基于主要農(nóng)藝性狀的25份涼粉草種質(zhì)資源遺傳多樣性分析與綜合評(píng)價(jià)

蘭秀 阮麗霞 馬仙花 楊海霞 李恒銳 梁振華 黃小娟 張秀芬 周春衡

關(guān)鍵詞：涼粉草；種質(zhì)資源；農(nóng)藝性狀；遺傳多樣性；綜合評(píng)價(jià)

涼粉草（Mesona hLnensis Benth.）又稱仙草、仙人草、仙人凍等，是唇形科涼粉草屬的草本宿根型植物，原產(chǎn)于中國(guó)南部、印度和馬來(lái)西亞等地，在我國(guó)主要分布于浙江、江西、貴州、廣東、福建、廣西、臺(tái)灣等地區(qū)。涼粉草具有很高的營(yíng)養(yǎng)和醫(yī)藥價(jià)值，是一種藥食同源的植物。《中藥大辭典》中介紹涼粉草具有清暑解渴、涼血之功效，能夠治療中暑、熱毒、消渴、高血壓、腎臟病、糖尿病、關(guān)節(jié)肌肉疼痛等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，涼粉草還具有美容養(yǎng)顏、補(bǔ)充維生素、提高免疫力等作用。涼粉草也是很多食品工業(yè)和化學(xué)工業(yè)產(chǎn)品的重要原料：例如，涼粉草的枝葉經(jīng)水煮可提出涼粉草膠用于制龜苓膏、仙草凍、仙草露、仙草膠等；目前市場(chǎng)上流行的80%的涼茶飲料都是以涼粉草為主要原料。涼粉草還可用來(lái)提取咖啡色色素，還是一些草本洗面奶、沐浴露、洗潔精等日用品的原料之一。目前已知的涼粉草有50多個(gè)品種，但主栽品種較單一，且產(chǎn)量不高、抗病性差，導(dǎo)致種質(zhì)退化嚴(yán)重，因此亟需篩選出適合市場(chǎng)需求的優(yōu)異、高產(chǎn)、抗病良種。

遺傳多樣性是生物學(xué)的核心之一，研究植物的遺傳多樣性，有助于對(duì)植物資源進(jìn)行評(píng)價(jià)、選擇、保存和利用，而表型農(nóng)藝性狀多樣性是遺傳多樣性的具體表現(xiàn)，是遺傳基礎(chǔ)與環(huán)境多樣性的綜合體現(xiàn)。我國(guó)有著較為豐富的涼粉草種質(zhì)資源，但近年研究主要關(guān)注涼粉草的有效成分、栽培、加工等方面。雖然對(duì)其也開展了一些有關(guān)遺傳多樣性的研究，但采用的多是傳統(tǒng)的分子標(biāo)記方法，例如：夏微采用SLAF-seq技術(shù)開發(fā)了涼粉草的SNP分子標(biāo)記技術(shù)，并用其揭示了我國(guó)涼粉草種質(zhì)資源的遺傳背景：李曉暉采用SCoT和ISSR兩種分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)7份涼粉草種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)其栽培種間有著明顯的遺傳差異，并將7份種質(zhì)分為3大類群；張桂芳等對(duì)19個(gè)涼粉草樣品進(jìn)行RAPD指紋圖譜的構(gòu)建與遺傳相似性研究，證明了種質(zhì)間存在豐富的遺傳多樣性：陳菁瑛等采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)20份不同種源的仙草進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)種源間的遺傳差異與地理分布關(guān)系不密切而與形態(tài)差異有一定聯(lián)系；Zhang等采用RAPD分子標(biāo)記對(duì)來(lái)自于19個(gè)地區(qū)的涼粉草樣品進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果顯示，涼粉草種質(zhì)間存在著豐富的遺傳多樣性，其地理分布與親緣關(guān)系間有一定的相關(guān)性。雖然分子標(biāo)記技術(shù)具有操作快速、能有效避免自然環(huán)境干擾的特點(diǎn)，但分析結(jié)果不能反映種質(zhì)資源在產(chǎn)量、環(huán)境脅迫與適應(yīng)性等方面的特征，而對(duì)種質(zhì)資源的描述和評(píng)價(jià)仍然主要依靠農(nóng)藝表型。但目前尚缺乏對(duì)涼粉草主要農(nóng)藝表型遺傳多樣性的系統(tǒng)研究。因此，本研究以25份涼粉草種質(zhì)資源為材料，對(duì)其12個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行遺傳多樣性分析，并基于相關(guān)性分析、聚類分析和主成分分析對(duì)這25份種質(zhì)材料進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為篩選適種于廣西龍州的涼粉草種質(zhì)資源及拓寬其基因譜、選育新品種提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)區(qū)概況

