CDC25C表達(dá)下調(diào)的黑色素瘤細(xì)胞線粒體應(yīng)激反應(yīng)和線粒體途徑凋亡情況觀察

繆欣宇，栗彥飛，鄭方園，劉海龍，張瑤堯，晁耐霞，莫發(fā)榮，2

1 廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 530021；2 廣西高校人體發(fā)育與疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

黑色素瘤是一種黑色素細(xì)胞的抗藥性惡性腫瘤，95%以上的黑色素瘤存在于皮膚中，稱(chēng)為皮膚黑色素瘤。目前早期黑色素瘤的主要治療方法是手術(shù)切除，晚期黑色素瘤的主要治療手段是免疫療法，但由于黑色素瘤的高轉(zhuǎn)移潛力，其預(yù)后極差。因此，進(jìn)一步研究黑色素瘤的潛在發(fā)病機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)更為有效的治療手段，改善患者預(yù)后。細(xì)胞分裂周期蛋白25 同源蛋白C（CDC25C）主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞G2/M 期進(jìn)程和介導(dǎo)DNA 損傷修復(fù)［1］。細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制失活在細(xì)胞癌變過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本課題組前期通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CDC25C 在黑色素瘤組織中高表達(dá)，CDC25C 表達(dá)與患者生存率相關(guān)，CDC25C表達(dá)下調(diào)能激活黑色素瘤B16細(xì)胞自噬并抑制細(xì)胞遷移［2］。有文獻(xiàn)報(bào)道，抑制CDC25C表達(dá)能夠阻斷線粒體氧化呼吸，阻止細(xì)胞增殖，提示CDC25C 可能通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體功能引起細(xì)胞凋亡，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起作用［3］。正常情況下，線粒體中的Ca2+保持動(dòng)態(tài)平衡，一旦打破這個(gè)平衡，就會(huì)誘導(dǎo)線粒體內(nèi)ROS 產(chǎn)生增加，繼而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。線粒體酪蛋白水解酶P（ClpP）、離子肽酶1（LONP1）在線粒體的蛋白質(zhì)折疊穩(wěn)態(tài)控制機(jī)制中起重要作用，在線粒體應(yīng)激自穩(wěn)調(diào)控過(guò)程中，通過(guò)上調(diào)ClpP和LONP1 表達(dá)，減少過(guò)度堆積的線粒體蛋白毒性。而內(nèi)源性細(xì)胞凋亡是通過(guò)線粒體途徑的凋亡，其特征在于細(xì)胞色素C 的釋放，繼而激活Caspase-9 和Caspase-3，引發(fā)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。2022 年9 月—2023 年9 月，我們通過(guò)下調(diào)黑色素瘤細(xì)胞CDC25C 表達(dá)，觀察其激活線粒體應(yīng)激反應(yīng)和誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 黑色素瘤B16細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青—鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶（加拿大WISENT）。TB Green Premix Ex TaqTMⅡ細(xì)胞RNA 提取試劑盒（日本TaKaRa），細(xì)胞全蛋白提取試劑盒（北京索萊寶）。Ca2+Rhod-2 AM、ROS MitoSOX 紅色熒光測(cè)定試劑盒（上海翌勝生物科技）。LONP1、GAPDH 抗體（武漢三鷹生物），ClpP、Caspase-9、Caspase-3 抗體（英國(guó)Abcam），羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（杭州弗德生物）。倒置相差顯微鏡（日本Olympus），四通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI），梯度PCR 儀（德國(guó)Eppendof），蛋白質(zhì)電泳儀（美國(guó)Bio-Rad）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取B16 細(xì)胞，加入含胎牛血清和青—鏈霉素雙抗的RPMI1640 完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d 換液1 次，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至90%融合度時(shí)進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，隨機(jī)分為轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組、空白對(duì)照組。首先配制慢病毒稀釋液，向慢病毒質(zhì)粒溶液中加入400 mL RPMI1640 無(wú)血清培養(yǎng)基和500 mg/mL Polybrene。然后轉(zhuǎn)染組加入稀釋后的含CDC25C 低表達(dá)的慢病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染對(duì)照組加入同等濃度稀釋的空載慢病毒質(zhì)粒，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜。24 h 后移去慢病毒液，加入500 μL 含2 μg/mL 嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)?？瞻讓?duì)照組正常培養(yǎng)，不進(jìn)行慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。利用熒光顯微鏡觀察熒光蛋白表達(dá)情況評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組、轉(zhuǎn)染組、CDC25C 蛋白表達(dá)量分別為1.03 ± 0.02、0.99 ± 0.01、0.64 ± 0.01，轉(zhuǎn)染組CDC25C 蛋白表達(dá)水平低于其他兩組（P均＜0.05），表明轉(zhuǎn)染成功。

