腦白質(zhì)損傷動物模型研究進展

王紫月，喻志源，駱翔

腦小血管?。╟erebral small vessel disease，CSVD）指各種病因影響腦內(nèi)小動脈及其遠端分支、微動脈、毛細血管、微靜脈和小靜脈所導(dǎo)致的一系列臨床、影像、病理綜合征。CSVD影像學(xué)上突出表現(xiàn)為腔隙性梗死（lacunar infarction，LI）、腔隙（lacune）、腦白質(zhì)高信號（white matter hyperintensities，WMH）、血管周圍間隙擴大（enlarged perivascular space，EPVS）及腦微出血（cerebral microbleed，CMB）等[1]。其中WMH 在顱腦MRI 上表現(xiàn)為腦白質(zhì)區(qū)域中大小不等的異常信號，在T2WI 和FLAIR 序列為高信號，T1WI序列為等信號或低信號[2]；WMH 的高負擔(dān)與認知能力下降和癡呆有關(guān)[3]，病理主要表現(xiàn)為少突膠質(zhì)細胞死亡及脫髓鞘改變，其中星形膠質(zhì)細胞在神經(jīng)損傷修復(fù)及髓鞘再生方面均有重要作用[4]。建立有效的動物模型是研究腦白質(zhì)損傷的基礎(chǔ)。本綜述主要關(guān)注已報道的誘導(dǎo)腦白質(zhì)損傷的技術(shù)，包括其實驗動物選擇、建模方法及優(yōu)點和局限性，旨在為腦白質(zhì)損傷相關(guān)基礎(chǔ)研究提供基礎(chǔ)性資料。

1 動物種類選擇

1.1 嚙齒類動物

嚙齒類動物是腦白質(zhì)損傷研究中最常見的模型動物，其優(yōu)點包括體型小、低成本、生存率高、繁殖快、易飼養(yǎng)，有較強抗感染能力且具有穩(wěn)定的基因特征，可用于研究不同行為學(xué)，同時轉(zhuǎn)基因動物在顯示疾病機制方面提供了更多的靈活性。

1.2 綿羊

作為腦白質(zhì)損傷模型中使用最廣泛的大型動物，綿羊腦有豐富的腦白質(zhì)，其中胎羊腦白質(zhì)損傷的研究多集中在新生兒宮內(nèi)缺血缺氧或母嬰感染上，可以更好的模擬早產(chǎn)兒分娩時缺血缺氧的病理機制。但制作胎羊模型成本高、技術(shù)難，需要配備專門的人員和設(shè)施[5]。

1.3 非人靈長類動物（non-human primates，NHP）

NHP 在生理、認知能力、神經(jīng)解剖學(xué)、社會復(fù)雜性、繁殖和發(fā)育等方面與人類具有高度相似性[6]，與人類的遺傳物質(zhì)有75%～98.5%的同源性，被認為是研究人類腦白質(zhì)損傷最理想的模型。但由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化模型制作方法及神經(jīng)功能評估方法，涉及高成本、特殊設(shè)備及團隊，同時要考慮靈長類物種的倫理原則，限制了其在腦白質(zhì)損傷研究中的使用[7]。此外，家豬等大型動物在臨床前研究被廣泛使用。嚙齒動物腦白質(zhì)比例僅為10%，而大型動物占比32%，與人腦皮質(zhì)腦白質(zhì)的占比45%更接近[8]。

2 造模方法

2.1 局灶性缺血缺氧模型

2.1.1 內(nèi)皮素1（dndothelin-1，ET-1）注射 ET-1 是由血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的一種含21個氨基酸的多肽，是最常用的血管收縮物質(zhì)之一。ET-1 有2 個同分異構(gòu)體家族即ET-2 和ET-3，并通過ETA 和ETB 受體發(fā)揮作用[9]。立體定位注射ET-1通過強烈的血管收縮作用，引起腦部血流減少和缺氧，引起腦組織的炎性損傷和神經(jīng)元細胞損傷，導(dǎo)致腦白質(zhì)損傷的發(fā)展。Rodrigues 等[10]將10 pmoL 的ET-1 立體定位注射到大鼠紋狀體后，可誘導(dǎo)灰質(zhì)或白質(zhì)中精確和可重復(fù)的局灶性缺血區(qū)域的炎癥反應(yīng)，術(shù)后3 h即可出現(xiàn)白質(zhì)病變，并在7 d內(nèi)達到最大范圍，組織學(xué)上存在中性粒細胞募集、軸突損傷及髓鞘進行性損傷等；后Hideaki Ono[11]對此進行技術(shù)改進，觀察到術(shù)后大鼠出現(xiàn)明顯的運動障礙。

