、遺傳基因多態(tài)性[9-10]（參與氧化代謝的相關(guān)基因CYP2C19、與其活化有關(guān)基因ABCB1）等均會導(dǎo)致該藥物出現(xiàn)抵抗現(xiàn)象。但亦有部分研究報道得出相反結(jié)論[11]。且研究主要集中于心血管領(lǐng)域，尤其是經(jīng)皮冠狀動脈介入（PCI）術(shù)后患者，而針對IS 患者發(fā)生CR 影響因素的報道相對較少。氯吡格雷屬于噻吩吡啶類化學(xué)衍生物，需要在多種酶的參與下才能夠生成有活性的化合物，該活性代謝產(chǎn)物與血小板上的二磷酸腺苷（ADP）受體P2Y12 共價特異性地結(jié)合，減少ADP 所刺激的血小板凝聚，阻斷ADP 誘導(dǎo)的糖蛋白與纖維蛋白原PIIb/IIIa 受體的結(jié)合，發(fā)揮抗栓的效應(yīng)[12-13]。故本研究利用血栓彈力圖（TEG）測定ADP 數(shù)值，對腦卒中患者的基線資料及CYP2C19 基因多態(tài)性進行統(tǒng)計分析，評估產(chǎn)生CR 現(xiàn)象的影響因素，為IS 臨床個體化用藥、預(yù)測卒中復(fù)發(fā)風(fēng)險提供精準(zhǔn)醫(yī)療方案。

1 材料和方法

1.1 研究對象

本研究利用HIS 系統(tǒng)選取2021 年4 月至2022 年7 月在中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的IS 患者。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國腦急性缺血性腦卒中診治指南》[14]或IS 的相關(guān)診斷，且經(jīng)CT 或MRI 影像學(xué)等證實；②年齡均>18 歲；③未進行靜脈溶栓或取栓治療；④均采用氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林進行抗血小板治療。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在出血性疾病或顱內(nèi)感染者；②合并惡性腫瘤或嚴(yán)重心、肝、肺、腎臟器官功能衰竭者；③有認(rèn)知障礙者；④依從性差者；⑤對本研究藥物過敏者。該研究已獲得中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)，審查號：[2021]025-01。

1.2 治療方法

所有入組患者入院后均給予改善循環(huán)（銀杏達莫）、穩(wěn)定血斑塊（阿托伐他?。⒆o胃（泮托拉唑）等常規(guī)治療。在常規(guī)治療基礎(chǔ)上給予阿司匹林（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，國藥準(zhǔn)字：J20171021，規(guī)格：100 mg/片）100 mg 每日一次和硫酸氫氯吡格雷[賽諾菲（杭州）制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20056410，規(guī)格：75 mg/片]75 mg 每日一次，均為3 個月一個療程。同時根據(jù)基礎(chǔ)疾病給予降血壓、降血糖及調(diào)血脂治療。

1.3 資料收集

收集所有入組患者的基線資料，包括姓名、性別、年齡、既往有無高血壓病、糖尿病、冠心病、高脂血癥、吸煙史（戒煙小于5 年）、飲酒史（戒酒小于5 年）、既往有無缺血性腦卒中病史及患者住院期間合并用藥等。記錄患者在住院后次日清晨空腹采集的靜脈血各項檢驗指標(biāo)，包括血常規(guī)、肝腎功能、凝血功能等。

1.4 TEG 及相關(guān)參數(shù)測定

患者在服用阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷藥物7～14 d，空腹采集靜脈血，分別注射入檸檬酸鈉抗凝管1 和肝素抗凝管2 中。利用TEG-5000 型TEG 凝血分析儀（美國Haemoscope 公司）檢測檸檬酸-高嶺土樣品，得出ADP 抑制率。將血小板聚集抑制率>30%定義為氯吡格雷非抵抗，血小板聚集抑制率≤30%定義為氯吡格雷抵抗[15]。

