蚯蚓提取物對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的影響*

武 玲，張航瑜，楊衛(wèi)星，李國(guó)友，徐昆龍

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是炎癥性腸病的主要形式之一，炎癥始于直腸，并向結(jié)腸近端不斷延伸，繼而分布于部分或整個(gè)結(jié)腸中[1]。近年來(lái)，世界UC 發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，癥狀多以腹痛、腹瀉、黏液血便和里急后重為主[2]。由于UC 發(fā)病機(jī)理尚不清楚，當(dāng)前治療多以緩解病情為主，臨床上治療UC 的藥物以5-氨基水楊酸(5-aminosalicylic acid，5-ASA)為主[3]，搭配激素與免疫抑制劑，雖有一定療效，但常伴隨諸多不良反應(yīng)[4]。蚯蚓作為動(dòng)物性中藥材在中國(guó)已有幾千年的應(yīng)用歷史[5]，《本草綱目》蟲部42 卷中用蚯蚓入藥的處方就有40 多種，如治療口瘡、刀箭傷等。有研究表明蚯蚓提取物(earthworm extracts，EE)具有抗菌消炎、促進(jìn)創(chuàng)面愈合等作用[6-8]。本研究通過(guò)建立葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)的小鼠UC模型[9]，采用不同劑量EE 進(jìn)行干預(yù)，探究EE能否緩解UC 炎癥，以期為EE 抗UC 藥效成分的挖掘及蚯蚓藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試藥物

蚯蚓：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室自繁自養(yǎng)的掘穴環(huán)爪蚓。EE 制備：取新鮮蚯蚓，洗凈后清腸，于組織勻漿機(jī)內(nèi)充分研磨，離心取上清，加入固體硫酸銨攪拌(飽和度達(dá)到80%)，靜置過(guò)夜，離心取沉淀，PBS 溶解沉淀灌入透析袋，透析過(guò)夜，每4 h 換1 次透析液。透析結(jié)束后，離心取上清得到蚯蚓蛋白，測(cè)定質(zhì)量濃度(蚯蚓蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL)，按小鼠每日灌胃量分裝于 1.5 mL 無(wú)菌離心管中，—80 ℃保存。

1.2 主要試劑與儀器

試劑：DSS，北京酷萊博生物科技有限公司；5-ASA，北京索萊寶科技有限公司；糞便隱血定性檢測(cè)試劑盒，上海源葉生物科技有限公司；PrimeScript RT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB Green-Premix，寶生物工程 (大連) 有限公司；小鼠閉鎖小帶蛋白1 (ZO-1)、黏蛋白2 (Muc2)和咬合蛋白(occludin) ELISA 試劑盒，上海酶免生物科技有限公司。儀器：多功能酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技有限公司；熒光定量PCR 儀，羅氏Light Cycle(Roche)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與處理

1.3.1試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

C57BL/6 雌性小鼠72 只，SPF 級(jí)，4～6 周齡，體質(zhì)量(19±2) g，購(gòu)自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司，許可證號(hào)碼SCXK (豫) 2020-0005，動(dòng)物合格證編號(hào)No.410983220100050028。將小鼠飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體級(jí)(SPF 級(jí))實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，使用獨(dú)立通氣系統(tǒng)，平均室溫(22±2) ℃，相對(duì)濕度(55±5)%，自由飲食。

1.3.2試驗(yàn)分組與處理

經(jīng)過(guò)1 周適應(yīng)期后對(duì)小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，每組小鼠12 只，每籠飼養(yǎng)3 只，不同藥物均采用灌胃法處理，每天固定時(shí)間處理1 次。采用3.5%DSS 建立小鼠UC 模型，期間用不同劑量的EE和陽(yáng)性藥物5-ASA 連續(xù)干預(yù)小鼠9 d，于第10 天處死。每2 d 更換新鮮配制的DSS 溶液。