ET-1誘導(dǎo)腦白質(zhì)損傷模型已經(jīng)廣泛應(yīng)用大鼠造模中，但誘導(dǎo)小鼠腦缺血的研究較少。當(dāng)ET-1 應(yīng)用于小鼠大腦皮質(zhì)組織時，其血管收縮能力顯著降低，Horie 等[12]通過向多品系小鼠紋狀體內(nèi)微注射1.0 μg ET1 均未引起明顯的損傷，隨后聯(lián)合使用ET-1 和L-NAME（一氧化氮和酶抑制劑）增加了小鼠產(chǎn)生梗死的概率，但病變?nèi)匀幌鄬^小且具有品系依賴性。研究報道小鼠大腦表達的ETB-R的數(shù)量是ETA-R的2倍，ET受體亞型表達的差異可能是ET-1介導(dǎo)的大鼠和小鼠血管收縮差異的原因。

血管收縮劑模型最有益的特征是在白質(zhì)內(nèi)預(yù)定位置制造高度可重復(fù)的病變；但病變發(fā)展快速，注射血管收縮化學(xué)物質(zhì)會引起血液供應(yīng)的急性和劇烈短缺，導(dǎo)致各種白質(zhì)成分急性和嚴重死亡，病變發(fā)展的突然性使得其更適用于腔隙性梗死，而不是通常以緩慢進展的方式發(fā)展的彌漫性白質(zhì)損傷。

2.1.2 大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO） 大腦中動脈及其分支是人類缺血中最常受損的腦血管，占腦卒中70%以上；該模型[13]于1985年由Koizumi等人首次描述，并于1989年由Longa等人修改；該模型[13]可用于根據(jù)可變再灌注時間點建立永久性（p-MCAO）或短暫性（t-MCAO）局灶性腦缺血性卒中，表現(xiàn)為急性缺血導(dǎo)致的供血中斷、能量代謝障礙及細胞死亡，完全閉塞超過3 h 會導(dǎo)致供血區(qū)域嚴重缺血性病變，24 h后可見明顯的白質(zhì)疏松，術(shù)后7 d內(nèi)腦白質(zhì)損傷逐漸加重，存在神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激等各種病理生理過程[14]，并伴有明顯運動和認知功能障礙[15]。該模型對臨床上大腦中動脈閉塞卒中患者具有良好的重現(xiàn)作用，操作簡單，且可通過調(diào)整阻塞位置和時間控制病變的發(fā)展，用于缺血再灌注損傷研究；但術(shù)后具有一定的死亡率。

2.2 慢性腦低灌注模型

慢性腦低灌注是由于血容量不足、管腔狹窄或者其他原因引起的腦長期供氧不足狀態(tài)，腦血流動力學(xué)與腦白質(zhì)損傷嚴重程度具有一定相關(guān)性。大鼠雙側(cè)頸總動脈閉塞（2-vessel occlusion，2VO）是近年來最為常用的腦白質(zhì)損傷造模方法，即雙側(cè)頸總動脈阻斷（bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO）模型。將雙側(cè)頸總動脈（common carotid artery，CCA）永久結(jié)扎，造成腦低灌注狀態(tài)，使腦組織尤其是易損區(qū)域，如腦白質(zhì)，產(chǎn)生缺血缺氧性損害。相比于沙鼠和大多數(shù)小鼠，大鼠是合適的動物模型選擇。因其具有完整的Willis 環(huán)，在2VO 術(shù)后可以通過側(cè)支循環(huán)提供不間斷（但減少）的血流。研究表明[16]2VO造模后腦血流量（cerebral blood flow，CBF）發(fā)生動態(tài)變化，CBF在閉塞誘導(dǎo)后立即急劇下降，2～3 d達高峰，最低可至對照組水平的35%～45%；隨后逐漸恢復(fù)進入慢性期，在4周內(nèi)仍顯著低于對照值；在8 周～3 個月之間，CBF 僅有輕微的減少；在2VO造模6個月后，CBF基本恢復(fù)至術(shù)前水平，與對照組幾乎無法區(qū)分。這說明2VO 模型中，即使閉塞是永久性的，CBF 也會在幾個月的時間通過代償和適應(yīng)性機制恢復(fù)正常。在慢性期期間，2VO大鼠的腦低灌注更好地模擬了人類慢性腦低灌注的病理生理過程，但由于急性期CBF 下降劇烈及顯著，術(shù)后死亡率高。有研究對大鼠進行單側(cè)CCA 閉塞和對側(cè)誘導(dǎo)CCA 狹窄，術(shù)后手術(shù)組CBF 逐漸減少，且死亡率較低（2.3%），術(shù)后14 d 白質(zhì)變性在胼胝體和紋狀體中很明顯[16]。