本試驗(yàn)于2021年2月在位于廣西龍州縣的廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所基地進(jìn)行。試驗(yàn)區(qū)地處東經(jīng)106°33'～107°12'、北緯22°8'～22°44'之間，海拔200～1045m，坡度8°～15°。屬明顯的南亞熱帶季風(fēng)氣候，熱量豐富，日照充足。年平均氣溫22.3～23.0℃，年極端高溫為41.6℃，年極端低溫為-3.0℃。日照時(shí)數(shù)1582.7h，無(wú)霜期達(dá)350d天以上。雨量充沛，年均降水量1174～1752mm，年蒸發(fā)量1569mm，雨熱同期。

1.2試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用涼粉草種質(zhì)材料于2020年6-10月分別采集于越南及我國(guó)的臺(tái)灣、廣西、廣東、福建和江西等省份（區(qū)），并保存在廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所涼粉草種質(zhì)資源圃（母本園）中，共25份，編號(hào)V1-V25，具體信息見表1。

1.3調(diào)查性狀與試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)面積5m2（1mx5m），每份材料種植3個(gè)小區(qū)，種植行距20cm、株距15cm，重復(fù)間留1m寬過道。觀察并記錄整個(gè)生育期每份種質(zhì)的抗性情況，于成熟期（6月）每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選10株，數(shù)取分枝數(shù)，并從中選5片以上成熟葉片，用便攜式SPAD-502葉綠素儀測(cè)定葉綠素含量（SPAD值），用游標(biāo)卡尺測(cè)葉厚，用鋼卷尺測(cè)量葉長(zhǎng)、葉寬、分枝長(zhǎng)；收獲時(shí)，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)取5株，調(diào)查單株產(chǎn)量并計(jì)算葉重率（除去雜物后，每100g干涼粉草中葉片和葉柄的質(zhì)量總和）和水分含量。

每個(gè)小區(qū)隨機(jī)取15株，在2月中旬（氣溫12℃）觀察植株抗寒性，在4月中旬（生長(zhǎng)盛期）觀察植株病蟲害情況，在6月（氣溫32℃以上）觀察植株萎蔫情況，分別記錄植株受害程度（≥75%、50%～75%、25%～50%、≤25%）。為了便于統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)抗性性狀（抗旱性、抗寒性、抗病蟲害）進(jìn)行等級(jí)劃分并賦值：受害程度≥75%，抗性弱，賦值1；受害程度為50%～75%，抗性較弱，賦值2；受害程度為25%～50%，抗性較強(qiáng)，賦值3；受害程度≤25%，抗性強(qiáng)，賦值4。

1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行整理，采用SPSS26.0進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析及主成分分析，以各個(gè)主成分的特征值作為系數(shù)構(gòu)建用于綜合評(píng)價(jià)的函數(shù)式?；跉W式距離，采用Ward離差平方和法進(jìn)行聚類分析。用CONA-C0 5畫PCA圖。用變異系數(shù)（CV）表示種質(zhì)間性狀值的離散特性，用Shannon-Wiener指數(shù)（H）進(jìn)行遺傳多樣性分析評(píng)價(jià)。

參考唐鳳等的方法，對(duì)其他性狀進(jìn)行分級(jí)，共分為10級(jí)，劃分標(biāo)準(zhǔn)見表2，計(jì)算每個(gè)性狀的平均觀測(cè)值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)X±Ko（K=0，1，2，3，4）計(jì)算每個(gè)性狀每級(jí)的相對(duì)頻率，最后計(jì)算H。計(jì)算公式如下：

