豬捷申病毒云南流行株的遺傳進(jìn)化*

蔡懿琳，朱培英，柴 俊，宋春蓮，楊莎莎，武 鑫，張以芳，李文貴

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201)

豬捷申病毒(porcine teschovirus，PTV)屬于小RNA 病毒科腸道病毒屬的一員，最早發(fā)現(xiàn)于20 世紀(jì)30 年代的捷克斯洛伐克捷申地區(qū)，當(dāng)時(shí)病死率高達(dá)80%以上。PTV 的傳染源為病豬和帶毒豬，感染豬在臨床明顯期甚至潛伏期都具有傳染性。該病毒主要存在于病豬腦脊髓中，但在感染后幾周內(nèi)可隨唾液和糞便等排出[1]。即使是外觀正常、特別是4 周齡以上的豬，其體內(nèi)也可分離到該病毒，說(shuō)明健康豬也普遍存在帶毒現(xiàn)象，而強(qiáng)毒株可引起暴發(fā)流行[2]。迄今為止，在家豬中檢出的 PTV 血清型包括PTV1～PTV12，在野豬中還檢出了PTV13，共計(jì) 13 種血清型毒株[3-5]。豬是PTV 唯一的宿主，且各年齡的豬均易感，其中幼齡豬的易感性最高，哺乳仔豬感染PTV 后，死亡率高達(dá)100%；而3 周齡以上的豬感染PTV則存在隱性感染。病毒隨糞便排出體外，排毒量大，排毒時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)數(shù)周[6]。中國(guó)是世界生豬養(yǎng)殖第一大國(guó)，豬肉產(chǎn)量不僅與中國(guó)養(yǎng)豬行業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益息息相關(guān)，也與人們的日常生活密不可分。2003 年在中國(guó)內(nèi)蒙古首次分離到PTV，命名為Swine/CH/IMH/03，屬于PTV1 血清[7]；隨后，陸續(xù)在中國(guó)的黑龍江、吉林、河南、江蘇、上海、廣西和湖南等地的豬場(chǎng)檢出PTV，說(shuō)明該病已在中國(guó)豬群中蔓延開(kāi)來(lái)[8-10]，而云南鮮有關(guān)于PTV 的研究報(bào)道。為了解云南省豬群的感染情況，本研究參考GenBank 上已收錄的基因序列，針對(duì)豬PTV 5′-UTR 部分基因片段設(shè)計(jì)1 對(duì)引物，對(duì)云南部分豬場(chǎng)的糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)擴(kuò)增片段的同源性分析，闡明云南地區(qū)PTV 流行株的遺傳特性，為制定科學(xué)的防控措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020 年6 月—2021 年12 月，從云南省曲靖市、彌勒市和大理州的3 個(gè)豬場(chǎng)共采集117 份豬糞便樣品，按1∶5 (m∶V)加入無(wú)菌生理鹽水振蕩混勻，反復(fù)凍融3 次，再以10 000 r/min 離心5 min，取上清液于—50 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

Trizol 總RNA 提取試劑、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、2×EasyTaqPCR SuperMIX 和RNA Dissolving Solution 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Goldview Ⅱ型核酸染色劑購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；PrimeScriptTMIV 1st strand cDNA Synthesis Mix、DL2000 DNA Marker、pMD-19-T Vevtor Cloning Kit 和大腸桿菌DH5α Competent Cells 購(gòu)自寶日生物工程有限公司；IPTG和X-Gal 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank 上登錄的PTV 基因組全長(zhǎng)序列進(jìn)行序列比對(duì)，選取5′-UTR 非編碼區(qū)部分基因保守區(qū)域，通過(guò)Primer 5.0 生物軟件設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物 (F：5′-GAAGAGCAAGTACTCCTGAC-3′；R：5′-YAGCRCAAGTCCAGTCCT-3′)，產(chǎn)物長(zhǎng)度為125 bp，由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司合成。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1總 RNA 提取

采用Trizol 法抽提樣本中的總RNA，取上清液300 μL，加入Trizol 1 mL，劇烈混勻，靜置(裂解) 5 min。加入氯仿200 μL，蓋上離心蓋，劇烈混勻10 s，靜置3 min，4 ℃、10 000 r/min 離心15 min；取上清液500 μL 轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌無(wú)酶EP 離心管(注意不吸到中間的蛋白質(zhì)層)，加入異丙醇0.5 mL，上下顛倒混勻；常溫下靜置10 min，4 ℃、10 000 r/min 離心10 min，棄上清液后加入75%乙醇1 mL，劇烈渦旋，4 ℃、7 500 r/min離心5 min，倒掉乙醇，倒置在干凈的濾紙上，用吸水紙擦干管壁，吹風(fēng)干燥；加入RNA Dissolving Solution 50 μL 溶解沉淀(即RNA)，后于—80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2cDNA 合成及目的基因擴(kuò)增

