微納米塑料與細(xì)胞的相互作用的研究進(jìn)展

劉元元,劉 杰,王海芳

(上海大學(xué)納米化學(xué)與生物學(xué)研究所,上海 200444)

塑料的性能好、成本低、易于生產(chǎn),因此用途廣泛,應(yīng)用在日常生活中的方方面面[1].2020年塑料的產(chǎn)量就已達(dá)到3.7億噸,而新冠大流行對(duì)一次性塑料用品的極度需求使得塑料產(chǎn)量加速增長(zhǎng)[2],相關(guān)組織預(yù)測(cè)塑料產(chǎn)量將繼續(xù)增長(zhǎng),到2060年可能達(dá)到13億噸[3].但是塑料的生物降解性極低,在使用后大多會(huì)變成垃圾,進(jìn)入環(huán)境.環(huán)境中的塑料在自然降解、機(jī)械磨損等條件下,成為微納米塑料(M/NP),即粒徑小于5 mm的塑料碎片和粒子[4].此外,制造和使用塑料制品過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生M/NP,釋放進(jìn)入環(huán)境[5],涂料和化妝品等產(chǎn)品中加入的M/NP也會(huì)進(jìn)入環(huán)境.M/NP來(lái)源多樣,分布范圍廣泛,包括水體、土壤和空氣[6],且其在生態(tài)系統(tǒng)中分散、遷移,并可能被不同物種吸收,從而有很大的產(chǎn)生負(fù)面影響的風(fēng)險(xiǎn).研究發(fā)現(xiàn)M/NP能夠進(jìn)入體內(nèi)[7],并能夠抵抗化學(xué)降解并避免機(jī)體直接排除,從而在生物體內(nèi)長(zhǎng)期富集[8].

M/NP種類繁多,環(huán)境中最常見(jiàn)的是聚苯乙烯(PS)、聚乙烯(PE)、聚乙烯對(duì)苯二甲酸酯(PET)和聚丙烯(PP)[7].M/NP已經(jīng)在飲用水和食物中被廣泛檢測(cè)到[9],更令人擔(dān)憂的是它在人體的多個(gè)組織器官和排泄物中也被檢測(cè)到[10].M/NP容易在生物體中長(zhǎng)期蓄積,對(duì)人類健康具有潛在的危害[8].

目前的研究顯示,M/NP可能通過(guò)多種途徑進(jìn)入人體,如經(jīng)胃腸道吸收、呼吸道吸入和皮膚接觸吸收.當(dāng)M/NP進(jìn)入生物體后,不可避免地與細(xì)胞相互作用,影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,進(jìn)而影響生物的健康[11-12].因此了解M/NP和細(xì)胞的作用及機(jī)制對(duì)評(píng)估M/NP的健康風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要.本文在概述了M/NP的來(lái)源、暴露途徑及對(duì)人體健康影響的基礎(chǔ)上,重點(diǎn)總結(jié)歸納M/NP和細(xì)胞的相互作用,包括攝入、外排及毒性的最新研究進(jìn)展,討論了影響其相互作用的因素,并據(jù)此總結(jié)了今后應(yīng)該關(guān)注的研究方向和內(nèi)容.

1 微納米塑料的來(lái)源、暴露途徑及對(duì)人體健康的影響

1.1 微納米塑料的來(lái)源

M/NP主要分為初級(jí)M/NP和次級(jí)M/NP[13].初級(jí)M/NP主要來(lái)自于塑料制品的生產(chǎn)、加工過(guò)程中的塑料粒子[11],包括使用過(guò)程中磨損、碎裂而產(chǎn)生的更小的塑料粒子.人造纖維、橡膠制品、化妝品和個(gè)人護(hù)理等產(chǎn)品的生產(chǎn)和使用過(guò)程中也會(huì)釋放M/NP[14].此外,塑料制品在焚燒處理中也會(huì)釋放M/NP[15],汽車排放[16]也會(huì)釋放M/NP.次級(jí)M/NP則是指在環(huán)境中塑料制品經(jīng)機(jī)械摩擦、紫外線輻射和生物降解而形成的M/NP[17],如汽車輪胎在行駛過(guò)程中、洗衣機(jī)和烘干機(jī)在清洗衣物過(guò)程中,都會(huì)產(chǎn)生M/NP[6];塑料袋、瓶子和包裝盒(袋)在海洋中漂流時(shí),它們也會(huì)逐漸分解成M/NP;一些微生物可以分解塑料,產(chǎn)生M/NP.總之,M/NP的來(lái)源非常廣泛,這也是它在環(huán)境中普遍存在的原因之一.

1.2 人體的暴露途徑

M/NP可通過(guò)呼吸吸入、消化道攝入和皮膚接觸等多種途徑進(jìn)入人體[18-19].空氣中存在大量各種來(lái)源的M/NP[16],濃度大約在9.8～500粒/m3[20].職業(yè)暴露也是人們通過(guò)呼吸攝入M/NP的一種途徑,如塑料制品生產(chǎn)、清潔劑制造和建筑工作[21-23,25].Wieland等人估計(jì),人類每天可能吸入超過(guò)48 000粒M/NP[21],空氣中微塑料(MP)顆粒數(shù)含量可達(dá)到1 583±1 180粒/m3[24].小于10 μm、未被黏液清除的M/NP可沿著呼吸道進(jìn)入肺深處,與肺細(xì)胞作用或穿過(guò)肺部屏障,進(jìn)入血液并分散到全身[26].研究者已在人肺中發(fā)現(xiàn)微塑料纖維[18].滯留在肺部的M/NP可能導(dǎo)致肺機(jī)能的改變;許多因素會(huì)影響肺泡中M/NP的吸收和排出,從而加劇其對(duì)肺的損傷程度[27].聚苯乙烯(PS)被認(rèn)為是空氣中M/NP的主要組成[28].因此,形貌相對(duì)均一且在體系中分散較好的PS常被作為M/NP模型,目前大部分關(guān)于M/NP的生物效應(yīng)的工作都是用各種PS作為模型完成的.

