內(nèi)分泌腫瘤分子診斷平臺(tái)的建立和應(yīng)用

葉 蕾， 王衛(wèi)慶

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科 上海市內(nèi)分泌代謝病研究所國(guó)家代謝性疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心（上海） 國(guó)家衛(wèi)健委內(nèi)分泌代謝病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海市內(nèi)分泌腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200025）

分子診斷是指應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測(cè)個(gè)體遺傳物質(zhì)的變異實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的診斷，是檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用的重要專業(yè)領(lǐng)域，其廣泛應(yīng)用極大推動(dòng)了臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展。內(nèi)分泌腫瘤是一大類累及內(nèi)分泌腺體和細(xì)胞的腫瘤，患者面臨腫瘤與激素分泌雙重威脅， 致病基因變異是內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要發(fā)病機(jī)制。 不同基因變異直接決定了腫瘤的生物學(xué)行為、治療反應(yīng)與長(zhǎng)期預(yù)后。因此，內(nèi)分泌腫瘤診治的關(guān)鍵，過(guò)去在于激素分泌的精確評(píng)估， 而在分子診斷越來(lái)越深入臨床實(shí)踐的今天，則是激素分泌評(píng)估聯(lián)合分子診斷[1]。

內(nèi)分泌腫瘤致病基因的發(fā)現(xiàn)

與其他腫瘤和遺傳病一樣，分子生物學(xué)技術(shù)尤其是遺傳學(xué)技術(shù)的進(jìn)展促成了內(nèi)分泌腫瘤致病基因的發(fā)現(xiàn)。 以多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病2 型（multiple endocrine neoplasia type 2，MEN2）為例，早在1985 年人們通過(guò)轉(zhuǎn)染淋巴瘤DNA 至NIH3T3 細(xì)胞， 發(fā)現(xiàn)了RET（rearrangement during transfection）基因[1]。但在1993 年之前， 只能通過(guò)定位克隆的方法將MEN2 的致病基因定位在10q11.2 約480 kb 的范圍，1993 年由來(lái)自英國(guó)劍橋大學(xué)的Ponder 教授團(tuán)隊(duì)通過(guò)PCR 聯(lián)合化學(xué)切割錯(cuò)配 （chemical cleavage of mismatch, CCM）的方法成功確認(rèn)RET點(diǎn)突變導(dǎo)致MEN2[2]。 類似的方法促成了一系列重要內(nèi)分泌腫瘤致病基因的發(fā)現(xiàn)， 比如1997 年發(fā)現(xiàn)胚系MEN1基因失活變異導(dǎo)致MEN1，以及GNAS、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphae，cAMP）依賴性蛋白激酶調(diào)節(jié)亞基1α （cAMP-dependent protein kinase regulatory type Ⅰ-alpha，PRKAR1A）、VHL（von Hippel-Lindau）、 神經(jīng)纖維瘤病1 型（neurofibromatosis type1,NF1） 與琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase,SDH） 等基因突變是內(nèi)分泌腫瘤的重要病因。 十余年前由于高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，迎來(lái)了第2 次內(nèi)分泌腫瘤致病基因發(fā)現(xiàn)高峰，比如腎上腺庫(kù)欣腺瘤的致病基因PRKACA、 原發(fā)性醛固酮增多癥的致病基因內(nèi)向整流型鉀離子通道亞家族J 成員5 （potassium inwardly-rectifying channel,subfamily J, member 5，KCNJ5）、胰島素瘤的致病基因轉(zhuǎn)錄因子（Yin Yang 1，YY1），以及腎上腺雙側(cè)大結(jié)節(jié)樣增生的致病基因犰狳重復(fù)序列5（armadillo repeat containing 5,ARMC5）等[3]。 目前大多數(shù)內(nèi)分泌腫瘤的致病基因已經(jīng)明確，這使得臨床的病因診斷成為可能。

分子診斷的臨床意義

檢測(cè)上述內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵致病基因，不僅可以協(xié)助疾病早診斷、早治療，還可以指導(dǎo)疾病分層與預(yù)后管理，以及作為伴隨診斷指導(dǎo)藥物治療。 例如胚系RET原癌基因突變是遺傳性甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid cancer, MTC）的分子基礎(chǔ)，RET胚系致病突變患者M(jìn)TC 的外顯率幾乎為100%。 同時(shí)，RET基因型與MTC 危險(xiǎn)等級(jí)之間存在較強(qiáng)的基因型-表型相關(guān)關(guān)系， 不同危險(xiǎn)等級(jí)的患者M(jìn)TC 的發(fā)病年齡、腫瘤分期、復(fù)發(fā)與長(zhǎng)期生存率具有明顯差異。 胚系RET原癌基因突變檢測(cè)有助于遺傳性MTC 及MEN2 的診斷，MTC 危險(xiǎn)等級(jí)的判定，術(shù)前臨床腫瘤范圍的全面評(píng)估，并指導(dǎo)臨床醫(yī)師決定手術(shù)次序； 家系成員RET基因胚系突變篩查，可實(shí)現(xiàn)MTC 的早期診療[4]。其中，對(duì)于家系中RET基因突變陽(yáng)性者， 應(yīng)定期隨訪以早期發(fā)現(xiàn)并診治，同時(shí)可考慮預(yù)防性甲狀腺切除術(shù)；對(duì)于有生育需求者， 胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查使得育齡期患者能夠避免RET突變?cè)诩蚁抵械膫鬟f[4]。 而針對(duì)于RET的靶向治療， 包括近年研發(fā)的選擇性RET抑制劑如塞普替尼（selpercatinib）和普拉替尼（pralsetinib）， 有望為晚期進(jìn)展性MTC 提供有效的治療機(jī)會(huì)[5]。