2VO大鼠模型有一些固有的缺點，例如急性缺血損傷眼動脈影響視力從而影響后續(xù)行為學(xué)評估、大鼠分子技術(shù)不成熟影響后續(xù)遺傳學(xué)研究等[17]。因此Shibata等[18]開發(fā)了雙側(cè)頸總動脈狹窄（bilateral common carotid artery stenosis,BCAS）模型，使用彈簧圈包繞在小鼠雙側(cè)CCA 周圍減小管腔直徑，線圈內(nèi)徑越小，腦血流下降速度越快，同時小鼠因頸總動脈急性收縮而死亡的比例越高，術(shù)后CBF緩慢下降，14 d后胼胝體、尾狀核和內(nèi)囊內(nèi)側(cè)部分出現(xiàn)白質(zhì)病變，且灰質(zhì)沒有任何組織學(xué)異常，并且不損傷視神經(jīng)。Lee等[19]進一步將10～12周齡載脂蛋白E缺陷小鼠分為接受假手術(shù)和BCAS 手術(shù)組，術(shù)后手術(shù)組組織病理學(xué)顯示彌漫性白質(zhì)損傷及多發(fā)性微梗死，伴有運動功能受損，此模型納入動脈粥樣硬化血管危險因素，更精確地模仿人類腦白質(zhì)損傷機制及帶來的認知障礙。

基于Hattori 等[20]建立的雙側(cè)頸總動脈不對稱狹窄模型（asymmetrical common carotid artery stenosis，ACAS），Quintana[21]同樣通過在小鼠左側(cè)CCA 上使用微彈簧圈誘發(fā)約50%的血管狹窄，而在右側(cè)CCA 上使用Ameroid 血管收縮器導(dǎo)致CCA 在28 d 內(nèi)逐漸閉塞；在該模型中可以觀察到CBF 逐漸減少，術(shù)后14 d小鼠胼胝體、內(nèi)囊、海馬和尾狀核存在多處梗死損傷，后改進為雙側(cè)使用0.75 mm血管收縮器緩慢降低腦血流量的漸進頸總動脈狹窄模型（gradual common carotid artery stenosis，GCAS）。該模型不僅避免了2VO 和BCAS 模型急性期CBF 急速下降，并且適用于研究腦白質(zhì)梗死伴有運動缺陷和癡呆，但相對而言手術(shù)過程較復(fù)雜。

2.3 高血壓靶器官損傷模型

2.3.1 自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）模型及易卒中亞型大鼠模型 SHR是由成年高血壓大鼠（Wistar-Kyoto Rat，WKY）進行培育而獲得。而自發(fā)性高血壓易卒中大鼠（spontaneously hypertensive stroke prone rats，SHRSP）則是在SHR大鼠基礎(chǔ)上培育的，具有高動脈血壓和高卒中發(fā)病率。2種模型都是研究遺傳性高血壓病及高血壓導(dǎo)致認知功能損傷的常用動物模型，主要通過長期高血壓引起動脈狹窄、硬化、微循環(huán)障礙導(dǎo)致慢性缺血狀態(tài)，隨后持續(xù)的慢性炎癥引起血管壁改變和血腦屏障損傷，進一步加重動脈硬化，形成動脈粥樣硬化斑塊，導(dǎo)致血管腔狹窄或阻塞，進而引起明顯的白質(zhì)損傷。Daniel Kaiser[22]通過對比WKY和SHR小鼠，證實在SHR模型中存在明顯的白質(zhì)損傷、血腦屏障損傷和腦血管炎癥。

