云南烤煙KRK26 特征香氣分析*

張美芬，桑應(yīng)華，趙紅梅，安皓南，呂 芬，趙正雄，李振杰，徐俊駒**

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，云南省煙草化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650231)

煙草香韻彰顯煙葉特色，體現(xiàn)烤煙香型和香氣風(fēng)格特色，對卷煙中香氣成分的充分了解有助于卷煙加香加料和卷煙配方的完善[1-4]。KRK26是津巴布韋主栽烤煙品種，也是目前通過全國品種委員會(huì)審定的六大外引烤煙品種之一。關(guān)于KRK26 的品種適應(yīng)性[5-6]、栽培管理措施及烘烤技術(shù)[7-8]已有許多報(bào)道，但有關(guān)KRK26 特征香氣成分的研究較少，無法與工業(yè)可用性建立有效關(guān)聯(lián)，且研究方法較為單一。

煙葉成分種類復(fù)雜且含量較低，為了簡化且快速聚焦關(guān)鍵香氣成分，需要多級、多項(xiàng)分離設(shè)備對煙葉香氣成分進(jìn)行有效分割。凝膠過濾色譜法是一種利用分子質(zhì)量大小分離成分的技術(shù)，簡便且有效，在食品領(lǐng)域樣品前處理過程中有凈化作用[9]。分子感官科學(xué)是在復(fù)雜成分體系中尋找關(guān)鍵成分和特征香氣風(fēng)格的有效手段，近年來國內(nèi)外煙草科學(xué)研究領(lǐng)域也進(jìn)行了相關(guān)研究，如：張啟東等[10]確定了初烤煙葉的關(guān)鍵甜味成分物質(zhì)；遲廣俊等[11]利用感官導(dǎo)向分析確定了初烤煙葉的關(guān)鍵酸味成分；茅中一等[12]對福建尤溪煙葉香韻風(fēng)格的感官輔助凝膠色譜分析明確了其提取物中的重要香氣物質(zhì)。本研究以云南KRK26 的中桔三(C3F)等級煙葉為研究對象，基于感官輔助凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography，GPC)剖析煙葉關(guān)鍵致香成分，構(gòu)建煙葉致香成分與其香韻風(fēng)格特征的有效關(guān)聯(lián)，旨在為煙葉原料開發(fā)替代及卷煙葉組配方設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：云南KRK26 品種的C3F 煙葉；試劑：無水乙醇、95%乙醇、丙酮(色譜純)。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜—質(zhì)譜(GC-MS)分析儀：Agilent 7890A-5975C，凝膠柱(2.0 cm×100.0 cm，填充材料SephadexLH-20)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；水浴鍋；電子天平(感量0.001 g)。

1.3 方法

1.3.1溶劑提取方法

將煙葉50.0 g 浸泡于95%乙醇中2 h，料液比1∶10，水浴溫度80 ℃，重復(fù)提取2 次；將提取的溶液于50 ℃進(jìn)行蒸餾除去溶劑，濃縮至棕褐色黏稠液體，冷卻后得到KRK26 煙葉浸膏。

1.3.2分離方法

取KRK26 煙葉浸膏4.0 g 充分溶于無水乙醇后進(jìn)行過濾，將過濾后的浸膏加入裝填了大孔樹脂的色譜柱，使樹脂充分吸附后過濾，用純凈水作為洗脫劑，連續(xù)沖洗5 個(gè)柱體積后，改用乙醇洗脫至洗脫液為無色，然后濃縮乙醇洗脫液；將濃縮物進(jìn)行GPC 分離，洗脫劑為無水乙醇，每個(gè)流份收集時(shí)間為30 min、體積為40 mL[13]。

1.3.3感官評價(jià)

由10 名經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的感官評價(jià)人員組成評委，通過嗅評的方式對收集到的流份香氣特征進(jìn)行感官評價(jià)，并將具有相同香氣特征的流份進(jìn)行合并，組成目標(biāo)組分進(jìn)行香韻特征成分分析。