1.5 CYP2C19 基因檢測

患者入院后次日清晨空腹抽取靜脈血4 ml 于EDTA 抗凝管中，利用全自動雜交儀系統(tǒng)（BR-526-24,上海百傲科技公司）對CYP2C19*1、CYP2C19*2及CYP2C19*3 位點進行檢測。該檢測過程主要包括全血DNA 的提取、PCR 擴增、芯片雜交顯色，利用基因芯片識讀儀自動讀取結(jié)果。根據(jù)CYP2C19基因多態(tài)性進行藥物代謝分組[16]，即：快代謝組：EM，CYP2C19*1*1，中代謝組：IM,CYP2C19*1*2、CYP2C19*1*3， 慢 代 謝 組： PM,CYP2C19*2*2、CYP2C19*2*3、CYP2C19*3*3。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料服從正態(tài)分布，采用（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。若計量資料屬于非正態(tài)分布，則以中位數(shù)和四分位數(shù)[M(P25，P75)]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)和百分比[例（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，將IS 患者發(fā)生氯吡格雷抵抗的影響因素進一步進行多因素Logisti 回歸分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線資料分析

本研究共納入缺血性腦卒中患者202 例，年齡35～86 歲，其中，CR 組87 例，NCR 組115 例，CR組患者合并糖尿病的比例明顯高于NCR 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在性別、年齡、吸煙、飲酒、既往有無缺血性腦卒中、高血壓病、冠心病、高脂血癥及合并用藥方面，兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 抵抗組和非抵抗組患者基線資料比較

2.2 實驗室檢驗指標(biāo)分析

氯吡格雷抵抗組血常規(guī)的白細(xì)胞計數(shù)水平高于非抵抗組，且組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。兩組患者紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板計數(shù)、凝血酶原時間、D-二聚體、血糖、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白、超敏C 反應(yīng)蛋白、血同型半胱氨酸、直接膽紅素、總膽紅素、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

表2 兩組患者實驗室檢測指標(biāo)比較

2.3 CYP2C19 基因多態(tài)性分布

入選的202 名患者中，CYP2C19 *1、CYP2C19 *2及CYP2C19*3 等位基因的頻率分別為62.26%、33.17%及4.21%，所有基因位點均符合Hardy-Weinberg 平衡定律，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），表明該群體具有代表性，詳見表3。

表3 202 例IS 患者 CYP2C19 基因型及等位基因的頻率分布

2.4 不同CYP2C19 代謝類型患者發(fā)生氯吡格雷抵抗的比較

CYP2C19 IM 組患者發(fā)生氯吡格雷抵抗的比例顯著高于EM 組和PM 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表4。

表4 不同CYP2C19 代謝類型的CR 發(fā)生率比較(n，%)

2.5 CYP2C19 不同基因型血小板抑制率的比較

3 組IS 患者中ADP 抑制率均不符合正態(tài)分布，因此采用非參數(shù)檢驗。EM 組ADP 抑制率的中位數(shù)為39.6%，IM 組為26.10%，PM 組為31.95%。3 組血小板抑制率中位數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；兩兩比較，IM 組的血小板抑制率明顯低于EM 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；其他組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），詳見表5。

2.6 發(fā)生氯吡格雷抵抗的危險因素分析

以發(fā)生CR 作為因變量，將上述研究中存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）的項目作為自變量進行賦值，包括合并糖尿?。ㄎ春喜⑻悄虿≌哔x值0，合并糖尿病者賦值1）、CYP2C19 代謝類型（IM 賦值1，其余賦值0），白細(xì)胞計數(shù)為連續(xù)型數(shù)值變量，納入二元Logistic 回歸模型中進行分析。結(jié)果顯示，合并糖尿病、高白細(xì)胞計數(shù)水平、CYP2C19 中代謝型為發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨立危險因素，見表6。

表6 發(fā)生氯吡格雷抵抗危險因素的Logistic 回歸分析結(jié)果

3 討論

氯吡格雷是繼阿司匹林后在心腦血管中被廣泛使用的抗血小板藥物。有報道表明氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林在治療缺血性腦卒中療效優(yōu)于單獨使用阿司匹林，且不會增加腦卒中患者發(fā)生出血的風(fēng)險[3，17]。在臨床應(yīng)用中仍有一些患者在服用氯吡格雷后，不能夠抑制ADP 誘導(dǎo)的血小板凝聚，也稱為氯吡格雷抵抗或者氯吡格雷低反應(yīng)性[4]。目前國際上關(guān)于氯吡格雷抵抗的診斷并無確切的標(biāo)準(zhǔn)[18]，有文獻稱化學(xué)比濁法屬于比較經(jīng)典的血小板功能檢測方法，但是由于在操作過程中步驟比較繁多且尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化流程，現(xiàn)已逐漸被其它檢測方法所取代[19]。有國外研究報道將床旁快速血小板分析（Verify Now）檢測系統(tǒng)的檢測結(jié)果定義為“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是由于該檢測方法成本較高，因此在國內(nèi)臨床中并沒有被大規(guī)模應(yīng)用。而現(xiàn)在國內(nèi)較常使用的抗血小板效果的監(jiān)測方法有TEG、血小板分析儀、PL-11 等，TEG 檢測血小板功能操作便捷、迅速、受外界影響較小等優(yōu)點，現(xiàn)已在臨床中被廣泛使用[20]。