設(shè)置6 個(gè)試驗(yàn)組。①空白對(duì)照組(CK)：自由飲用無(wú)菌水，持續(xù)9 d，同時(shí)灌胃PBS；② UC模型組(DSS)：前7 d 自由飲用3.5% DSS 溶液，后2 d 自由飲用無(wú)菌水，同時(shí)灌胃PBS；③模型組+EE 高劑量組(DSS+EE-H)：前7 d 自由飲用3.5% DSS 溶液，后2 d 自由飲用無(wú)菌水，同時(shí)灌胃20 mg/kg EE；④ 模型組+EE 中劑量組(DSS+EE-M)：前7 d 自由飲用3.5% DSS 溶液，后2 d自由飲用無(wú)菌水，同時(shí)灌胃10 mg/kg EE；⑤ 模型組+EE 低劑量組(DSS+EE-L) ：前7 d 自由飲用3.5% DSS 溶液，后2 d 自由飲用無(wú)菌水，同時(shí)灌胃5 mg/kg EE；⑥ 模型組+陽(yáng)性藥物對(duì)照組(DSS+5-ASA)：前7 d 自由飲用3.5% DSS 溶液，后2 d 自由飲用無(wú)菌水，同時(shí)灌胃50 mg/kg 5-ASA。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1小鼠臨床癥狀觀察和疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分

給藥后每天觀察試驗(yàn)小鼠的毛色、精神狀態(tài)和飲食情況等，每天固定時(shí)間對(duì)小鼠稱量、觀察糞便性狀及糞便隱血情況，參考 HAMAMOTO 等[10]的方法進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)評(píng)分(表1)。DAI 總分=體質(zhì)量損失評(píng)分+糞便性狀評(píng)分+隱血情況評(píng)分；體質(zhì)量損失=(造模后某時(shí)間點(diǎn)的體質(zhì)量－造模前體質(zhì)量)/造模前體質(zhì)量×100%。

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Disease activity index scoring standard

1.4.2小鼠結(jié)腸組織病理分析及損傷評(píng)分

采用4%多聚甲醛固定小鼠結(jié)腸組織，石蠟包埋，并進(jìn)行蘇木精—伊紅染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察病理切片，參照 EKSTR?M[11]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行損傷評(píng)分(表2)。每只小鼠的損傷總分=上皮細(xì)胞評(píng)分+炎細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分。

表2 結(jié)腸組織損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Colon tissue histopathological scores standard

1.4.3小鼠結(jié)腸組織中目標(biāo)基因mRNA 表達(dá)量的測(cè)定

使用 TRIzol 從小鼠結(jié)腸樣本中提取總RNA并進(jìn)行濃度檢測(cè)，采用PrimeScript RT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。按照SYBR 試劑盒說(shuō)明書在熒光定量PCR 儀進(jìn)行目標(biāo)基因表達(dá)的測(cè)定，基因的表達(dá)水平采用 2—ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。測(cè)定的目標(biāo)基因引物序列見(jiàn)表3。

表3 供試引物序列Tab.3 Primer sequences for test

1.4.4小鼠結(jié)腸組織中目標(biāo)蛋白表達(dá)量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取結(jié)腸組織，按質(zhì)量(mg)∶體積(μL)為1∶9 的比例加入9 倍體積的勻漿介質(zhì)(0.9%生理鹽水)，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，制備成10%勻漿液，于2 500～3 000 r/min 離心10 min，取上清液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定ZO-1、Muc2和occludin 蛋白的表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用GraphPad Prism 9.0 軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 EE 對(duì)DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠一般體征和體質(zhì)量的影響

由圖1 可知：CK 組小鼠體質(zhì)量持續(xù)增加，其他試驗(yàn)組小鼠于第2 天開(kāi)始體質(zhì)量下降，各試驗(yàn)組小鼠均出現(xiàn)活躍度降低、精神狀態(tài)不佳等情況。與CK 組相比，DSS 組小鼠體質(zhì)量極顯著下降(P＜0.01)；與DSS 組相比，經(jīng)不同劑量EE 處理和5-ASA 治療后，DSS+EE-H 組、DSS+EEM 組和DSS+5-ASA 組小鼠體質(zhì)量極顯著升高(P＜0.01)、DSS+EE-L 組小鼠體質(zhì)量顯著升高(P＜0.05)。說(shuō)明EE 可以緩解DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量下降。

圖1 不同處理組小鼠體質(zhì)量的變化Fig.1 Changes in body weight of mice in different treatment groups

2.2 EE 對(duì)DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠DAI 評(píng)分的影響

由圖2 可知：CK 組中小鼠體質(zhì)量持續(xù)增加，大便外觀正常，沒(méi)有糞便隱血；隨著連續(xù)攝入3.5% DSS 水溶液，其他試驗(yàn)組小鼠逐漸出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、精神狀態(tài)不佳、血便、腹瀉等臨床癥狀，其DAI 評(píng)分明顯升高。與CK 組相比，DSS組小鼠DAI 評(píng)分極顯著增高(P＜0.01)，第5 天開(kāi)始出現(xiàn)便血，大便松軟，到第9 天時(shí)評(píng)分達(dá)到最高；與DSS 組相比，DSS+EE-H 組、DSS+EE-M組、DSS+EE-L 組和DSS+5-ASA 組小鼠的DAI評(píng)分極顯著降低(P＜0.01)。說(shuō)明EE 呈劑量依賴性降低DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠DAI 評(píng)分。

