版納微型豬近交系用于鎮(zhèn)痛類經皮吸收藥物體外滲透性評價*

王 晶，史海瓊，程 雯，張大妹，師亞玲，高 藝，柴文英，魏紅江,**

(1.云南省小型豬基因編輯與異種器官移植重點實驗室，云南 昆明 650201；2.云南農業(yè)大學 動物科學技術學院，云南 昆明 650201；3.云南農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，云南 昆明 650201；4.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院乳腺外科，云南 昆明 650032)

經皮給藥系統(transdermal therapeutic system，TTS)是指在經皮膚給藥后，藥物迅速穿透皮膚，進入血液循環(huán)而起到全身治療作用的控釋制劑[1]，其藥物作用穩(wěn)定持久，能有效避免肝臟首過效應，也可避免藥物在人體胃腸道中被破壞，減輕毒副作用，用藥方便。鎮(zhèn)痛藥物在全球臨床上的應用非常廣泛，但其胃腸道副作用極常見，常會引起胃腸道潰瘍綜合征[2]，口服給藥期間還會發(fā)生如便秘、嘔吐、心動遲緩、消化障礙、脹氣、食欲不振和意識模糊等不良反應[3]。鎮(zhèn)痛類藥物口服發(fā)生不適癥狀時藥物已入血，減少血液中的藥物濃度比較困難，因此，鎮(zhèn)痛類藥物經皮給藥外用制劑的研究受到廣泛關注。

使用動物皮膚進行藥物滲透試驗，可以計算透皮給藥的吸收速率和吸收量，是TTS 體外評價的重要環(huán)節(jié)。藥物透皮吸收的檢測方法包括體外法和在體法，使用離體皮膚通過Franz 擴散池法測定藥物的體外釋放速度和透過皮膚藥物量是評估經皮吸收藥物滲透性的經典方法[1]。有研究通過Franz 擴散池法比較了鼠、兔、蛇、豬、青蛙和泥鰍等動物皮膚與人體皮膚的藥物滲透性，豬皮膚與人體皮膚對藥物滲透性最為相似[4]。此外，已有研究表明豬在生理學、皮膚組織學和解剖學等方面與人類有很多相似之處[5]，因此，豬皮膚是進行藥物皮膚滲透研究的理想載體[6]。版納微型豬近交系作為中國的特有及優(yōu)勢品種，是目前最理想的試驗用小型豬之一[7]。除了具有試驗用小型豬共有的優(yōu)勢之外，版納微型豬近交系還具有飼養(yǎng)成本低、發(fā)育成熟時形體較小、易于試驗操作管理、基因純合度高和個體間差異小等優(yōu)勢。目前，以版納微型豬近交系作為動物模型來評估經皮吸收藥物滲透性的試驗尚未見報道。本研究首先通過HE 染色、Masson 染色、彈力纖維染色以及透射電鏡技術比較版納微型豬近交系皮膚(以下簡稱“豬皮膚”)和人皮膚組織形態(tài)的相似性；再選擇水楊酸溶液、雙氯酚酸二乙胺乳膏和利多卡因凝膠貼膏3 種藥物作為模型藥物，通過Franz 擴散池法比較24 h 內豬皮膚和人皮膚藥物質量濃度—時間曲線的相似性，從組織學形態(tài)和藥物滲透性上驗證豬皮膚與人皮膚的相似性，為版納微型豬近交系作為經皮吸收藥物評估的良好模型提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1臨床皮膚組織

人皮膚樣本來自乳腺癌患者手術治療過程中切除的乳房皮膚組織，由昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院提供。去除皮下脂肪后，將皮膚裁剪為2 cm×2 cm 的皮片，置于—80 ℃冰箱保存。皮膚用前放至磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中解凍，恢復室溫后備用。

1.1.2豬皮膚組織

選取健康8 月齡雄性版納微型豬近交系6 頭，經耳緣靜脈注射丙泊酚(2 mg/kg)麻醉后，從豬的肩胛部、臀部、背部及側腹部切取大小為2 cm×2 cm 的皮片；豬乳房組織皮膚取自1 頭11 月齡雌性版納微型豬近交系。切取皮膚后，盡量去除皮下脂肪組織，用生理鹽水沖洗后用吸水紙吸干，置于—80 ℃凍存。試驗動物飼養(yǎng)和處理均符合實驗動物福利和倫理要求，試驗過程嚴格遵守云南農業(yè)大學生命科學倫理委員會相關要求。