Schwabl等人[29]在8個(gè)國(guó)家的人糞便中檢測(cè)到9種不同的M/NP,證實(shí)了其在人體腸道中的存在.人們主要通過(guò)進(jìn)食、飲水和吸煙等方式經(jīng)胃腸道攝入M/NP[23,30-32].據(jù)估計(jì),人類每年通過(guò)胃腸道攝入的M/NP為40 000～50 000粒/人[23].此外,牙科和口腔保健產(chǎn)品,例如含塑料粒子的牙膏、漱口水和牙齒美白劑等,也是胃腸道攝入M/NP的重要來(lái)源[32].

M/NP還可以通過(guò)皮膚接觸進(jìn)入人體.護(hù)膚品和化妝品常常會(huì)添加不同化學(xué)成分、形狀和尺寸的M/NP以達(dá)到某種功能,其中最常用的也是PS[33].例如女性每天使用的磨砂膏,含有約1千到1.8萬(wàn)個(gè)M/NP/毫升[34].空氣和水中的M/NP也可能接觸皮膚.這些M/NP可能通過(guò)毛孔吸收、經(jīng)過(guò)角質(zhì)層、汗腺分泌或破損的皮膚進(jìn)入皮膚,并進(jìn)一步進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)[32].

1.3 對(duì)人體健康的影響

通過(guò)呼吸和胃腸道,大約每人每年攝入7.4～12.1萬(wàn)個(gè)M/NP[23].大多數(shù)攝入的M/NP會(huì)從體內(nèi)直接排出,但仍有少量會(huì)滯留體內(nèi)[35].已有分析顯示,人血液中檢出平均含量為1.6 μg/mL的M/NP[10];在人肝臟、脾臟、淋巴結(jié)、肺部和胎盤都發(fā)現(xiàn)有M/NP[9-10,36].這些證明了M/NP能夠穿越屏障,進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)并在全身分布.絕大多數(shù)M/NP的生物可降解性很差,若無(wú)法被及時(shí)排出體外,可能引發(fā)局部炎癥,導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)改變和功能紊亂,長(zhǎng)期存在甚至可能產(chǎn)生遺傳毒性[37],以及改變機(jī)體行為的神經(jīng)毒性,從而影響人體的正常生理功能.例如,M/NP在胃腸道中積聚會(huì)導(dǎo)致腸道炎癥和腸道菌群失調(diào)等問(wèn)題[11];Yan等人也報(bào)告了人糞便中MP的數(shù)量與炎癥性腸病狀態(tài)之間呈正相關(guān)[12].

多項(xiàng)研究報(bào)道在人體的肺組織中檢測(cè)到M/NP,包括PS、PP和聚氯乙烯(PVC)粒子.這些粒子在肺部積聚會(huì)導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)的損傷[27].吸入的PS還可能引起肺部炎癥或穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[38].M/NP會(huì)引起氧化應(yīng)激和炎癥,可能破壞免疫和神經(jīng)系統(tǒng)[39].研究者在生產(chǎn)合成纖維的工人中就觀察到有下氣道彌漫性間質(zhì)或肉芽腫性病變、間質(zhì)纖維化(哮喘樣綜合征,外源性過(guò)敏性肺泡炎,慢性支氣管炎,氣胸和慢性肺炎)[21-22,25].Burkhart等人[25]發(fā)現(xiàn),盡管可吸入顆粒物濃度為2.2 mg/m3,低于美國(guó)國(guó)家職業(yè)安全衛(wèi)生研究所針對(duì)有害粉塵設(shè)定的許可標(biāo)準(zhǔn),但從事尼龍植絨工作的工人患間質(zhì)性肺病與其吸入可吸入顆粒物有關(guān).這些相關(guān)的和初步的研究工作提示我們亟需評(píng)估M/NP的健康風(fēng)險(xiǎn).

2 細(xì)胞對(duì)微納米塑料的攝入及外排

2.1 細(xì)胞對(duì)微納米塑料的攝入

M/NP與細(xì)胞的相互作用是其生物效應(yīng)的基礎(chǔ),因此隨著人們對(duì)M/NP的關(guān)注,有關(guān)其細(xì)胞攝取的研究大幅度增加.M/NP的細(xì)胞攝取依賴于M/NP的物化性質(zhì),以及細(xì)胞種類和暴露條件.雖然在高濃度(50 μg/mL)下觀察到人結(jié)腸上皮細(xì)胞CCD841CON和小腸上皮細(xì)胞HIEC-6可以攝入5 μm的PS[40],但粒徑大于1 000 nm的很難被非吞噬性細(xì)胞攝取,粒徑越小越容易進(jìn)入細(xì)胞.例如,相較于1 000 nm的PS,結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2更易攝入20 nm的PS[41].Wang等人[42]也發(fā)現(xiàn),與40 nm的PS相比,150 nm PS進(jìn)入HeLa細(xì)胞的速度較慢.我們發(fā)現(xiàn)肺細(xì)胞A549和BEAS-2B對(duì)50 nm PS的攝入量均高于100 nm PS;但在高劑量和長(zhǎng)時(shí)間暴露條件下兩種細(xì)胞則攝取更多的100 nm PS而不是50 nm PS[43].可見(jiàn)不同的粒徑和細(xì)胞導(dǎo)致不同的細(xì)胞攝取結(jié)果.