反轉(zhuǎn)錄總反應(yīng)體系為20 μL，包括5×Prime-Script IV cDNA Synthesis Mix 4 μL，50 μmol/L Random 6 mers 2 μL，模板 RNA 8 μL，RNase Free dH2O 6 μL；反應(yīng)條件為30 ℃ 10 min，42 ℃15 min。PCR 擴(kuò)增總反應(yīng)體系為25.0 μL，包括2×EasyTaq?PCR SuperMix (+dye) 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，無(wú)核酸酶水 8.5 μL，cDNA 2.0 μL；反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。

1.4.3目的基因回收以及基因克隆與鑒定

擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳110 V、40 min 檢測(cè)并觀察結(jié)果。挑選片段大小正確的陽(yáng)性PCR 產(chǎn)物，用凝膠快速回收試劑盒回收并純化；回收產(chǎn)物與pMD19-T 載體連接2 h 或過(guò)夜，再轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；挑選白色菌落接種于含氨芐青霉素(100 mg/mL)的LB 液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；以菌液為模板配制PCR 體系，采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。提取陽(yáng)性菌液的質(zhì)粒，送至上海生工生物工程股份有限公司昆明分公司測(cè)序。

1.4.4陽(yáng)性序列分析及遺傳進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

從GeneBank 中選擇19 條PTV1～ PTV13 參考序列，并以1 株豬薩佩羅序列(MN685785)作為出群參考，采用DNAstar 軟件分析核苷酸序列的同源性；采用MEGA 7.0 軟件的鄰接法分析并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自舉檢驗(yàn)(bootstrap)取值1 000。本研究獲取的序列用“▲”表示，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中其他地區(qū)分離的PTV 毒株序列用“GenBank 序列號(hào)-PTV 血清型-分離國(guó)家”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，可見(jiàn)約125 bp 的目標(biāo)條帶(圖1)。117 份糞便樣品中有陽(yáng)性樣品32 份，陽(yáng)性率為27.3%。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

陽(yáng)性樣品經(jīng)測(cè)序、比對(duì)和去除重復(fù)序列后獲得6 條序列。經(jīng)分析，分離株間的核苷酸同源性為93.2%～98.9%；與19 株P(guān)TV 參考序列的核苷酸同源性為89.7%～100.0% (圖2)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果(圖3)顯示：YNDL-2 和YNDL-3 處于同一分支，與中國(guó)四川省2018 年分離的PTV3 毒株親緣關(guān)系較近；YNQJ-1 與日本2016 年分離的PTV1毒株處于同一分支，親緣關(guān)系較近；YNDL-1、YNQJ-4 和YNQJ-5 聚為一簇，株間核苷酸序列相似度為97.7%～98.9%，與2010 年分離自多米尼加的PTV1 毒株親緣關(guān)系較近。說(shuō)明同一豬場(chǎng)可能存在不同的PTV 基因型，但未體現(xiàn)出明顯的地域差異；YNDL-1、YNQJ-4 和YNQJ-5 的序列相似度和系統(tǒng)發(fā)育分析說(shuō)明該P(yáng)TV 毒株可能在傳播過(guò)程中發(fā)生了部分基因突變。

圖2 PTV 5′-UTR 部分基因的核苷酸同源性分析結(jié)果Fig.2 Nucleotide homology analysis results of partial PTV 5′-UTR gene

圖3 PTV 部分5′-UTR 基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on the partial PTV 5′-UTR gene

3 討論

自1929 年P(guān)TV 首次在捷克斯洛伐克捷申地區(qū)被發(fā)現(xiàn)至今已近百年，該病現(xiàn)已成為世界范圍流行的豬傳染病，危害養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。PTV 的主要傳播方式是直接接觸傳播和糞口傳播，也可通過(guò)呼吸道黏膜、眼結(jié)膜和生殖道感染豬群[11]，豬只跨省調(diào)運(yùn)或冷鏈運(yùn)輸是該病潛在的風(fēng)險(xiǎn)因素。資料表明：在2 ℃儲(chǔ)存6 周的真空包裝豬肉中仍可檢出PTV[12]。2003 年，中國(guó)哈爾濱獸醫(yī)研究所首次從內(nèi)蒙古分離到第1 株P(guān)TV，隨后全國(guó)各地陸續(xù)檢出該病毒。徐國(guó)棟等[8]對(duì)江蘇、黑龍江、上海、吉林、廣西和河南等地2007-2016 年P(guān)TV 流行病學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總發(fā)現(xiàn)：該病毒陽(yáng)性率最高達(dá)57.14% (52/91)，平均陽(yáng)性率為28.05% (274/977)；本研究27.3%的流行強(qiáng)度為近年來(lái)國(guó)內(nèi)報(bào)道的平均水平。