2結(jié)果與分析

2.1涼粉草種質(zhì)資源間農(nóng)藝性狀的變異分析及遺傳多樣性分析

由表3可知，涼粉草種質(zhì)間各農(nóng)藝性狀均具有廣泛的變異，變異系數(shù)在7.33%～50.90%之間，差異均達(dá)顯著（P<0.05）或極顯著水平（P<0.01）。其中，除了分枝數(shù)（7.75%）和葉厚（7.33%）的變異系數(shù)小于10.00%（弱變異）外，其他農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)均大于10.00%，分枝長(zhǎng)（50.90%）、單株產(chǎn)量（45.50%）、水分含量（35.22%）甚至超過30%（強(qiáng)變異），說(shuō)明25份涼粉草種質(zhì)材料間農(nóng)藝性狀的差異較明顯。

由表4可知，各農(nóng)藝性狀的多樣性指數(shù)H變化范圍為1.219～2.111。其中，葉長(zhǎng)的H'最高（2.111），在第1、4、7、9級(jí)中出現(xiàn)的頻率均相同（為0.129），在第5、6級(jí)的出現(xiàn)頻數(shù)最高；其次是分枝長(zhǎng)（H為2.055），在第3、4、6級(jí)中出現(xiàn)的頻率也相同（為0.202），在第7、9級(jí)的出現(xiàn)頻數(shù)最高。說(shuō)明這兩個(gè)性狀遺傳基礎(chǔ)較廣，改良潛力最大。葉重率的多樣性指數(shù)H'最低，即多樣性低，變異性較小，是涼粉草種質(zhì)中相對(duì)穩(wěn)定的遺傳性狀?？购敌?、抗寒性、抗病蟲害3個(gè)抗性性狀分別在第2、3、2級(jí)的頻數(shù)最高，說(shuō)明涼粉草種質(zhì)資源均具有較強(qiáng)的抗性。

2.2涼粉草種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀的相關(guān)分析

對(duì)25份涼粉草種質(zhì)材料的12個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（表5）顯示，單株產(chǎn)量與分枝數(shù)、分枝長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、葉重率均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P<0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.607、0.790、0.674、0.766，說(shuō)明莖葉增加與產(chǎn)量增加具有一致性。葉綠素相對(duì)含量與其他性狀均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，除與葉長(zhǎng)和單株產(chǎn)量的相關(guān)性達(dá)顯著水平外，與其他性狀的相關(guān)系數(shù)均較小，總體說(shuō)明葉綠素對(duì)其他性狀的影響不大。另外，分枝數(shù)與葉長(zhǎng)、分枝長(zhǎng)與葉重率呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），說(shuō)明分枝與葉的發(fā)育具有一致性：抗寒性與抗旱性、抗病蟲害均呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），說(shuō)明這3個(gè)抗性的增強(qiáng)具有一致性；分枝長(zhǎng)與抗寒性、抗病蟲害呈顯著正相關(guān)（P<0.05），說(shuō)明植株抗性與涼粉草分枝特性也存在一定關(guān)系。

2.3涼粉草種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀的主成分分析

為了明確涼粉草農(nóng)藝性狀中起主導(dǎo)作用的因素，運(yùn)用主成分分析法對(duì)多性狀進(jìn)行綜合評(píng)判。由表6可知，從12個(gè)農(nóng)藝性狀中共提取到4個(gè)主成分（特征值大于1），貢獻(xiàn)率分別為33.594%、19.319%、11.433%、10.735%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)75.081%．可反映涼粉草種質(zhì)12個(gè)農(nóng)藝性狀的主要信息。其中，第一主成分（PCI）的特征值為4.031，載荷值較大的性狀是單株產(chǎn)量、分枝長(zhǎng)．葉重率，載荷值分別為0.927、0.877、0.854，反映的是分枝越長(zhǎng)、葉重率越大，單株產(chǎn)量就越高，與相關(guān)分析結(jié)果一致；第二主成分（PC2）的特征值為2.318，載荷值的絕對(duì)值較大的性狀是抗寒性、分枝數(shù)和葉長(zhǎng)，載荷值分別為0.836、-0.718和-0.697，說(shuō)明分枝數(shù)和葉長(zhǎng)增大對(duì)植株抗寒性具有不良影響：第三主成分（PC3）的特征值為1.372，反映的是植株水分含量和抗旱性，載荷值分別為0.781和-0.709，說(shuō)明植株水分含量越高越抗旱；第四主成分（PC4）的特征值為1.288，反映的是葉寬和葉厚，載荷值分別為0.659和0.597。4個(gè)主成分所反映的性狀均不同，這些性狀都是決定涼粉草種質(zhì)特征及差異的重要農(nóng)藝指標(biāo)。