一般來(lái)說(shuō),隨著時(shí)間增加,細(xì)胞攝入M/NP會(huì)逐漸增加,到最大值后會(huì)維持不變,或因細(xì)胞分裂等原因而降低.如0.1 mM的PS與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)后,細(xì)胞對(duì)40 nm PS的攝入在24小時(shí)后都沒(méi)有達(dá)到峰值,而對(duì)150 nm的PS的攝入在4小時(shí)就達(dá)到了峰值[42].但我們?cè)诜渭?xì)胞A549和BEAS-2B上的研究結(jié)果不同,劑量為20 μg/mL時(shí),兩種細(xì)胞對(duì)50 nm 和100 nm的PS的攝入在24小時(shí)內(nèi)持續(xù)增加,均未達(dá)到峰值[43].

粒子的細(xì)胞內(nèi)化開始于與細(xì)胞膜的黏附,隨后,黏附的粒子可能通過(guò)被動(dòng)滲透或主動(dòng)內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞[44].M/NP可通過(guò)內(nèi)吞和被動(dòng)滲入等方式進(jìn)入細(xì)胞.一般來(lái)說(shuō),大于200 nm的粒子主要通過(guò)吞噬作用被攝入,較小的粒子(大于10 nm小于200 nm)通過(guò)胞飲作用被攝入(包括大胞飲作用、網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用),多數(shù)情況下是多種路徑共存[42],而且也受細(xì)胞類型等的影響.Zhang等人報(bào)道70 nm的PS主要是通過(guò)網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入肺細(xì)胞A549和人結(jié)腸腺癌細(xì)胞CaCo-2,而吞噬作用是200 nm和500 nm的PS進(jìn)入細(xì)胞的唯一途徑[40].同樣地,Kuhn等人報(bào)道40 nm的PS通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被A549細(xì)胞攝入[45].但也有研究發(fā)現(xiàn)40 nm的PS只通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的方式進(jìn)入HeLa細(xì)胞[42];20、120和190 nm的PS通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的途徑進(jìn)入犬腎細(xì)胞MDCK-II和肺細(xì)胞A549[46].200 nm常常被認(rèn)為是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的尺寸上限.然而,Guarnieri等人[47]發(fā)現(xiàn)49 nm和100 nm PS可能是通過(guò)大胞飲作用進(jìn)入豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞PAE,并不涉及網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的途徑;Reinholz等人[48]也報(bào)道Caco-2細(xì)胞通過(guò)大胞飲作用攝入100 nm PS.這可能和PS在體系中的分散性有關(guān).還有研究發(fā)現(xiàn)M/NP可以通過(guò)被動(dòng)滲入進(jìn)入細(xì)胞.如Liu等人發(fā)現(xiàn)50 nm和500 nm的PS進(jìn)入大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞RBL-2H3的內(nèi)吞途徑不同,但都有一部分是通過(guò)被動(dòng)滲入進(jìn)入細(xì)胞的[49].我們的研究表明不同細(xì)胞對(duì)同樣的M/NP的攝取路徑可能不同.50 nm的PS進(jìn)入A549細(xì)胞依賴于網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和大胞飲作用,進(jìn)入BEAS-2B細(xì)胞則主要依賴于小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑,但100 nm的PS進(jìn)入這兩種細(xì)胞均依賴于三種路徑即大胞飲作用、網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用[43].尺寸大于1 μm的MP很難被非吞噬細(xì)胞攝取,但可以通過(guò)吞噬作用被巨噬細(xì)胞吞噬.Kuhn等人發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞不能攝入1 μm的PS,而J774A.1細(xì)胞則可通過(guò)吞噬作用攝入[45].

M/NP通過(guò)內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞后,主要進(jìn)入溶酶體,但也有部分能進(jìn)入線粒體等細(xì)胞器;被動(dòng)滲入的一般分布在細(xì)胞質(zhì).M/NP在細(xì)胞內(nèi)的分布也受M/NP性質(zhì)、細(xì)胞類型和暴露條件的影響.Ekkapongpisit等人[50]發(fā)現(xiàn)30 nm羧基化的PS積聚在人卵巢癌細(xì)胞NIH-OVCAR3的循環(huán)內(nèi)體中.Thubagere和Reinhard[51]觀察到羧基化(20 nm和40 nm)和氨基化(40 nm)的PS分布在CaCo-2細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì).而Liu等人報(bào)道,50 nm和500 nm的PS主要分布在RBL-2H3細(xì)胞的溶酶體中,少量分布在細(xì)胞質(zhì)中[49].我們的研究也發(fā)現(xiàn)50 nm和100 nm的PS主要分布在A549和BEAS-2B細(xì)胞的溶酶體中,但在BEAS-2B細(xì)胞中100 nm的PS還分布在線粒體中[43](圖1).

BEAS-2B細(xì)胞暴露于50 nm的PS(綠色,a, b)或100 nm的 PS (紅色, c, d)不同時(shí)間后,PS 在BEAS-2B細(xì)胞中的分布.溶酶體和線粒體標(biāo)記為紅色(a,b)或綠色(c,d).標(biāo)尺代表10 μm

2.2 細(xì)胞對(duì)微納米塑料的外排

M/NP的細(xì)胞毒性與其細(xì)胞內(nèi)含量密切相關(guān),而細(xì)胞內(nèi)M/NP的含量取決于M/NP的細(xì)胞攝入和細(xì)胞外排的綜合結(jié)果.然而,目前對(duì)于M/NP的細(xì)胞外排的研究還非常欠缺,僅有數(shù)據(jù)表明M/NP的外排不僅受其大小及表面電荷的影響,還受細(xì)胞類型的影響.