1.4 細(xì)胞CDC25C mRNA 檢測(cè) 采用RT-PCR 法。取三組細(xì)胞，使用TaKaRa 試劑盒提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在梯度PCR 儀上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。引物序列：CDC25C 上游5'-ATGTCTACAGGACCTATCCC-3'，下游5'-TCTGACTGTGCAGGTTTAAG-3'；β -actin 上游5'-ATGGAGAAGATCTGGCACCA-3'，下游 5'-TAATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3'。取擴(kuò)增產(chǎn)物，置于瓊脂糖凝膠恒壓（100 V）電泳30 min，紫外分析儀觀察結(jié)果。以β-actin 為內(nèi)參，用Image J 軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度值分析，以目的基因與內(nèi)參基因的比值計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞線粒體Ca2+含量檢測(cè) 采用Rhod-2/AM熒光探針染色法。取三組細(xì)胞，以4 × 104/孔接種于24 孔板中的細(xì)胞爬片上，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。PBS 清洗，加入500 μL Ca2+熒光探針Rhod-2/AM工作液，37 ℃孵育15 min。去除Rhod-2/AM 工作液，用PBS（不含Ca2+、Mg2+）洗滌，加入完全培養(yǎng)基，37 ℃孵育30 min。加入4%中性甲醛固定15 min，封片。每組細(xì)胞取三個(gè)視野，在正置熒光顯微鏡下觀察Rhod-2/AM 探針在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)點(diǎn)狀染色的情況，用Image J 軟件對(duì)熒光量進(jìn)行灰度分析，以平均灰度值代表Ca2+含量。

1.6 細(xì)胞線粒體ROS 含量檢測(cè) 采用MitoSOX 熒光探針染色法。取三組細(xì)胞，以5 × 104/孔接種于24 孔板中的細(xì)胞爬片上，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS（含Ca2+、Mg2+）清洗。加入500 μL 線粒體熒光超氧化物探針MitoSOX Red，37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育10 min。用預(yù)熱的PBS（含Ca2+、Mg2+）洗滌，4% 中性甲醛固定15 min，封片。每組細(xì)胞取三個(gè)視野，在正置熒光顯微鏡下觀察MitoSOX 探針在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)點(diǎn)狀染色的情況，用Image J 軟件對(duì)熒光量進(jìn)行灰度分析，以平均灰度值代表線粒體ROS含量。

1.7 細(xì)胞線粒體應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)分子ClpP、LONP1及線粒體途徑凋亡相關(guān)分子Caspase-9、Caspase-3基因檢測(cè) 采用RT-qPCR 法。取三組細(xì)胞，使用TaKaRa 試劑盒提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。加入ClpP、LONP1、Caspase-9、Caspase-3 基因的特異性引物（引物序列見(jiàn)表1）及熒光染料等試劑，在StepOne plus熒光定量PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RT-qPCR反應(yīng)體系：在不含RNA 酶的離心管中加入10.0 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、2.0 μL cDNA 模板、0.4 μL 上游引物、0.4 μL 下游引物，用ddH2O 定溶至總體積20 μL。引物由TaKaRa 公司合成。以GAPDH 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 三組細(xì)胞ClpP、LONP1、Caspase-9、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平比較（± s）