研究顯示SHR 和SHRSP 均在12 周齡出現(xiàn)高血壓，后者在20周齡時出現(xiàn)嚴重的白質(zhì)病變；關(guān)于自發(fā)性高血壓大鼠應(yīng)用于腦白質(zhì)病變模型的研究很少，研究表明WKY和SHR及SHRSP組間存在遺傳差異[23]，因此SHR及SHRSP均缺乏嚴格的正常血壓對照。如果沒有飲食控制，SHRSP大鼠將在4～5個月時開始表現(xiàn)出白質(zhì)的變化，可通過低蛋白和高鹽組成的飲食（the Japanese Permissive Diet，JPD）將生存期縮短，加快實驗，但可能存在腎臟和大腦器質(zhì)性損害。Yang 等[24]對SHRSP 小鼠進行單側(cè)頸動脈閉塞手術(shù)并予以JPD建立了腦白質(zhì)損傷動物模型，術(shù)后4周MRI顯示彌漫性白質(zhì)損傷伴隨血腦屏障通透性增加，且表現(xiàn)出緩慢進展空間學(xué)習(xí)和工作記憶受損。以上模型[25]較好地模擬了高血壓和慢性腦低灌注共同引起的早期腦小血管病理學(xué)改變和白質(zhì)損傷，但其潛在的缺點是實驗動物在飲食調(diào)整后4 周內(nèi)自然死亡，無法獲得足夠數(shù)量的白質(zhì)病變。

2.3.2 易卒中型腎血管性高血壓模型（stroke prone renovascular hypertensive rat，RHRSP） RHRSP模型是一種獨立于遺傳缺陷的獲得性高血壓動物模型，于1998年由我國科學(xué)家曾進團隊[26]采用環(huán)形銀夾夾畢雙側(cè)腎動脈后誘導(dǎo)建立，造模后所有RHRSP小鼠均產(chǎn)生高血壓。Fan等[27]對大鼠采用雙腎兩夾法建模后，手術(shù)組20周時收縮壓顯著高于對照組，且MRI顯示彌漫性、融合的白質(zhì)高信號，主要見于胼胝體和外囊區(qū)域；病理檢查顯示明顯白質(zhì)稀疏、髓鞘和神經(jīng)纖維消失、白質(zhì)中形成液泡，水迷宮實驗顯現(xiàn)出明顯下降的空間學(xué)習(xí)和認知能力。

RHRSP是腎血管性高血壓自發(fā)發(fā)展的腦白質(zhì)損傷，相比于SHRSP，RHRSP 具有無遺傳缺陷的優(yōu)勢[28]，但腎動脈夾閉和白質(zhì)病變發(fā)展之間的時間間隔不可預(yù)測，并非所有動物在實驗的最后時間點都會發(fā)生腦白質(zhì)損傷，一些動物在確定的終點之前表現(xiàn)出嚴重的病變導(dǎo)致自發(fā)死亡；由此Lin 等[29]將改良2VO 模型與RHRSP相結(jié)合，提高了模型的穩(wěn)定性，并導(dǎo)致更廣泛的白質(zhì)病變。

2.3.3 大型動物高血壓模型 高血壓研究中最常用的大型動物是豬、非人靈長類動物、綿羊，以及狗等，可通過注射血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）或高鹽飲食誘導(dǎo)高血壓；此外手術(shù)誘導(dǎo)高血壓相對簡單，應(yīng)用廣泛，耐受性良好，手術(shù)相關(guān)死亡風(fēng)險低[30]；可通過將猴子的胸主動脈縮窄至2.0～2.5 mm（75%～80%）成功誘導(dǎo)反射性高血壓，收縮壓＞180/110 mmHg，病理學(xué)上可見明顯的灰質(zhì)和白質(zhì)微梗死，伴有神經(jīng)元完全喪失及髓鞘纖維喪失等；認知能力下降和微梗死的發(fā)病率隨著時間的推移而進展[31]。

高血壓動物模型，整合了潛在的血管危險因素，更加貼近人類高血壓引起的血管進行性狹窄導(dǎo)致的腦白質(zhì)病變，且生存期較長，可以長期觀察高血壓對腦白質(zhì)慢性、持續(xù)性影響；但模型建立和繁殖相對復(fù)雜，耗時長，＜12 周齡很少出現(xiàn)明顯白質(zhì)損傷灶；高血壓的發(fā)展和影響因素較為復(fù)雜，研究結(jié)果的解釋較為困難；其次腦白質(zhì)損傷的病灶較為分散，難以準(zhǔn)確定位和定量分析。