對(duì)前兩個(gè)主成分進(jìn)行分析（圖1）發(fā)現(xiàn)，25份涼粉草種質(zhì)材料在圖中的分布沒有明顯規(guī)律，且分布范圍較大，再次說(shuō)明這些種質(zhì)材料間確實(shí)存在廣泛的遺傳多樣性。廣西區(qū)域內(nèi)外的涼粉草種質(zhì)在圖中的分布趨勢(shì)存在一定的差異，但是沒有出現(xiàn)明顯的分離，說(shuō)明不能簡(jiǎn)單依靠地域?qū)ΨN質(zhì)進(jìn)行劃分，要充分考慮選取區(qū)域的范圍大小及環(huán)境的影響，可通過選取多方面性狀對(duì)特定環(huán)境和區(qū)域的涼粉草種質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，以篩選特異種質(zhì)。

2.4 25份涼粉草種質(zhì)材料的綜合評(píng)價(jià)

根據(jù)主成分分析結(jié)果，得到各主成分與12個(gè)農(nóng)藝性狀間的關(guān)系式：

然后用綜合評(píng)價(jià)函數(shù)F=[入1／（入1+入2+入3+入4）]F1+[入2/（入1+入2+入3+入4）]F2+[入3/（入1+入2+入3+入4）]F3+[入4/（入1+入2+入3+入45）]F4（入1、入2、入3、入4分別為4個(gè)主成分對(duì)應(yīng)的特征值）計(jì)算綜合得分，結(jié)果見表7，綜合得分越高，表示性狀綜合表現(xiàn)越優(yōu)良?？梢姡?5份涼粉草種質(zhì)材料中排名前5的為V18、V16、V22、VIO、V11，尤其前3位的V18、V16和V22，綜合得分明顯高于其他種質(zhì)，可作為選育涼粉草新品種的優(yōu)良種質(zhì)。

2.5涼粉草種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀的聚類分析

基于12個(gè)農(nóng)藝性狀對(duì)25份涼粉草種質(zhì)進(jìn)行聚類分析，在歐氏距離為10處可將其劃分為3大類群（圖2），各類群的性狀見表8。其中，第1類包括V4-V23共20份種質(zhì)，占所有種質(zhì)的80入，該類群葉片最厚，單株產(chǎn)量適中（232.900g），抗性中等偏強(qiáng)，其余指標(biāo)均居其他兩個(gè)類群之間。第Ⅱ類包括V1、V2和V3共3份種質(zhì)，該類群葉綠素相對(duì)含量最高，葉寬最大，抗旱性和抗寒性較弱或弱，弱抗病蟲害，單株產(chǎn)量（109.667g）及其他性狀最低。第Ⅲ類包括V24、V25共2份種質(zhì)，該類群葉綠素相對(duì)含量和葉寬最低，葉厚居中，抗旱性較強(qiáng)，抗寒性中等偏強(qiáng)，抗病蟲害較強(qiáng)或強(qiáng)，單株產(chǎn)量（401.500g）及其他性狀均最高。三個(gè)類群總體表現(xiàn)為第Ⅲ類最好，第Ⅱ類最差，第1類居兩者之間。