小粒徑的M/NP容易被排出細(xì)胞.例如,50 nm的PS比100 nm和500 nm的PS更易被細(xì)胞外排[43,49].但整體而言,M/NP均很難從細(xì)胞中排出.在A549細(xì)胞中,即使是50 nm的PS,6小時(shí)的外排量也只有50%,而100 nm的PS在24小時(shí)內(nèi)的外排可以忽略[43].Han等人[52]發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEFs內(nèi)的PS在4天內(nèi)僅少量被排出.雖然大多數(shù)報(bào)道認(rèn)為細(xì)胞質(zhì)中的納米粒子很難排出細(xì)胞,但Fiorentino等[44]報(bào)道了一個(gè)異?？焖俚耐馀?即1分鐘內(nèi)約50%的44 nm的PS通過(guò)被動(dòng)滲透從牛輸卵管上皮細(xì)胞BOEC和人結(jié)腸成纖維細(xì)胞HCF中快速排出.M/NP表面電荷對(duì)外排的影響可以從Yang和Wang[53]的研究結(jié)果看出.雖然100 nm的PS的細(xì)胞外排速度都緩慢,但表面中性、帶正電和負(fù)電的PS在斑馬魚胚胎成纖維細(xì)胞ZF4中的保留半衰期還是有不同,分別為10.1,12.0和15.1小時(shí),即表面負(fù)電的PS最難從細(xì)胞中被排出.

能量依賴和非能量依賴的途徑都能參與M/NP的細(xì)胞外排[44,54],能量依賴的途徑主要是溶酶體路徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基路徑.而我們發(fā)現(xiàn)50 nm的PS在A549和BEAS-2B細(xì)胞中的外排均具有能量依賴性,溶酶體路徑是主要路徑[43].非能量依賴的被動(dòng)滲透也參與外排[44,49].

3 微納米塑料的細(xì)胞毒性

3.1 單獨(dú)暴露

已有的研究表明,M/NP對(duì)細(xì)胞造成各種影響,包括細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能的損傷,氧化應(yīng)激和炎癥因子的表達(dá)改變,造成代謝障礙以及遺傳毒性,引起細(xì)胞凋亡和壞死等[13,55].M/NP細(xì)胞毒性的研究采用的細(xì)胞模型集中在表皮、胃腸道和肺細(xì)胞.

M/NP與細(xì)胞之間的物理接觸可能導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞,表現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞膜通透性的改變[13,40].比較直接的表現(xiàn)是,短時(shí)間作用于細(xì)胞后,能夠引起的細(xì)胞凋亡,且細(xì)胞凋亡的情況依賴于M/NP的暴露濃度和細(xì)胞類型(圖2a-b).而M/NP對(duì)細(xì)胞膜功能的損傷,可能與其粒徑和形狀有關(guān),如非球形的PS比球形的PS更容易黏附在細(xì)胞膜表面[56],但球形的PS更易被細(xì)胞攝入,產(chǎn)生更強(qiáng)的毒性[44].

(a-b) PS MP作用CCD841CoN細(xì)胞(a)和HIEC-6細(xì)胞(b) 0.5 h后引起的細(xì)胞凋亡[40];(c) PS、PS- COOH和PS- NH2(50/100 μg/mL)作用PC12細(xì)胞24 h后,細(xì)胞核中TFEB的平均含量[59];(d-f) PS對(duì)A549細(xì)胞的基因毒性:(d) 微核形態(tài);(e) 80 nm和2 μm的PS引起的細(xì)胞微核的比較;(f)表面基團(tuán)對(duì)80 nm PS引起的細(xì)胞微核形成的影響[37]

M/NP導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的過(guò)度產(chǎn)生,這是M/NP最主要的細(xì)胞毒性機(jī)制[13,40,57].ROS的產(chǎn)生會(huì)影響多種信號(hào)通路和免疫應(yīng)答,例如活化B細(xì)胞的核因子κB輕鏈增強(qiáng)子(NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)[58],和促炎因子IL-8的上調(diào)等.激活和調(diào)節(jié)這些信號(hào)通路和免疫應(yīng)答會(huì)損傷細(xì)胞器、DNA、細(xì)胞膜、離子通道和細(xì)胞表面受體,導(dǎo)致不良反應(yīng)和毒性.例如Song等人[59]發(fā)現(xiàn)PS引起細(xì)胞溶酶體自噬轉(zhuǎn)錄因子EB(TFEB)表達(dá)升高(圖2c),從而導(dǎo)致溶酶體功能障礙,引起細(xì)胞死亡;Hou等人[60]發(fā)現(xiàn)PS長(zhǎng)期作用于細(xì)胞,會(huì)導(dǎo)致核因子(NF-κB p65)、IL-8和ROS水平的上升,其中NF-κB p65 對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥和免疫反應(yīng)至關(guān)重要,細(xì)胞炎癥和免疫反應(yīng)控制細(xì)胞內(nèi)IL-8的分泌,從而進(jìn)一步介導(dǎo)細(xì)胞凋亡.細(xì)胞內(nèi)M/NP可以直接損傷線粒體,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS增加;微米級(jí)PS對(duì)細(xì)胞活力和凋亡無(wú)顯著影響.此外,微米級(jí)PS引起的膜損傷顯著高于納米級(jí)PS,這可能是由于大量的PS附著在間隙上,對(duì)細(xì)胞膜功能有顯著的負(fù)面影響[40].Xu等人[55]發(fā)現(xiàn),隨著PS在Caco-2中積累,細(xì)胞活力逐漸降低,細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期;細(xì)胞中Bax/Bcl-2蛋白比值略有增加,表明細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗能力降低,伴隨自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ和SQSTM1蛋白水平升高,由此誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.

此外,M/NP還可以引起遺傳毒性.Shi等人[37]通過(guò)微核形成實(shí)驗(yàn)分析5種不同的M/NP的基因毒性.結(jié)果表明,不同粒徑和表面修飾的PS均可以導(dǎo)致細(xì)胞微核的形成(圖2d).80 nm的PS比2 μm的PS引起的基因毒性更強(qiáng)(圖2e),同時(shí)表面修飾也影響PS對(duì)A549細(xì)胞的基因毒性,毒性從強(qiáng)到弱依次是氨基修飾的,羧基修飾的和未被修飾的(圖2f).