表1 三組細(xì)胞ClpP、LONP1、Caspase-9、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平比較（± s）

注：與空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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表1 RT-qPCR引物序列

1.8 細(xì)胞ClpP、LONP1、Caspase-9、Caspase-3 蛋白檢測(cè) 采用Western blotting 法。取三組細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取蛋白質(zhì)，冰上搖勻后離心，收集上清液，采用BCA 法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。于蛋白上清液中加入4×蛋白上樣緩沖液，95 ℃、5 min 煮沸變性。通過(guò)SDS-PAGE 凝膠電泳分離目的蛋白，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。加入10%脫脂奶粉封閉，PBST 洗滌。分別加入ClpP、LONP1、Caspase-3、Caspase-9 一抗（稀釋濃度均為1∶1 000）和GAPDH 一抗（稀釋濃度1∶5 000），4 ℃孵育過(guò)夜，PBST 洗滌。加入相應(yīng)的二抗（稀釋濃度1∶5 000）孵育2 h，PBST 洗滌。ECL 化學(xué)顯影后拍照成像，用Image J 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS28.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用K-S 正態(tài)性檢驗(yàn)方法，呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組細(xì)胞線粒體Ca2+含量比較 空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組、轉(zhuǎn)染組細(xì)胞線粒體Ca2+含量分別為14.76 ± 0.22、18.60 ± 0.78、21.10 ± 0.29。轉(zhuǎn)染組Ca2+含量高于其他兩組（P＜0.05或＜0.01）。

2.2 三組細(xì)胞線粒體ROS 含量比較 空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組、轉(zhuǎn)染組細(xì)胞線粒體ROS 含量分別為35.61 ± 2.11、46.71 ± 0.90、73.82 ± 2.67。轉(zhuǎn)染組線粒體ROS含量高于其他兩組（P均＜0.01）。

2.3 三組細(xì)胞ClpP、LONP1、Caspase-9、Caspase-3 mRNA 表達(dá)水平比較 與空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組ClpP、LONP1、Caspase-9、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05或＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.4 三組細(xì)胞ClpP、LONP1、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較 與空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組ClpP、LONP1、Caspase-9、Caspase-3 蛋白表達(dá)水平升高（P均＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 三組細(xì)胞ClpP、LONP1、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（± s）

表2 三組細(xì)胞ClpP、LONP1、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（± s）

注：與空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，*P＜0.01。

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3 討論

黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展與多種信號(hào)通路密切相關(guān)，如基因突變、關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、表觀遺傳失調(diào)、腫瘤促進(jìn)炎癥通路等［4］，尋找與黑色素瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵分子，對(duì)黑色素瘤的靶向治療具有重要意義。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多種因素共同參與的過(guò)程，多以細(xì)胞周期紊亂和不規(guī)則為特征，CDC25C 作為重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，顯著影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CDC25C 在肝癌、胃癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤組織中，表達(dá)水平較正常組織升高［1］，提示CDC25C表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。