3討論

涼粉草既是一種中草藥，又是制作涼茶、涼粉的原料，市場(chǎng)需求量逐年增大。就廣西而言，目前種植的涼粉草品種較單一，產(chǎn)量不高，沒有自主選育的品種，國(guó)內(nèi)已通過品種認(rèn)定的適宜當(dāng)?shù)胤N植的品種也很少。因此，亟需選育優(yōu)良的適栽品種。植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性是遺傳改良及其相關(guān)研究的基礎(chǔ)，可通過遺傳多樣性分析評(píng)價(jià)篩選出特異或優(yōu)良的種質(zhì)，以供育種生產(chǎn)及科研利用。雖然已有利用多種分子標(biāo)記（SNP、RAPD、ISSR等）或基于表型性狀對(duì)涼粉草遺傳多樣性進(jìn)行研究的報(bào)道，但材料和性狀較少。本研究選用25份來(lái)自多個(gè)產(chǎn)區(qū)的涼粉草種質(zhì)材料，利用12個(gè)農(nóng)藝性狀，采用遺傳多樣性指數(shù)（H'）、變異系數(shù)（CV）及相關(guān)分析、主成分分析及聚類分析等對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，各農(nóng)藝性狀種質(zhì)間差異均達(dá)顯著水平，變異系數(shù)在7.33%～50.90%之間，除分枝數(shù)和葉厚屬于弱變異（CV<10%）外，其他性狀均屬于中、強(qiáng)變異（CV>10%），以分枝長(zhǎng)的變異系數(shù)最大，說(shuō)明該性狀具有較高的遺傳改良潛力。各農(nóng)藝性狀的H變化范圍為1.219～2.111，其中葉長(zhǎng)的H最高，葉重率的H最低，說(shuō)明供試涼粉草種質(zhì)間遺傳多樣性豐富，遺傳基礎(chǔ)廣泛，這與夏薇采用SLAF-seq方法分析的涼粉草遺傳多樣性結(jié)果一致。另外發(fā)現(xiàn)，大部分涼粉草種質(zhì)的再生能力和適應(yīng)性較強(qiáng)，且具有較強(qiáng)的抗病蟲性，這可能是因?yàn)闆龇鄄菽軗]發(fā)出一種特殊氣味，以避免被采食。

相關(guān)分析結(jié)果表明涼粉草的這幾個(gè)性狀可作為涼粉草種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)。同時(shí)，通過主成分分析（PCA）對(duì)25份涼粉草種質(zhì)材料進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，共提取到4個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率為75.081%。其中，第一主成分主要與單株產(chǎn)量、分枝長(zhǎng)、葉重率有關(guān)，第二主成分主要與抗寒性、分枝數(shù)和葉長(zhǎng)有關(guān)，第三主成分主要與植株水分和抗旱性有關(guān)，第四主成分主要與葉寬和葉厚有關(guān)。單株產(chǎn)量與分枝數(shù)、分枝長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、葉重率呈極顯著正相關(guān)，且載荷值較高，說(shuō)明這些性狀是引起涼粉草種質(zhì)資源表型多樣化的主要因素。經(jīng)綜合評(píng)價(jià)，V18、V16和V22三份種質(zhì)綜合表現(xiàn)較好，可考慮用作遺傳育種的優(yōu)異種質(zhì)。

進(jìn)一步的聚類分析可將25份涼粉草種質(zhì)劃分為3類：第1類共20份種質(zhì)，包括上述3個(gè)綜合表現(xiàn)好的種質(zhì)，該類群各性狀表現(xiàn)多處于中上水平，增產(chǎn)潛力較強(qiáng)。第Ⅱ類共3份種質(zhì)，該類群各性狀表現(xiàn)不佳，產(chǎn)量低，抗性弱，還需優(yōu)化改良，不建議用于優(yōu)良栽培品種選育。第Ⅲ類包含2份種質(zhì)，該類群綜合表現(xiàn)最好，單株產(chǎn)量最高，抗性強(qiáng)，適于用作選配優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)品種的雜交親本。本研究還發(fā)現(xiàn)，種質(zhì)聚類與產(chǎn)區(qū)分布并不一致，說(shuō)明原始生境不是造成種質(zhì)資源遺傳多樣性差異的唯一因素，各種質(zhì)都經(jīng)歷了遺傳分化但又存在頻繁的基因交流，種質(zhì)評(píng)價(jià)時(shí)需綜合考慮多方面因素。

4結(jié)論

本試驗(yàn)選用的25份涼粉草種質(zhì)遺傳多樣性較豐富，改良潛力較大，并篩選出V18、V16和V22三個(gè)綜合評(píng)價(jià)較好的種質(zhì)，可用作優(yōu)良品種選育時(shí)的親本?；谵r(nóng)藝性狀對(duì)涼粉草遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法簡(jiǎn)單可行，然而，對(duì)表型性狀的選擇和觀測(cè)鑒定易受栽培條件及生態(tài)環(huán)境等的影響，評(píng)價(jià)結(jié)果仍有一定局限性。今后可結(jié)合市場(chǎng)需求，對(duì)涼粉草品質(zhì)方面的遺傳多樣性進(jìn)行深入研究，以實(shí)現(xiàn)其藥食同源保健功能育種開發(fā)的新目標(biāo)。