圖2 不同處理組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分Fig.2 Disease activity index of mice in different treatment groups

2.3 EE 對(duì)DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠脾臟腫大的影響

由圖3 可知：與CK 組小鼠脾臟質(zhì)量相比，經(jīng)DSS 誘導(dǎo)后小鼠脾臟質(zhì)量極顯著增加(P＜0.01)，脾臟腫大；與DSS 組小鼠脾臟相比，經(jīng)EE 處理和5-ASA 治療后，DSS±EE-H 組、DSS±EE-M 組、DSS+EE-L 組和DSS+5-ASA 組的脾臟腫大現(xiàn)象均得到極顯著改善(P＜0.01)。說(shuō)明EE 能在一定程度上改善DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠脾臟腫大。

圖3 不同處理組小鼠脾臟質(zhì)量變化Fig.3 Changes in spleen weight of mice in different treatment groups

2.4 EE 對(duì)DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的影響

由圖4a 可知：CK 組小鼠腸道內(nèi)容物形態(tài)完整，為顆粒狀，無(wú)血便和稀便；而DSS 組結(jié)腸腸道呈暗紅色，腫脹，內(nèi)容物減少，糞便形態(tài)不完整，有血便；經(jīng)EE 處理和5-ASA 治療后，腸道腫脹情況得以改善，糞便殘留具有一定的形狀，血便和稀便情況得以改善。由圖4b 可知：與CK 組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度相比，DSS 組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度極顯著縮短(P＜0.01)；與DSS 組相比，經(jīng)EE 處理和5-ASA 治療后，DSS+EE-H 組和DSS+EEM 組結(jié)腸縮短現(xiàn)象極顯著改善(P＜0.01)，DSS+EE-L 組和DSS+5-ASA 組結(jié)腸縮短現(xiàn)象顯著改善(P＜0.05)。說(shuō)明EE 可以改善DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸縮短，保護(hù)小鼠結(jié)腸組織。

圖4 不同處理組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的變化Fig.4 Changes in colon length of mice in different treatment groups

2.5 EE 對(duì)DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理?yè)p傷的影響

由圖5a 可知：CK 組黏膜層腸上皮結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、排列緊密，固有層腸腺豐富，可見(jiàn)較多杯狀細(xì)胞，未見(jiàn)明顯炎癥。與CK 組相比，DSS 組黏膜層可見(jiàn)較大面積潰瘍，腸上皮細(xì)胞及隱窩結(jié)構(gòu)被破壞，杯狀細(xì)胞基本消失，并伴有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)至黏膜下層。與DSS 組相比，經(jīng)過(guò)EE 處理和5-ASA 治療后，病變程度有較大緩解，炎性病變范圍減小，隱窩結(jié)構(gòu)和組織上皮細(xì)胞恢復(fù)完整，炎性浸潤(rùn)的程度減少。圖5b 可知：與CK組相比，DSS 組小鼠損傷評(píng)分極顯著升高(P＜0.01)；與DSS 組相比，DSS+EE-H 組和DSS+EE-M 組小鼠的損傷評(píng)分極顯著降低(P＜0.01)，DSS+5-ASA 組小鼠的損傷評(píng)分顯著降低(P＜0.05)。說(shuō)明EE 可以緩解DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織病理性損傷。

圖5 不同處理組小鼠結(jié)腸組織學(xué)觀察(200×)及損傷評(píng)分Fig.5 Histological proximal sections and histopathological scores of colon of mice in different treatment groups

2.6 EE 對(duì)DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子mRNA 的影響

由圖6 可知：與CK 組相比，DSS 組促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 和 IL-1β 以及抗炎因子IL-10 的表達(dá)量極顯著增加(P＜0.01)；與DSS 組相比，經(jīng)EE 處理和5-ASA 治療后，促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的表達(dá)量均顯著或極顯著下降(P＜0.01 或P＜0.05)，抗炎因子IL-10 的表達(dá)量均升高，其中，DSS+EE-H 組和DSS+EE-M 組極顯著升高(P＜0.01)，DSS+EE-L 組顯著升高(P＜0.05)。說(shuō)明EE 可以通過(guò)調(diào)控炎癥因子平衡來(lái)緩解小鼠UC，且EE 對(duì)相關(guān)炎癥因子的調(diào)控效果優(yōu)于陽(yáng)性藥物5-ASA。