氯吡格雷本身屬于無活性的前體藥物，需在多種酶的參與下生成有活性的化合物，才能發(fā)揮抑制血小板聚集作用。細(xì)胞色素P450 酶參與了兩步氧化代謝過程。國外有研究報道[21]CYP2C19*2、CYP2C19*3 等位基因的突變主要以亞洲人為主，發(fā)生在非洲和歐洲的突變率較低，攜帶CYP2C19*2、CYP2C19*3 基因的突變可降低細(xì)胞色素P450 酶的活性，使得活性代謝物的水平減少，從而導(dǎo)致該藥物的臨床療效不佳，所以IM 和PM 組氯吡格雷抗血小板活性會受到CYP2C19 基因多態(tài)性的影響。本研究結(jié)果顯示，CYP2C19 IM 組患者發(fā)生氯吡格雷抵抗的比例顯著高于EM 組和PM 組，血小板抑制率明顯低于EM 組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，而PM 組血小板抑制率雖然低于EM 組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是PM 組（14.36%）人群占比顯著低于IM 組（46.04%）和EM 組（39.60%）造成的。

目前已有研究表明糖尿病患者在服用氯吡格雷后血小板抑制率較差[22-23]，但其機制尚不明確。在小鼠模型中的研究結(jié)果表明，高血糖可以通過下調(diào)CYP 酶影響氯吡格雷藥物活化，從而導(dǎo)致抗血小板濃度降低[24]。Angiolillo 等[25]針對冠心病合并2 型糖尿病患者誘導(dǎo)的血小板抑制率減弱的研究中，解釋其原因可能是長期的高血糖水平使血小板信號通路上調(diào)降低了抗血小板藥物的藥效，從而導(dǎo)致藥物抵抗的發(fā)生。此外，糖尿病會影響肝臟代謝與胃腸道吸收，這可能會影響藥物的吸收和代謝[26]。本研究結(jié)果也顯示，合并糖尿病是發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨立風(fēng)險因素。

本研究結(jié)果還表明高白細(xì)胞計數(shù)可能是IS 患者發(fā)生CR 的獨立危險因素（OR=1.235，95%CI:1.065,1.432），但目前在IS 患者中有關(guān)白細(xì)胞計數(shù)與CR 之間關(guān)系的研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)炎癥標(biāo)志物升高增加心血管事件的風(fēng)險，血小板聚集和炎性因子之間的相互作用在急性冠脈綜合征中起著非常重要的作用，而炎癥調(diào)節(jié)越來越被認(rèn)為是當(dāng)代的治療靶點，接受氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林雙重抗血小板治療的急性冠狀動脈綜合征的患者中，白細(xì)胞計數(shù)與臨床療效密切相關(guān)[27]。也有研究者在冠心病患者中發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞中的3 個長鏈非編碼RNA 與CR的發(fā)生有關(guān)[28]。IS 隨著細(xì)胞死亡和腦組織受損，分子危險信號通過激活更多的小膠質(zhì)細(xì)胞和浸潤白細(xì)胞進行前饋反應(yīng)，釋放更多的具有促炎作用的細(xì)胞因子。炎癥加劇了腦細(xì)胞受損程度，使外周血中釋放更多的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子參與了腦卒中的進展，影響其預(yù)后[29-30]。因此，在臨床中，高白細(xì)胞計數(shù)患者服用氯吡格雷時應(yīng)警惕CR 的發(fā)生。

本研究的局限性主要包括以下幾點：①樣本量相對較少；②TEG 檢測過程中受血凝速度、紅細(xì)胞聚集狀態(tài)等因素影響；③患者服藥7～14 d 只檢測1 次ADP 抑制率，不能反應(yīng)整體水平；④未直接檢測血漿氯吡格雷及其活性代謝物水平。上述因素可能對研究結(jié)果產(chǎn)生偏倚，今后還需要進一步的驗證。