線粒體是細(xì)胞物質(zhì)代謝和能量代謝的主要場(chǎng)所，參與多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，在決定細(xì)胞存活和死亡方面發(fā)揮重要作用［5］。腫瘤細(xì)胞通過(guò)多種途徑緩解應(yīng)激反應(yīng)，維持線粒體內(nèi)的蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡，從而延長(zhǎng)生存時(shí)間。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間存在復(fù)雜的動(dòng)態(tài)變化的膜接觸［6］，調(diào)節(jié)鈣離子流動(dòng)、脂質(zhì)生物合成、線粒體DNA 合成和分裂等過(guò)程，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬信號(hào)傳導(dǎo)［7］。研究表明，CDC25C表達(dá)下調(diào)可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)［8］，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，Ca2+釋放并進(jìn)入線粒體，致使線粒體內(nèi)鈣超載［9］，增加線粒體內(nèi)ROS 的產(chǎn)生，當(dāng)線粒體內(nèi)ROS生成過(guò)多時(shí)，可以引起線粒體內(nèi)部的未折疊蛋白堆積，發(fā)生線粒體應(yīng)激反應(yīng)。正常情況下，Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)信使參與細(xì)胞內(nèi)多種代謝活動(dòng)，線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài)是維持重要代謝過(guò)程的基礎(chǔ)，線粒體內(nèi)Ca2+超載［10］和增多的線粒體ROS 共同誘導(dǎo)線粒體膜通透性增加，釋放Caspase-3、Caspase-9等凋亡蛋白，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。線粒體內(nèi)鈣超載和活性氧的堆積會(huì)導(dǎo)致線粒體內(nèi)未折疊蛋白的堆積，繼而誘發(fā)線粒體應(yīng)激反應(yīng)。線粒體未折疊蛋白反應(yīng)是線粒體功能的一個(gè)主要穩(wěn)態(tài)機(jī)制［11］，當(dāng)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在線粒體內(nèi)積累時(shí)，線粒體未折疊蛋白反應(yīng)被激活［12］，通過(guò)增加線粒體應(yīng)激侶伴分子HSP60 幫助蛋白質(zhì)正常折疊，通過(guò)增加線粒體蛋白質(zhì)量控制蛋白酶ClpP、LONP1 表達(dá)來(lái)維持線粒體內(nèi)的蛋白穩(wěn)態(tài)［13］。ClpP和LONP1 是線粒體基質(zhì)蛋白酶，二者協(xié)同作用，以減弱蛋白毒性應(yīng)激并保護(hù)線粒體［14］，其抑制和過(guò)度激活均可引起呼吸鏈活性受損并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡［15］。生物信息學(xué)分析顯示，ClpP 的啟動(dòng)子區(qū)含有一個(gè)CHOP 的結(jié)構(gòu)域，該位點(diǎn)對(duì)CHOP 在線粒體未折疊蛋白反應(yīng)中的作用不可或缺，CHOP 是參與調(diào)控線粒體應(yīng)激反應(yīng)的上游關(guān)鍵分子［16］，其過(guò)表達(dá)可通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［17］。本研究通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染方式對(duì)小鼠黑色素瘤B16 細(xì)胞系進(jìn)行CDC25C 基因沉默后，檢測(cè)線粒體應(yīng)激相關(guān)分子的表達(dá)，結(jié)果顯示LONP1、ClpP 表達(dá)顯著升高，說(shuō)明下調(diào)CDC25C 表達(dá)誘導(dǎo)B16 細(xì)胞發(fā)生了線粒體應(yīng)激反應(yīng)以重建線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。

當(dāng)伴侶蛋白和蛋白水解酶的作用無(wú)法克服蛋白毒性應(yīng)激水平時(shí)，線粒體將啟動(dòng)內(nèi)在的細(xì)胞凋亡途徑［18］。細(xì)胞啟動(dòng)凋亡時(shí)，線粒體內(nèi)促凋亡因子細(xì)胞色素C 從線粒體間隙釋放，在細(xì)胞質(zhì)中活化前體Caspase-9，隨后與Caspase-9結(jié)合裂解活化Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［19］。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)CDC25C表達(dá)后，B16細(xì)胞線粒體凋亡通路相關(guān)分子Caspase-3、Caspase-9 mRNA 和蛋白表達(dá)增加，表明CDC25C 表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生線粒體應(yīng)激反應(yīng)繼而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

綜上所述，黑色素瘤細(xì)胞下調(diào)CDC25C 可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生線粒體應(yīng)激反應(yīng)，從而引起線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。但細(xì)胞凋亡是多種因素共同作用的復(fù)雜結(jié)果，各種細(xì)胞器之間復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞因子之間的調(diào)控關(guān)系起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)僅探索了黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞基于線粒體途徑凋亡調(diào)控的分子機(jī)制，對(duì)于黑色素瘤細(xì)胞凋亡是否存在其他凋亡通路調(diào)控尚需進(jìn)一步研究。