圖6 EE 對(duì)DSS 誘導(dǎo)UC 小鼠組織中炎癥因子表達(dá)的影響Fig.6 Effects of EE on the expression of inflammatory factors in the tissue of DSS induced UC mice

2.7 EE 對(duì)DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠腸道屏障功能的影響

由圖7 可知：與 CK 組相比，DSS 組小鼠腸黏膜蛋白Muc2、ZO-1 和occludin 的表達(dá)量極顯著降 低(P＜0.01)。與 DSS 組相比，DSS+EE-H組、DSS+EE-M 組和DSS+5-ASA 組(P＜0.05)的Muc2 表達(dá)量顯著或極顯著增加(P＜0.05 或P＜0.01)；DSS+EE-H 組和DSS+EE-M 組的ZO-1 表達(dá)量極顯著增加(P＜0.01)；DSS+EE-H 組的occludin 表達(dá)量極顯著增加(P＜0.01)。說(shuō)明EE 能夠增加DSS 誘導(dǎo)UC 小鼠腸黏膜蛋白Muc2、ZO-1 和occludin 的表達(dá)量，修復(fù)腸道屏障受損和調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)失衡。

3 討論

本研究采用自由飲用3.5% DSS 誘導(dǎo)小鼠UC 模型，小鼠在疾病發(fā)展過(guò)程中表現(xiàn)出與UC患者相似的癥狀，如體質(zhì)量減輕、腹瀉、活動(dòng)量減少、結(jié)腸長(zhǎng)度縮短等，與已有研究結(jié)果[9,12]一致。DAI 評(píng)分和結(jié)腸長(zhǎng)度被認(rèn)為是衡量UC 嚴(yán)重程度的常用指標(biāo)，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和上皮細(xì)胞損傷也是UC 的主要組織學(xué)特征[2]。脾臟是炎癥發(fā)生嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)之一，炎癥越嚴(yán)重，脾臟質(zhì)量也會(huì)增大。EE 處理后，小鼠DAI 評(píng)分降低，體質(zhì)量下降恢復(fù)，結(jié)腸長(zhǎng)度和脾臟腫大改善，腸組織黏膜上皮損傷和炎癥浸潤(rùn)減輕，且隨著EE 濃度的提高，改善效果越明顯。以上結(jié)果說(shuō)明EE 處理對(duì)改善DSS 誘導(dǎo)的UC 小鼠臨床癥狀和結(jié)腸病理變化具有良好的效果。

據(jù)報(bào)道，促炎癥細(xì)胞因子和抗炎癥細(xì)胞因子之間的失衡在UC 發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[13]，TNF-α、IL-6 和IL-1β 是常見(jiàn)的促炎因子，IL-10是常見(jiàn)的抗炎因子。本研究中，DSS 組抗炎因子IL-10 的表達(dá)相對(duì)于正常組顯著增加，這可能與自身抗炎機(jī)制激活有關(guān)，但自身抗炎機(jī)制的激活并不足以抵抗UC 帶來(lái)的炎癥因子表達(dá)失衡。經(jīng)EE 處理后，TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)水平降低，而IL-10 表達(dá)水平升高。提示EE 可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子分泌減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，最終達(dá)到緩解UC 的作用。

本研究測(cè)定了小鼠結(jié)腸組織中與腸道屏障完整性相關(guān)的黏蛋白Muc2 以及緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 的表達(dá)情況。緊密連接是腸道屏障的重要組成部分，對(duì)維持腸上皮結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起著重要作用，屏障功能異常是人腸道炎癥的重要表征，也是發(fā)生UC 的原因之一[14]。維持腸道的屏障功能可改善其防御功能，維持其免疫功能，減輕炎癥，降低此類疾病復(fù)發(fā)的可能性。本研究中，DSS 組小鼠的Muc2、occludin 和ZO-1 表達(dá)量明顯降低，這與已有研究[15-16]結(jié)果一致；而經(jīng)EE 處理后，Muc2、occludin 和ZO-1 的表達(dá)量顯著提升，表明EE 可保護(hù)UC 小鼠的結(jié)腸黏膜完整性和腸黏膜屏障功能。

4 結(jié)論

蚯蚓提取物對(duì)葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎(UC)具有緩解作用，可減輕小鼠結(jié)腸組織炎性損傷和UC 癥狀，保護(hù)結(jié)腸黏膜完整性和屏障功能。