總的來(lái)說(shuō),M/NP對(duì)細(xì)胞的毒性作用,包括但又不限于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的損傷,氧化應(yīng)激以及其引起的一系列毒性相關(guān)的信號(hào)通路和免疫反應(yīng)的激活,和造成的遺傳毒性.此外,M/NP的細(xì)胞毒性不僅與其本身的物化性質(zhì)相關(guān),還受到細(xì)胞類型、暴露條件等因素的影響.然而,相關(guān)研究多采用球形PS來(lái)代表環(huán)境種類眾多的微納塑料[28],代表性有限,今后應(yīng)該加強(qiáng)其他化學(xué)成分的M/NP的研究.

3.2 協(xié)同暴露毒性

除了M/NP本身對(duì)細(xì)胞的毒性影響,M/NP容易吸附環(huán)境中的其他物質(zhì),包括各種有害物質(zhì),與他們聯(lián)合作用于細(xì)胞,有可能引起更嚴(yán)重的毒性效應(yīng)[61-63].例如,多環(huán)芳烴(PAHs)可被M/NP吸附,一起被生物攝入,引起各種毒性效應(yīng)[63];在M/NP存在的情況下,Cr、Cu、Mn和Zn等重金屬元素在生物體內(nèi)的積累顯著增加,引發(fā)慢性毒性[64].Zhou等人[65]將這種現(xiàn)象描述為“特洛伊木馬”效應(yīng),即M/NP作為載體攜帶其他有害物質(zhì)穿透生物體膜.M/NP為這些有害物質(zhì)滲透到組織和體液提供了可能[66].相比于微米尺度的粒子,納米尺度的粒子由于比表面積大吸附量高,而且吸附在粒子表面的有害物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)更容易釋放,引起線粒體去極化等,導(dǎo)致M/NP的細(xì)胞毒性增強(qiáng)[67].

M/NP除了和吸附的有害物質(zhì)聯(lián)合作用外,還可以與本身無(wú)毒的離子、其他的粒子、甚至不同粒徑的M/NP聯(lián)合作用于細(xì)胞,產(chǎn)生更強(qiáng)的毒性效應(yīng).相比于單獨(dú)作用,PS與Ag 納米粒子聯(lián)合作用于THP-1細(xì)胞使得細(xì)胞的IL-6、IL-8和TNFa表達(dá)上調(diào),加劇了細(xì)胞凋亡和死亡[64].多種粒徑的PS共暴露會(huì)改變PS的細(xì)胞攝取和毒性.de-Boer等人[68]發(fā)現(xiàn),100 nm PS促進(jìn)細(xì)胞對(duì)40 nm PS的攝入,而40 nm PS抑制細(xì)胞對(duì)100 nm PS的攝入(圖3a-b);1 μm和5 μm PS混合比單獨(dú)的PS對(duì)A549細(xì)胞造成更嚴(yán)重?fù)p傷[69].另外,Steckiewicz等人[70]發(fā)現(xiàn)PS單獨(dú)作用于HT-29細(xì)胞時(shí),不會(huì)誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生,也不影響細(xì)胞周期;然而PS與本身沒(méi)有細(xì)胞毒性的F-共同作用于細(xì)胞后,除了引起細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變(圖3c-f),細(xì)胞被阻斷在G0/G1期,增殖受到抑制,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡.然而這方面的工作還比較初步,需要更多的研究.

(a-b) HeLa細(xì)胞對(duì)混合的40 nm和100 nm的PS的攝取,發(fā)現(xiàn)40 nm的PS抑制細(xì)胞攝入100 nm的PS(a),而100 nm的PS促進(jìn)細(xì)胞攝入40 nm的PS(b)[68];(c-d) HT-29細(xì)胞暴露于PS(500 μg/mL)后的TEM圖;(e-f) HT-29細(xì)胞同時(shí)暴露于PS(500 μg/mL)和F—(1 mM) 后的TEM圖(V:囊泡;N:細(xì)胞核;Mt:線粒體)[70]

4 微納米塑料影響其細(xì)胞攝入及毒性的因素

除了M/NP的物化性質(zhì)(粒徑,形狀,表面性質(zhì)),老化,M/NP的暴露時(shí)間和暴露濃度也會(huì)影響細(xì)胞攝入的量,繼而對(duì)M/NP的細(xì)胞毒性產(chǎn)生影響[69,71-73].

4.1 粒徑

M/NP對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)存在顯著的粒徑依賴[73-74].小粒徑的M/NP比大粒徑的更易進(jìn)入細(xì)胞且細(xì)胞毒性更大.Prietl等人[75]發(fā)現(xiàn)20 nm的PS比0.5 μm和1 μm的PS對(duì)人單核細(xì)胞有更強(qiáng)的毒性作用,其中一個(gè)重要原因可能是與細(xì)胞攝入量有關(guān).小于200 nm的PS不僅能以內(nèi)吞方式被細(xì)胞攝入,而且可以依賴濃度梯度下的被動(dòng)滲入或是與通道蛋白或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)生黏附作用進(jìn)入細(xì)胞[76],而粒徑大于1 μm的PS卻很難在短時(shí)內(nèi)被細(xì)胞攝取[73,75],因此納米級(jí)的粒子更容易誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的產(chǎn)生,如ROS(圖4a-d).M/NP在細(xì)胞內(nèi)的大量積累導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著降低.Stock等人[77]就發(fā)現(xiàn)Caco-2細(xì)胞和THP-1巨噬細(xì)胞對(duì)粒徑小于1 μm的PS的攝入量與兩種細(xì)胞的活力呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì),即攝入PS越多,細(xì)胞活力越小.Zhang等人[73]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞暴露于不同粒徑(20 nm,50 nm,100 nm,500 nm,5 μm,10 μm)的PS時(shí),PS的粒徑越大,細(xì)胞攝入量越少,引起的細(xì)胞毒性也越弱.細(xì)胞攝入最高的20 nm的PS導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷,包括活性氧水平增加,炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β表達(dá)水平升高,細(xì)胞骨架破壞.