1.3.4香韻特征組分的致香成分分析

將目標(biāo)組分加壓蒸餾、濃縮定容至1.5 mL，加入20 mg/kg 正十七烷40 μL，并經(jīng)有機(jī)針式濾器過濾后轉(zhuǎn)入色譜進(jìn)樣小瓶，采用GC-MS 進(jìn)行定性分析，同時(shí)將各個(gè)組分致香成分分為清香、果香、花香、甜香、豆香、焦甜香和其他香氣成分等7 種香韻[14]。用于GC-MS 分析的毛細(xì)管色譜柱為Agilent J&W Scientific 公司的HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；儀器參數(shù)設(shè)定為：進(jìn)樣口溫度250 ℃，EI 離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，高純氦氣(純度大于 99.999%)作為載氣，柱流速1 mL/min，分流進(jìn)樣，分流比10∶1，進(jìn)樣量1 μL，溶劑延遲3 min；升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0 ℃，維持1 min，以5 ℃/min 的速度升至200 ℃，再以10 ℃/min 的速度升至260 ℃，并維持5 min。采用全掃描模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測，質(zhì)譜檢測范圍為35～450 amu (m/z)。采用隨機(jī)順序進(jìn)行連續(xù)樣本分析，避免因儀器信號波動(dòng)而造成的影響。

1.3.5數(shù)據(jù)處理與分析

以正十七烷為內(nèi)標(biāo)物，計(jì)算各香氣組分的質(zhì)量濃度，計(jì)算公式為[15]：

式中：C為待測物質(zhì)的質(zhì)量濃度，mg/kg；Ai為待測物質(zhì)的峰面積；A0為正十七烷的峰面積；C0為內(nèi)標(biāo)溶液的質(zhì)量濃度，mg/kg。

香氣活力值(odor activity value，OAV)是指香味組分中的某一組分相對濃度與其在某種特定介質(zhì)中閾值的比值，其大小反映了該組分對某種香味的貢獻(xiàn)度，其計(jì)算公式為[16-19]：OAV=C/T。式中：T為嗅覺閾值，其值使用Leffingwell &Associates 網(wǎng)站提供的閾值以及文獻(xiàn)[20-22]中的閾值，并優(yōu)先使用最新年份的閾值數(shù)據(jù)。

通常情況下，OAV 值越大說明該成分致香作用越大，但是由于積分面積歸一化法的限制，需引入相對香氣活力值(relative odor activity value，ROAV)為新的參數(shù)。ROAV 值是某一化合物在整體風(fēng)格特征的相對貢獻(xiàn)度，不需要對每個(gè)物質(zhì)進(jìn)行絕對定量便可得出香氣組分中各個(gè)香氣成分的貢獻(xiàn)度。ROAV≥1 的組分為關(guān)鍵香氣成分，0.1＜ROAV＜1 的組分為修飾香氣成分，ROAV≤0.1 的組分為潛在風(fēng)味化合物[23]。ROAV 值的計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 GPC 流份的感官評價(jià)

對GPC 分離得到的23 個(gè)流份進(jìn)行感官評價(jià)，得到香韻表現(xiàn)接近的7 個(gè)組分，各組分評價(jià)結(jié)果表明：F1 (流份1～3)和F7 (流份14～23)無明顯香氣特征；F2 (流份4～5)和F3 (流份6)都有清香香韻，其中，F(xiàn)2 清甜、帶有豆香，F(xiàn)3 則以清香為主，輔以花香和干草香香韻；F4 (流份7～9)也能嗅辨出F3 的花香和干草香，但香勢上明顯加強(qiáng)，同時(shí)出現(xiàn)濃烈果香香韻；F5 (流份10～12)以蜜甜香為主，伴隨有輕微焦甜香；F6(流份13)焦甜香香勢加強(qiáng)，能嗅辨出強(qiáng)烈焦甜香香韻。綜合來看，GPC 分離效果較明顯。