1.2 試驗試劑和儀器

主要試劑：1%雙氯酚酸二乙胺乳膏劑，GSK Consumer Heathcare Schweiz AG；水楊酸，上海源葉；利多卡因凝膠貼膏(14 cm×10 cm，700 mg)，北京泰德制藥股份有限公司；丙泊酚，江蘇恩華藥物股份有限公司；雙氯酚酸二乙胺標準品、水楊酸標準品和利多卡因標準品，北京萬家標準物質研發(fā)中心；PBS、HE 染色試劑盒(G1120)、Masson 三色染色試劑盒(G1340)和彈力纖維染色試劑盒(G1593)，北京索萊寶科技有限公司。

主要儀器：TP-6 型透皮擴散儀(天津精拓儀器科技有限公司)；酶標儀(Thermo，MultiskanGo)；高效液相色譜儀(Agilent，1100)；顯微鏡(OLYMPUS，BX53)；透射電子顯微鏡(Japan Electronics，JEM-1400Plus)。

1.3 皮膚組織結構形態(tài)觀測

1.3.1HE 染色、Masson 染色和彈力纖維染色

將人和豬皮膚在4%多聚甲醛中固定，經石蠟包埋后，用石蠟切片機切取厚4 μm 的切片；石蠟切片經過二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化處理后，分別按照HE 染色、Masson 三色染色和彈力纖維染色試劑盒說明書對切片進行染色；染色完成后，用中性樹膠封片，置于烤片機上于62 ℃烤干，在顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.2透射電鏡觀察

于4 ℃下使用2.5%戊二醛溶液對新鮮采集的皮膚組織(1 mm3)進行固定過夜，用0.1 mol/L PBS 洗滌3 次，持續(xù)7 min；將皮膚組織用1%鋨酸溶液于4 ℃下固定2 h，然后用去離子水洗滌3 次，持續(xù)7 min，之后依次進行乙醇脫水和丙酮轉化各5 min。將固定后的組織包埋在Epon812樹脂中，在60 ℃下聚合48 h；使用Leica EM UC7超微切片機將樣品制作成超薄切片(800 nm)，然后將超薄切片加載到銅網格上，并用2%乙酸鈾酰和檸檬酸鉛雙重染色，然后在80 kV 下使用透射電子顯微鏡進行觀察。

1.3.3皮膚組織厚度測量

分別使用游標卡尺和組織切片法測量供試皮膚的厚度。切取的皮膚組織，去除皮下脂肪組織后，首先通過游標卡尺測量皮膚厚度；然后通過顯微鏡采集Masson 染色圖片，使用顯微鏡自帶的軟件根據標尺測量和計算表皮、真皮以及全皮層厚度。

1.4 皮膚滲透試驗

體外皮膚滲透試驗使用透皮擴散儀進行。在6 個透皮杯接受室中加入PBS 10 mL，放入攪拌子。將解凍后的皮膚固定于接受室上，皮膚角質層朝向供給室，分別將水楊酸溶液、雙氯酚酸二乙胺乳膏和利多卡因凝膠貼膏置于皮膚表面。因水楊酸溶液透皮性較差，滲透試驗前需在供給室中加入促滲劑(3%月桂氮卓酮) 1 mL，于32 ℃水溶液中作用1 h 后吸出促滲劑，用PBS 多次洗凈后再進行滲透試驗。設置攪拌子轉速為350 r/min，分別在給藥后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 和24.0 h 吸取滲透液600 μL 放于EP 管中保存，每次取樣后向接受室中加入等量的PBS。

1.5 藥物質量濃度的測定

1.5.1酶標儀檢測

在電子天平上稱取雙氯芬酸二乙胺和利多卡因標準品各100 mg，分別使用PBS 定容至50 mL，得到雙氯芬酸二乙胺和利多卡因標準品溶液母液(2 mg/mL)，并配置雙氯酚酸乙二胺(10、20、40、60、80、100 和200 μg/mL)和利多卡因(50、100、200、300、400 和500 μg/mL)的梯度標準品溶液。使用酶標儀分別在波長300 和294 nm 處讀取雙氯芬酸二乙胺和利多卡因梯度標準品溶液以及0～24 h 的滲透液OD 值。根據OD 值和藥物梯度繪制標準曲線，并計算藥物質量濃度。