(a) 不同粒徑和表面基團(tuán)的PS誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生ROS.(b-d) 100 μg/mL不同表面基團(tuán)的 PS與A549細(xì)胞作用6 h(b),9 h(c)和24 h(d)后細(xì)胞內(nèi)的ROS水平[37].(e) 不同形狀的PS與不同細(xì)胞共孵育24 h后,細(xì)胞周期和凋亡水平分析 [56]

與細(xì)胞攝入PS納米粒子從而導(dǎo)致毒性不同的是,PS 微米粒子對(duì)細(xì)胞造成的損傷可能與其破壞細(xì)胞膜的完整性有關(guān).Zhang等人[40]報(bào)道粒徑為100 nm、500 nm、1 μm和5 μm的PS與人結(jié)腸上皮細(xì)胞CCD841CON和小腸上皮細(xì)胞HIEC-6分別單獨(dú)作用24 h后,均表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性;但PS 微米粒子對(duì)細(xì)胞膜的損傷高于PS納米粒子,這可能是由于大量的PS微米粒子黏在細(xì)胞膜的膜間質(zhì)中,對(duì)細(xì)胞膜的功能產(chǎn)生了影響.此外,高劑量下,細(xì)胞也可以少量攝取5 μm的PS,導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激的平衡被破壞,引起線粒體去極化.Wu等人[78]也發(fā)現(xiàn),高濃度下5 μm的PS比100 nm的PS對(duì)Caco-2細(xì)胞造成更嚴(yán)重的線粒體損傷.但Liu等人[79]報(bào)道了相反的結(jié)果,即粒徑小于100 nm的PS比5 μm的PS對(duì)Caco-2細(xì)胞膜的損傷程度更高.矛盾的結(jié)果可能是由于PS的濃度和分散性不同導(dǎo)致的,也可能是PS 納米粒子通過(guò)滲透的方式進(jìn)入細(xì)胞時(shí),引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化[80],即質(zhì)膜重排[81],最終導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的損傷.

4.2 形狀

對(duì)M/NP的細(xì)胞毒性研究大多是將細(xì)胞暴露于具有特定尺寸、形狀和表面修飾的M/NP(多以球形PS為模型),但這并不能反映現(xiàn)實(shí)環(huán)境中的M/NP的真實(shí)情況[38].環(huán)境中M/NP多為非球形,與細(xì)胞的相互作用可能和球形M/NP表現(xiàn)不同.Zhang等人[56]在研究PS納米盤和納米球(20 nm)被HeLa、Hek 293、Jurkat和BJ細(xì)胞的攝入和對(duì)細(xì)胞的毒性時(shí)發(fā)現(xiàn),盤狀PS只進(jìn)入細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層卻不進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),不產(chǎn)生毒性作用,而球形PS通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期,更容易誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖4e).近期的研究獲得了相似的結(jié)果,即球形PS比非球形PS更易被Caco-2細(xì)胞攝入,且能引起細(xì)胞更強(qiáng)的氧化應(yīng)激反應(yīng),主要原因是球形PS富集在細(xì)胞的線粒體中[82].今后應(yīng)該更加關(guān)注不規(guī)則M/NP的細(xì)胞攝取和細(xì)胞毒性.

4.3 表面性質(zhì)

4.3.1 表面修飾

細(xì)胞對(duì)納米粒子的攝入是由納米粒子表面的性質(zhì)和細(xì)胞表面受體之間的相互作用決定的[83].通常來(lái)說(shuō),由于細(xì)胞膜表面帶負(fù)電,因此表面帶正電的納米粒子相比于表面帶負(fù)電的納米粒子更容易被細(xì)胞攝取[84],同時(shí)表面帶正電的納米粒子細(xì)胞毒性更大[85],這對(duì)于M/NP也同樣適用.He等人[86]發(fā)現(xiàn)50 nm的表面帶負(fù)電和正電的PS比表面中性的PS對(duì)肝細(xì)胞HepG2細(xì)胞顯示出更嚴(yán)重的毒性且表面帶正電的PS會(huì)引起更嚴(yán)重的氧化應(yīng)激,主要是因?yàn)榧?xì)胞對(duì)表面帶電荷的PS的攝入量高于表面為中性的PS.Xu等人[55]也發(fā)現(xiàn)Caco-2細(xì)胞對(duì)100 nm PS的攝入量和毒性從高到低依次是氨基修飾的PS、羧基修飾的PS和無(wú)表面修飾的PS,說(shuō)明PS的細(xì)胞攝入量與毒性正相關(guān).Shi等人[37]也得出了一致的結(jié)論,即在6 h內(nèi)氨基修飾的PS、羧基修飾的PS和無(wú)表面修飾的PS均能誘導(dǎo)A549細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生(圖4b-d),但是隨著PS與細(xì)胞共孵育時(shí)間的延長(zhǎng),氨基修飾的PS對(duì)細(xì)胞具有更大的損傷.除了氨基修飾的PS更易與帶負(fù)電的細(xì)胞膜相互作用的原因外,還可能與氨基修飾的PS引起的溶酶體自噬有關(guān).Song等人[59]發(fā)現(xiàn),不同表面電性的PS被細(xì)胞攝入后,均能激活轉(zhuǎn)錄因子EB(TFEB),激活細(xì)胞自噬.表面帶正電的PS比其他PS能夠在更低的濃度范圍(10 ～ 25 μg/mL)和更短的時(shí)間(<24 h)激活TFEB,破壞溶酶體的完整性,從而阻斷細(xì)胞自噬通量,降低細(xì)胞通過(guò)自噬溶酶體清除PS的能力,從而顯示出更高的細(xì)胞毒性.綜上,與表面中性的PS相比,表面帶電的PS更容易被細(xì)胞攝入,且表面帶正電的PS能導(dǎo)致更嚴(yán)重的細(xì)胞損傷.