2.2 致香成分

GC-MS 定性分析結(jié)果(表1)顯示：茄酮和新植二烯等清香特征物質(zhì)主要集中在F2、F3 和F4，與其嗅辨中具有清香相符，F(xiàn)2 具有糠酸甲酯和對甲基苯乙酮等果香和豆香香韻特征成分，F(xiàn)3 具有α-亞麻酸和西松烯等特征香氣成分，F(xiàn)4 中新植二烯含量較高，具有檸檬醛和香葉醇等特征成分。與F2、F3、F4 相比，F(xiàn)5 中基本不含有清香、果香和花香特征成分，出現(xiàn)了蜜甜香香韻特征成分的苯乙酸以及焦甜香香韻的特征成分，F(xiàn)6 中只出現(xiàn)了具有焦甜香特征的5-羥甲基糠醛和麥芽酚等香氣成分?？傮w而言，清香香韻主要集中在F2 和F3 組分中，焦甜香香韻特征在F5 和F6 組分中，且F6 的焦甜香特征組分更多，這也是能在F6 中聞到強(qiáng)烈焦甜香的原因。F4 組分則有強(qiáng)烈的花香和果香，底部有強(qiáng)烈的干草香。綜上所述，F(xiàn)2～F6 不同香韻組分的分析結(jié)果與感官評價(jià)結(jié)果可以進(jìn)行相互印證。

表1 組分致香成分分析Tab.1 Analysis of aroma components

2.3 致香成分的香氣特征

由表2 可知：許多致香成分并不是只具有某種香韻，而兼有其他香韻特征，如：對甲基苯乙酮以豆香為主，兼有花香和果香香韻；糠酸甲酯具有花果香香韻及蘑菇似的香氣；金合歡醇具有特有的青香韻鈴蘭花香氣，并有青香和木香香韻[24-25]，這也從側(cè)面反映了烤煙香氣的復(fù)雜性。

表2 致香成分的香氣特征Tab.2 Aroma characteristics of aromatic components

2.4 特征香氣成分

由表3 可知：(+)-檸檬烯、檸檬醛、金合歡醇和香葉醇的閾值較低，對風(fēng)格特征貢獻(xiàn)度較大；5-羥甲基糠醛和香草酸的閾值較大，其貢獻(xiàn)度較小。各個(gè)組分都有彰顯自己香韻特征的重要化學(xué)成分，如：F2 中有金合歡醇、對甲基苯乙酮和茄酮等香氣物質(zhì)，但糠酸甲酯、新植二烯和金合歡基丙酮等并沒有查到相應(yīng)閾值，這些成分可能會(huì)對香氣有一定的貢獻(xiàn)；F3 中ROAV 值最大的是α-亞麻酸，其次是金合歡醇；F4 的主要香氣成分是(+)-檸檬烯、檸檬醛、茄酮和香葉醇等；F5 和F6 的主要香氣成分都有5-羥甲基糠醛，此外，F(xiàn)5 還具有蜜甜香香韻的苯乙酸成分，F(xiàn)6 中ROAV值最大的為具有焦甜香香韻特征的麥芽酚。

表3 不同組分致香成分的ROAV 值Tab.3 ROAV values of different aromatic components

2.5 不同組分的主要香氣成分和修飾香氣成分

F2 組分的主要香氣成分是金合歡醇和對甲基苯乙酮，修飾香氣成分是角鯊烯、棕櫚酸和茄酮；F3 的主要香氣成分是金合歡醇和α-亞麻酸，修飾香氣成分是(+)-檸檬烯、茄酮和角鯊烯；F4 的主要香氣成分是(+)-檸檬烯、檸檬醛、茄酮、香葉醇、棕櫚酸乙酯和角鯊烯，修飾香氣成分是棕櫚酸和巨豆三烯酮；F5 的主要香氣成分是苯乙酸，修飾香氣成分是5-羥甲基糠醛；F6 的主要香氣成分是麥芽酚，修飾香氣成分是香草酸和5-羥甲基糠醛。