目前PTV 檢測(cè)方法有免疫電鏡技術(shù)、間接ELISA、膠體金技術(shù)以及RT-PCR 技術(shù)等，其中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和RT-PCR 是最常用的檢測(cè)方法。由于PTV 高度變異，設(shè)計(jì)通用檢測(cè)引物難度大[13]，本研究通過(guò)比對(duì)GenBank 近年收錄的PTV 群基因組序列，通過(guò)對(duì)保守基因(5′-UTR)部分片段設(shè)計(jì)引物，建立的RT-PCR 檢測(cè)方法不僅具有特異性強(qiáng)、耗時(shí)短和檢出率高等優(yōu)點(diǎn)，而且較熒光PCR 成本更低，適合豬場(chǎng)大批量樣品核酸檢測(cè)。本研究通過(guò)PTV 核酸特異性擴(kuò)增和測(cè)序，經(jīng)同源性比較與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)：大理同一豬場(chǎng)同時(shí)存在PTV3 和PTV1 感染，曲靖某豬場(chǎng)流行的毒株則均為PTV1，說(shuō)明PTV1在云南省豬場(chǎng)較為常見(jiàn)，同一豬場(chǎng)同時(shí)存在多種流行型毒株。本研究的樣品來(lái)源于無(wú)異常臨床表現(xiàn)的豬只新鮮糞便，但PTV 核酸陽(yáng)性率高達(dá)27.3%，表明PTV 在豬群中的隱性感染現(xiàn)象較為普遍?？紤]到本研究的樣本量有限，應(yīng)在全省范圍內(nèi)開(kāi)展系統(tǒng)流行病學(xué)調(diào)查，掌握PTV 的流行情況及風(fēng)險(xiǎn)因素。

PTV 在豬場(chǎng)的流行越來(lái)越普遍，其對(duì)豬只健康的影響急待明確。在江西豬場(chǎng)，PTV 感染保育豬可出現(xiàn)發(fā)熱和癱瘓等癥狀[10]；云南蘭坪縣[14]和馬龍區(qū)[15]等地豬場(chǎng)觀察到PTV 感染仔豬出現(xiàn)高熱、驚厥、死亡和腹瀉等為主的臨床癥狀。PTV還可與CSFV、PRRSV 和PCV2 等重要病原混合感染[16-17]，使豬場(chǎng)疫病更加復(fù)雜，增加防控工作難度[18]。目前已有研究更多關(guān)注豬繁殖與呼吸綜合征(PRRSV)和豬瘟(CSFV)等重要傳染病，而PTV 多呈亞臨床感染，往往被養(yǎng)豬行業(yè)忽視。值得注意的是，作為小RNA 病毒的PTV 已發(fā)現(xiàn)13 種血清型，血清型間致病性差異較大，加之該病毒變異性強(qiáng)，有必要對(duì)其開(kāi)展流行病學(xué)調(diào)查以及致病機(jī)制和免疫機(jī)理等基礎(chǔ)研究，評(píng)估其對(duì)中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成的潛在威脅，提前做好技術(shù)儲(chǔ)備。

本研究用于分析的PTV 5′-UTR 片段較短，得出的結(jié)論存在一定局限性，僅可為云南省PTV流行情況及毒株遺傳進(jìn)化差異性提供參考。在下一步工作中，將對(duì)PTV 其他編碼區(qū)域的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行氨基酸突變位點(diǎn)和基因重組分析，預(yù)測(cè)其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和磷酸化位點(diǎn)，深入研究擴(kuò)增片段在PTV 遺傳進(jìn)化中的作用。此外，將通過(guò)細(xì)胞攻毒培養(yǎng)的方式，對(duì)云南流行的優(yōu)勢(shì)毒株進(jìn)行分離鑒定，并進(jìn)行深入研究，探究其致病機(jī)理及其與宿主細(xì)胞的互作關(guān)系，為PTV 的疾病防控和疫苗研發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。

4 結(jié)論

針對(duì)豬捷申病毒(PTV) 5′-UTR 保守區(qū)域設(shè)計(jì)了1 對(duì)檢測(cè)引物，并對(duì)云南省曲靖、彌勒和大理部分豬場(chǎng)采集的樣品進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)，PTV 陽(yáng)性率達(dá)27.3% (32/117)。6 條流行毒株擴(kuò)增序列的株間核苷酸同源性為93.2%～98.9%，與19 株P(guān)TV參考序列的核苷酸同源性為89.7%～100.0%，表明流行株間遺傳進(jìn)化關(guān)系差異較大，同一豬場(chǎng)存在不同基因型的病毒感染，但區(qū)域流行性不明顯。