1.5.2高效液相色譜法檢測

因水楊酸溶液在水中的溶解度較低，故其質量濃度采用靈敏度更高的高效液相色譜法檢測。試驗條件為：色譜柱Hypersil BDS C18(3.9 mm×150 mm，5 μm)；流動相為甲醇—水—冰醋酸；檢測波長300 nm；流速0.8 mL/min；進樣量20 μL。測定峰面積后，以質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，得到標準曲線方程，并計算水楊酸溶液滲透0～24 h 的藥物質量濃度。

1.6 數據統計與分析

使用SPSS 軟件對數據進行統計分析，2 組間比較采用t檢驗，3 組以上采用單因素方差分析，結果均以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 豬皮膚與人皮膚組織學比較

HE 染色和Masson 染色結果(圖1a)顯示：豬皮膚和人皮膚的分層相同，均由角質層、表皮層和真皮層構成，但人乳房皮膚的角質層比較疏松，豬皮膚的角質層比較致密。豬皮膚表皮層極顯著厚于人皮膚表皮層，其真皮層極顯著薄于人皮膚真皮層(P＜0.01，圖1b)。2 種皮膚的真皮層均由大量的膠原纖維和彈性纖維以及細胞成分較少的致密結締組織構成，真皮層可見血管叢分布，但與豬皮膚相比，人皮膚的膠原纖維和彈力纖維較粗壯(圖1a)。在電鏡下，人和豬的皮膚組織均可見角質層、表皮層及真皮層，其中，表皮層細胞種類豐富，可見顆粒層細胞、棘層細胞、基底細胞和黑色素細胞(圖2、3)。以上結果表明豬皮膚與人皮膚組織結構相似，但厚度上有差別。

圖1 人皮膚和豬皮膚組織形態(tài)(a)和厚度(b)Fig.1 Histomorphology (a) and thickness (b) of human and pig skins

圖2 人皮膚組織透射電鏡圖像Fig.2 Transmission electron microscope image of human skin tissue

圖3 豬皮膚組織透射電鏡圖像Fig.3 Transmission electron microscope image of pig skin tissue

2.2 版納微型豬不同部位的皮膚厚度

由圖4 可知：在測定的4 個部位皮膚中，肩胛部皮膚最厚，臀部皮膚次之，背部和腹部皮膚較薄。由于腹部取皮容易導致豬傷口感染，故選擇采集背部皮膚進行皮膚滲透試驗。

圖4 版納微型豬近交系不同身體部位的皮膚厚度Fig.4 Skin thickness in different body parts of Banna miniature pig inbred lines

2.3 豬皮膚和人皮膚的滲透性

滲透0～24 h 內，各時間點豬皮膚和人皮膚滲透液中的水楊酸質量濃度均無顯著差異(圖5a～b)；滲透的第1 和2 小時，人皮膚擴散池中的雙氯酚酸二乙胺質量濃度顯著高于豬皮膚擴散池(P＜0.05)，其余時間點2 組擴散池中的雙氯酚酸二乙胺質量濃度均無顯著差異(P＞0.05) (圖5c～d)；滲透0～24 h 內，各時間點豬皮膚和人皮膚擴散池中的利多卡因質量濃度均無顯著差異(P＞0.05) (圖5e～f)。人皮膚與豬皮膚透過的水楊酸、雙氯酚酸二乙胺和利多卡因質量濃度隨著滲透時間的延長而升高，表明3 種藥物的緩慢和穩(wěn)定釋放。此外，在滲透試驗的0～24 h，大部分時間點人皮膚與豬皮膚的水楊酸、雙氯酚酸二乙胺和利多卡因的質量濃度均無顯著差異，表明3 種藥物在2 種皮膚的滲透性較為相似，可作為評價鎮(zhèn)痛類經皮滲透藥物的皮膚模型。

3 討論

經皮給藥系統是目前除了口服給藥和靜脈注射給藥的第三大給藥系統[8-9]。鎮(zhèn)痛類經皮吸收藥物屬于作用于全身的藥物，外用藥物必須經過皮膚吸收進入循環(huán)并在體液中達到一定濃度后才能發(fā)揮療效，因此，需要保證藥物能夠滲透皮膚，并且持續(xù)、緩慢的釋放。使用離體皮膚滲透試驗評估經皮藥物的吸收性是其開發(fā)過程的重要環(huán)節(jié)之一。然而，可用于科研的人類皮膚嚴重短缺，選擇與人體皮膚滲透性接近的動物皮膚模型尤為重要。目前，在國際上已經將哥廷根小型豬和尤卡坦小型豬皮膚用于放射性治療評估、藥物透皮吸收效果評價[9]和局部應用藥物的毒性篩選[10]等多個領域，但是中國云南省特有的版納微型豬近交系尚未廣泛應用于該領域。為促進云南省特有版納微型豬近交系的實驗動物化，本研究利用版納微型豬近交系皮膚和人皮膚開展水楊酸溶液、利多卡因凝膠貼膏以及雙氯芬酸鈉二乙胺乳膏的體外滲透試驗，比較豬皮膚與人皮膚在鎮(zhèn)痛類經皮吸收藥物滲透性的相似性。