3 討論

KRK26 作為六大外引品種之一，如何最大限度發(fā)揮原料特點(diǎn)、提高工業(yè)可用性一直備受關(guān)注，而工業(yè)可用性受不同香氣風(fēng)格影響，是不同香韻特征的綜合效應(yīng)，具有復(fù)雜的物質(zhì)基礎(chǔ)[26-27]。范幸龍等[28]研究表明：KRK26 以甜香、青香、木香和干草香(清香)為主體香韻，輔以焦香、正甜香和辛香香韻；在清甜香和青香香韻方面多于津巴布韋煙葉，在正甜香、木香、焦香和辛香香韻方面接近津巴布韋煙葉，而在干草香、焦甜香和堅(jiān)果香香韻方面略低于津巴布韋煙葉。楊康等[29]對麗江種植的KRK26 風(fēng)格特征評價(jià)結(jié)果也與之相印證。雖然這些研究可以在一定程度上說明KRK26 的卷煙風(fēng)格特征，但其主要從煙葉整體感官評價(jià)出發(fā)，闡明其內(nèi)在致香成分對香韻特征的貢獻(xiàn)值才能更好地凸顯香韻風(fēng)格特征。

研究表明：5-羥甲基糠醛、苯乙酸、棕櫚酸、茄酮和新植二烯等物質(zhì)為清香型卷煙煙氣的特征香味成分，對清香型卷煙風(fēng)格的形成具有重要影響[30]；茄酮與焦甜香韻和焦香香韻、巨豆三烯酮與清甜香韻均呈極顯著正相關(guān)[31]。此外，煙草中有些香氣物質(zhì)具有特殊的作用，如棕櫚酸有甜的蠟脂氣息，亞麻酸則會(huì)增加煙氣刺激性[32]，新植二烯是初烤煙葉中的關(guān)鍵香氣成分和增香劑[33-37]。感官評價(jià)輔助凝膠分析可用于香韻風(fēng)格與致香成分的內(nèi)在關(guān)系研究[12]，但致香成分對于整體香韻特征的貢獻(xiàn)不僅取決于含量，同時(shí)與閾值有較大關(guān)系，因此可通過ROAV 值進(jìn)行綜合評價(jià)。劉純友等[38]結(jié)合ROAV 值探究各成分對不同類型百香果總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)；李歡康等[39]結(jié)合ROAV 值，明確了核桃油的關(guān)鍵香氣成分構(gòu)成差異；王丹等[23]利用SPME-GC-MS 和ROAV 值分析了單菌及復(fù)配發(fā)酵牛乳中關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)?？梢姡捎肦OAV 值結(jié)合感官評價(jià)有助于揭示煙葉內(nèi)在致香成分。

本研究采用凝膠滲透色譜法對烤煙品種KRK26 的提取物進(jìn)行分離制備，結(jié)合感官評價(jià)、GC-MS 及ROAV 值，確定了彰顯KRK26 風(fēng)格特征的香韻組分及關(guān)鍵致香成分。原引進(jìn)的KRK26在津巴布韋具有明顯的焦香香韻，但在云南進(jìn)行推廣和種植后，該品種的清甜香韻凸顯，總體特征香韻以清香和焦甜香香韻為主，總體秉承了云南煙葉清甜香潤的風(fēng)格特色。

4 結(jié)論

本研究以感官輔助凝膠滲透色譜法分析KRK26 的香氣風(fēng)格特征，將其分為7 個(gè)不同香韻組分，對有明顯不同香韻特征的F2～F6 進(jìn)行致香成分分析，其中，F(xiàn)2～F3 清香香韻明顯，F(xiàn)5～F6則呈焦甜香香韻。KRK26 具有新植二烯、巨豆三烯酮和茄酮等清香風(fēng)格特征物質(zhì)，也有5-羥甲基糠醛和麥芽酚等焦甜香型物質(zhì)，還有香葉醇和金合歡醇等花香香韻以及檸檬醛和(+)-檸檬烯等果香香韻類物質(zhì)。