2.4 轉(zhuǎn)基因模型

皮質(zhì)下梗死伴白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈?。╟erebral autosomal dominant arteriopathy with sub-cortical infarct and leukoencephalopathy，CADASIL）是常見的遺傳性腦小動脈病。具有常染色體顯性遺傳特點，致病基因為位于19號染色體上的Notch3 單基因，該病通常于中年起病，表現(xiàn)為偏頭痛、腦白質(zhì)病、多發(fā)性腦梗死和認知障礙且伴有精神癥狀，呈進行性加重。電鏡檢查可以發(fā)現(xiàn)微小動脈平滑肌細胞表面出現(xiàn)嗜鋨酸物質(zhì)（granular osmiophilic material，GOM），病理學(xué)可概括為系統(tǒng)性小動脈病變、多發(fā)腔隙性梗死和廣泛白質(zhì)脫髓鞘[32]。

Notch3 基因突變導(dǎo)致血管平滑肌細胞增殖且分泌基質(zhì)蛋白增多，伴隨血小板凝聚和纖維蛋白沉積進而引起微血管管腔狹窄和閉塞，導(dǎo)致白質(zhì)損傷，可以模擬非高血壓缺血性CSVD的遺傳現(xiàn)象。Joutel等[33]將攜帶Notch3突變的基因組片段通過導(dǎo)入PAC（P1-derived artificial chromosome）載體轉(zhuǎn)基因進入小鼠體內(nèi)開發(fā)了具有R169C 點突變的CADASIL 小鼠模型，后續(xù)觀察中可見GOM沉積（5月齡）、腦血流量減少（約11～12月齡）和進行性廣泛白質(zhì)損傷（約18～20 月齡）。Ayata 等[34]對4 種CADASIL突變小鼠模型常采用的突變基因做了總結(jié)，具有最高水平轉(zhuǎn)基因表達的R169C 突變體中確實發(fā)生了明顯的腦白質(zhì)損傷，而R90C 和C428S 突變體中盡管有突出的血管病理學(xué)和功能障礙，但沒有類似于CADASIL的腦實質(zhì)病變；R142C敲入小鼠則沒有出現(xiàn)任何解剖學(xué)異常。該模型可以特異地著眼于CADASIL，但缺點在于除病理生理學(xué)及解剖學(xué)異常，很少有報告存在顯著的認知和運動障礙；且由于其遺傳特異性，無法涵蓋其他的腦白質(zhì)病變類型。

2.5 藥物損傷模型

3-硝基丙酸（3-Nitropropanoic acid，3-NPA）是一種線粒體毒素，它不可逆的抑制琥珀酸脫氫酶活性（復(fù)合體Ⅱ）和三羧酸循環(huán)，破壞氧化代謝，目前廣泛用于亨廷頓舞蹈癥動物模型中，產(chǎn)生類似的神經(jīng)紊亂和線粒體損傷的改變[35]。但這種化學(xué)性缺血損傷與局部灌注不足模型相似，全身注射后，24 h 內(nèi)紋狀體神經(jīng)元丟失、少突膠質(zhì)細胞受損、脫髓鞘改變并有紋狀體和皮質(zhì)下白質(zhì)軸突損傷；術(shù)后動物后肢出現(xiàn)肌張力障礙，較高劑量時出現(xiàn)癱瘓，在被動回避測試中存在認知缺陷[36]。該模型通過調(diào)整3-NPA的劑量快速誘導(dǎo)白質(zhì)損傷，操作簡單；但其病變區(qū)域主要集中在紋狀體區(qū)域，病理過程與人類白質(zhì)損傷機制不完全相符，在實驗過程中由于3-NPA的神經(jīng)毒性作用，對操作者自身安全存在一定威脅。

3 總結(jié)

迄今為止，對可以復(fù)制人類腦白質(zhì)損傷的動物模型的研究仍然有限，其中小動物模型在分子和細胞機制研究方面具有一定的優(yōu)勢，而大型動物模型在病理生理學(xué)和臨床轉(zhuǎn)化研究方面具有獨特的優(yōu)勢；但大多數(shù)實驗動物研究僅限于嚙齒動物，雖然嚙齒動物毛細血管確實與人類相似，但與人類在皮質(zhì)下區(qū)域的深層穿支動脈幾乎沒有相似之處，而這些動脈經(jīng)常與腦白質(zhì)損傷有關(guān)。

本綜述中，我們介紹了各種可操作的腦白質(zhì)損傷動物模型，不管選用何種動物及造模方法，各種動物模型病理生理的改變不能完全模擬和反映臨床腦白質(zhì)損傷的特征[37]，為了使研究成果盡可能真實地反映其病理生理過程，模型的選擇應(yīng)取決于所提出的研究問題。希望本綜述將幫助正在研究腦白質(zhì)病變的研究者選擇最合適的動物模型，并解決研究問題。