本研究比較了版納微型豬近交系和人皮膚的組織結構。人皮膚材料大部分來源于外科整形手術，多為腹部、乳房和背部皮膚，或是來源于捐獻的遺體[11-12]。本研究表明：豬皮膚由角質層、表皮層和真皮層組成，與報道的人類皮膚分層[13-14]一致。可能由于人乳房皮膚組織來自年老個體，11 月齡版納微型豬近交系豬乳房皮膚的角質層較人乳房皮膚角質層更薄、更致密，人乳房皮膚角質層較為疏松。本研究還顯示：豬與人皮膚的厚度有一定差異，豬皮膚表皮層較人的表皮層厚、真皮層較人的真皮層??；豬皮膚中黑色素細胞較人皮膚中黑色素細胞多，與已有研究結果[15]一致。

為了選取合適的取皮部位，本研究通過游標卡尺和組織切片顯微鏡測量法對4 個部位的豬皮膚進行了厚度測量，結果顯示：肩胛部皮膚最厚，臀部皮膚次之，背部和腹部皮膚較薄，可選擇背部和側腹部為供皮部位。由于豬習慣躺臥，切取側腹部皮膚容易導致豬傷口感染，本研究選取了背部皮膚進行藥物滲透試驗。不同物種的皮膚組織結構具有差異，皮膚來源的異質性是一個限制條件，不可完全避免。盡管豬皮膚和人皮膚的取樣部位不同，但本研究結果顯示：豬背部皮膚對水楊酸和利多卡因的滲透性與人類的乳房皮膚相似，與已有研究[16]具有相同的規(guī)律。在進行水楊酸溶液滲透時，先用3%月桂氮卓酮對豬皮膚和人皮膚促滲1 h，可使皮膚角質層細胞的排列變得疏松，提高皮膚的通透性[17-18]，使擴散池下室的藥物質量濃度可檢測到，此步驟對試驗具有重要意義，提示在經皮吸收藥物的劑型設計中添加促滲劑具有重要作用[19]。此外，在水楊酸溶液滲透試驗的第24 小時，組內3 個樣本的藥物質量濃度差異較大，可能是由于滲透試驗持續(xù)時間較長，液體揮發(fā)所致；相比之下，利多卡因凝膠貼膏未出現該現象，表明劑型穩(wěn)定性對外用藥物吸收具有重要意義。

在雙氯酚酸二乙氨乳膏的滲透試驗中，相同滲透時間下人皮膚藥物滲透量比豬皮膚稍高，其原因可能與角質層、皮膚厚度、年齡、毛囊數量結構、滲透阻力和取樣部位等有關[20]。本研究中，所用人體皮膚是中老年皮膚，其角質層較為疏松；而豬皮膚來自青年豬，其角質層較為致密，且豬皮膚的表皮層顯著厚于人皮膚表皮層，所以豬皮膚的滲透阻力略大于人皮膚的滲透阻力，這可能是導致人皮膚藥物滲透量比豬皮膚藥物滲透量高的原因之一。此外，豬皮膚的毛囊深度更深，其表面的被毛成簇分布，所采集皮膚的毛囊和毛孔大小不相同，其皮膚組成也會發(fā)生變化，進而影響滲透效果，提示在藥物滲透性試驗研究中應盡量選擇皮膚較薄的部位。

4 結論

版納微型豬近交系皮膚和人皮膚的組織學形態(tài)和細胞構成相似，但厚度稍有差異，應盡量選擇皮膚較薄的部位皮膚開展試驗。水楊酸溶液、雙氯酚酸二乙胺乳膏以及利多卡因凝膠貼膏在2 種皮膚中的滲透性相似，表明版納微型豬近交系皮膚可作為人皮膚的替代品，用于鎮(zhèn)痛類經皮吸收藥物的體外滲透性評估。本研究為版納微型豬近交系用于鎮(zhèn)痛類經皮吸收藥物評估提供了理論依據。