4.3.2 老化

排放到環(huán)境中的塑料在光、熱、氧、水、微生物、機(jī)械力等的作用下,失去原有性能,稱之為老化[17].如M/NP中不飽和雙鍵、支鏈、羰基、末端上的羥基等發(fā)生斷裂或氧化,使得其原本性質(zhì)發(fā)生改變.老化通常表現(xiàn)在M/NP表面電荷的轉(zhuǎn)變,這增加了其親水性和生物可利用度,使其更容易吸附其它物質(zhì),產(chǎn)生聯(lián)合作用;或是其內(nèi)部的分子單體釋出,進(jìn)入環(huán)境,加劇了其對(duì)環(huán)境的影響等.

M/NP的老化普遍增強(qiáng)了其對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng).M/NP與經(jīng)紫外線輻射后獲得的老化后的M/NP相比,粒子形態(tài)上差異明顯[69,87-89],如圖5a所示PS在老化前后的形貌差異.El Hayek等人[69]發(fā)現(xiàn),即使在低濃度(1-30 μg/mL)下,粒徑為1 μm和5 μm的老化的PS(APS)對(duì)A549細(xì)胞的毒性比PS的更明顯,表現(xiàn)為細(xì)胞膜完整性損傷嚴(yán)重,細(xì)胞核減小,細(xì)胞骨架和細(xì)胞代謝發(fā)生改變,細(xì)胞周期阻滯在S/G2期,細(xì)胞增殖抑制.此外,PS形態(tài)的改變通常也伴隨著表面官能團(tuán)和表面元素組成的改變,這導(dǎo)致了有更多的反應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合環(huán)境中的其它物質(zhì)或與其反應(yīng)產(chǎn)生新的物質(zhì),從而增強(qiáng)了毒性作用.例如,在支氣管肺泡灌洗液(BALF)中,老化的PS(APS)比PS更易形成生物冠,且兩者表面吸附蛋白的種類和量也存在較大差異[89].APS在生物冠的“偽裝”作用下,則更容易被細(xì)胞攝入(圖5b-d),增加其在細(xì)胞內(nèi)的含量,使得潛在的風(fēng)險(xiǎn)提高.

4.4 暴露條件

4.4.1 濃度

M/NP濃度是影響細(xì)胞攝入和毒性的重要因素[7,69].低濃度暴露條件下,M/NP對(duì)細(xì)胞可能具有毒性興奮作用,刺激其增殖;短時(shí)間高濃度和長(zhǎng)期低濃度的暴露都會(huì)容易引起細(xì)胞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和免疫反應(yīng)等.El Hayek等人[69]就發(fā)現(xiàn)1 μm和5 μm的PS在濃度低于10 μg/mL時(shí)能夠刺激A549細(xì)胞增殖,但是當(dāng)濃度增加到30 μg/mL后,PS則會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性.暴露于高濃度PS(50-100 μg/mL)中,Caco-2細(xì)胞中出現(xiàn)致密囊泡,溶酶體的電子密度升高,線粒體出現(xiàn)腫脹以及脊的消失,ROS水平顯著增加[90].此外,M/NP對(duì)細(xì)胞的毒性作用還表現(xiàn)為時(shí)間依賴性.M/NP短時(shí)間(小于48 h)高劑量作用于正常人腸道細(xì)胞CCD-18Co后,細(xì)胞內(nèi)ROS水平會(huì)顯著性升高,同時(shí)伴有細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞膜通透性的改變,線粒體膜電位的改變,和細(xì)胞活力的下降等;而在長(zhǎng)時(shí)間(4周)低劑量下M/NP導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平逐漸升高,細(xì)胞代謝過(guò)程如TCA循環(huán)的重組[13].但Hou等人[60]用10 μg/mL的50 nm PS作用于腸道細(xì)胞14天,觀察到的細(xì)胞凋亡比例、炎癥因子表達(dá)水平和100 μg/mL的50 nm PS與細(xì)胞作用1～2天相當(dāng).此外,隨著PS濃度的升高,細(xì)胞核周圍PS的積累量明顯增多,說(shuō)明細(xì)胞對(duì)PS的攝入是劑量和時(shí)間依賴性的,且細(xì)胞內(nèi)PS含量越高越容易導(dǎo)致細(xì)胞毒性.

一些研究者提出,M/NP“過(guò)量”是導(dǎo)致明顯的毒性的主要原因,較少的接觸只會(huì)產(chǎn)生輕微的影響[77].Zhang等人[40]發(fā)現(xiàn),濃度為1000 μg/mL時(shí),三種粒徑(20 nm、100 nm和10 μm)的PS均可導(dǎo)致細(xì)胞膜出現(xiàn)不同程度的受損,細(xì)胞內(nèi)ROS含量上升,但該濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)胞能夠接觸的M/NP濃度(如在血液中的含量是1.6 μg/mL)[10].相反,較低濃度(0～80 μg/mL)的500 nm的PS作用于細(xì)胞時(shí),并未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高[91].與之相似,Cortes等人[90]研究50 nm的PS對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn),暴露濃度在200 μg/mL時(shí)Caco-2細(xì)胞活力明顯降低,而暴露濃度低于150 μg/mL時(shí)PS對(duì)細(xì)胞不產(chǎn)生毒性作用.在另一項(xiàng)研究中,當(dāng)Caco-2細(xì)胞暴露于0～200 μg/mL PS中,也未檢測(cè)到明顯的細(xì)胞活力降低[92].可見(jiàn),M/NP對(duì)細(xì)胞毒性的影響是具有濃度依賴性的[93],但不同細(xì)胞的耐受能力不同,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)蓄積的M/NP濃度超過(guò)其耐受的閾值時(shí),就會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥等一系列反應(yīng).因此,在體外進(jìn)行M/NP的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí),應(yīng)當(dāng)考慮實(shí)際暴露劑量以及所采用的細(xì)胞模型.此外,由于M/NP在生物體內(nèi)無(wú)法被有效降解,這導(dǎo)致其長(zhǎng)期滯留在生物體內(nèi),因此M/NP引起的細(xì)胞的慢性毒性應(yīng)當(dāng)予以關(guān)注.

4.4.2 蛋白冠

當(dāng)M/NP進(jìn)入生物體后,能夠迅速被體內(nèi)的多種蛋白(如白蛋白、免疫球蛋白和載脂蛋白)所包覆,形成“蛋白冠”層.這賦予M/NP新的生物學(xué)身份,并介導(dǎo)其與細(xì)胞的相互作用[94-95].這意味著通過(guò)各種途徑進(jìn)入體內(nèi)的M/NP在與細(xì)胞相互作用之前,已經(jīng)在其表面形成蛋白冠,導(dǎo)致M/NP的表面性質(zhì)發(fā)生改變.而被蛋白質(zhì)包裹的M/NP能夠更有效地在細(xì)胞間進(jìn)行交換(轉(zhuǎn)胞吐過(guò)程)[96].并且M/NP的蛋白冠在體內(nèi)會(huì)隨著微環(huán)境的不同而發(fā)生蛋白冠成分和量的改變[97],使得M/NP與不同類型的組織細(xì)胞的作用不同.Ji等人[98]發(fā)現(xiàn)PS表面吸附了蛋白后,更容易被A549細(xì)胞攝取,但在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)緩慢,從而在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間滯留.但是,Tan等人[99]發(fā)現(xiàn)PS表面被胎牛血清包裹后,能減少巨噬細(xì)胞對(duì)PS的攝入,進(jìn)而降低細(xì)胞的自噬和溶酶體損傷,減輕了細(xì)胞毒性.細(xì)胞模型的差異可能是結(jié)果不一致的一個(gè)重要原因.可見(jiàn),M/NP表面蛋白冠的形成會(huì)顯著影響其與細(xì)胞相互作用以及其生物效應(yīng),但相關(guān)作用受多種因素影響,需要進(jìn)一步深入研究.

5 總結(jié)和展望

目前環(huán)境中存在大量的M/NP,這些M/NP可以通過(guò)皮膚接觸、呼吸吸入以及消化道攝入等方式進(jìn)入人體,對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在威脅.我們分別從M/NP人體暴露途徑和潛在危害,M/NP的細(xì)胞攝入和外排,M/NP引起的細(xì)胞毒性,以及相關(guān)影響因素等方面總結(jié)了目前的研究進(jìn)展.總的來(lái)說(shuō),M/NP的健康效應(yīng)的研究才剛剛開始,有很多方面亟需進(jìn)一步深入研究.

目前M/NP的細(xì)胞毒性研究中,大多數(shù)采用球形PS作為M/NP的模型,無(wú)論從M/NP形態(tài)上(粒徑、形狀、表面粗糙度等)還是暴露條件上(時(shí)間、劑量等),均與我們接觸到的真實(shí)環(huán)境中的M/NP存在巨大差異.環(huán)境中的M/NP不僅化學(xué)成分多種多樣,制造商還常常在塑料中添加增塑劑、穩(wěn)定劑和顏料等,其中許多物質(zhì)是有害的,如干擾內(nèi)分泌(激素)系統(tǒng).而且環(huán)境中的M/NP多數(shù)是纖維或碎片,而不是球形的,這些特征都能影響M/NP的生物效應(yīng).此外,M/NP常常是低劑量長(zhǎng)期暴露的,因此開展長(zhǎng)期低劑量的M/NP的研究更具有現(xiàn)實(shí)意義.同時(shí),M/NP難以降解,通過(guò)各種屏障進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)長(zhǎng)期滯留,由此帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)也應(yīng)予關(guān)注.如何在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果的基礎(chǔ)上,建立一套相對(duì)完善的M/NP的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),包括M/NP的標(biāo)準(zhǔn)樣、實(shí)驗(yàn)條件和毒性檢測(cè)指標(biāo),對(duì)于獲得接近真實(shí)條件下的、可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果將尤為重要.

由于環(huán)境中M/NP處在復(fù)雜體系中,它的表面會(huì)吸附環(huán)境中的各種物質(zhì).只關(guān)注M/NP本身的生物效應(yīng),不足以反映真實(shí)體系的情況,需要考慮M/NP的生物冠以及共存的離子/分子對(duì)M/NP的生物效應(yīng)的影響.

技術(shù)和方法的革新是科學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ),目前環(huán)境中的M/NP形貌各異、種類繁多,缺乏特異性的分析檢測(cè)手段.我們需要不斷地尋求和探索新的技術(shù)和方法,以應(yīng)對(duì)這一領(lǐng)域的挑戰(zhàn),如將快速發(fā)展的人工智能和機(jī)器學(xué)習(xí)等先進(jìn)技術(shù)用于M/NP基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的收集和分析,推動(dòng)M/NP的安全性的研究,保護(hù)人類健康.