目前， 多個(gè)國(guó)內(nèi)外權(quán)威指南推薦進(jìn)行內(nèi)分泌腫瘤相關(guān)致病基因檢測(cè)，比如2014 年嗜鉻細(xì)胞瘤診治指南（美國(guó)內(nèi)分泌學(xué)會(huì)）推薦所有嗜鉻細(xì)胞瘤患者應(yīng)該考慮進(jìn)行基因檢測(cè)，可用臨床特征驅(qū)動(dòng)的診斷流程決定優(yōu)先選擇特定的基因檢測(cè)，副神經(jīng)節(jié)瘤患者進(jìn)行SDH突變檢測(cè)，轉(zhuǎn)移患者進(jìn)行SDHB基因突變檢測(cè)[6]；《中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤診治指南（2022 年版）》推薦檢測(cè)遺傳腫瘤綜合征的致病基因以協(xié)助此類疾病的診斷[7]；《甲狀腺髓樣癌診斷與治療中國(guó)專家共識(shí)（2020 版）》推薦MTC 患者等5 類人群進(jìn)行RET基因篩查和遺傳咨詢[8]。

實(shí)驗(yàn)室要求

臨床分子檢測(cè)應(yīng)遵循《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室》等要求完成。 分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)特別是高通量測(cè)序的操作步驟多、程序復(fù)雜，濕實(shí)驗(yàn)包括樣本處理（取材與運(yùn)輸和核酸提?。?，文庫(kù)構(gòu)建、靶向序列富集與測(cè)序等； 干實(shí)驗(yàn)包括測(cè)序后數(shù)據(jù)質(zhì)量分析、比對(duì)、變異識(shí)別、注釋和結(jié)果報(bào)告與解釋等生物信息學(xué)分析流程。 分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室各功能區(qū)需有嚴(yán)格有序的物理分隔及持續(xù)的通風(fēng)換氣，以避免核酸氣溶膠引起的交叉污染，還需注意各功能區(qū)物品專用、各功能區(qū)域的單一工作流向等；分子檢測(cè)各環(huán)節(jié)必須制定可操作性的標(biāo)準(zhǔn)操作程序并嚴(yán)格遵循，進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，包括核酸質(zhì)量、測(cè)序結(jié)果的覆蓋深度、均一性、在靶率等。臨床分子檢測(cè)還應(yīng)根據(jù)臨床預(yù)期用途，進(jìn)行性能確認(rèn)，包括準(zhǔn)確性、精密度、檢測(cè)限等。 腫瘤變異的報(bào)告及解釋?xiě)?yīng)遵循標(biāo)準(zhǔn)指南， 如美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG）2015 年遺傳性變異解讀指南， 判讀該變異為致病性變異、可能致病性變異、臨床意義未明、可能良性與良性變異[9]；以及2017 年體細(xì)胞變異解讀指南（2017 版），從臨床診斷、預(yù)后、治療等方面進(jìn)行評(píng)估，將變異分為強(qiáng)臨床意義、潛在臨床意義、臨床意義不明、良性4 類[10]。

與內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因種類繁多，且遺傳性內(nèi)分泌腫瘤臨床癥狀常表現(xiàn)為綜合征的形式，各種遺傳性內(nèi)分泌腫瘤綜合征的癥狀互有重疊。因此對(duì)單基因突變的檢查不能很好地滿足對(duì)內(nèi)分泌腫瘤的高效率基因診斷。目前針對(duì)內(nèi)分泌腫瘤尚無(wú)靶向測(cè)序panel，且已有的廣譜腫瘤診斷panel 不能很好地覆蓋內(nèi)分泌腫瘤的高頻率突變基因。為了更有效地服務(wù)于內(nèi)分泌腫瘤的臨床診治，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院（瑞金醫(yī)院）內(nèi)分泌代謝科自建神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤基因突變檢測(cè)方法[11]，可以明確38.1%神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者分子分型。 基因檢測(cè)適用于內(nèi)分泌腫瘤的診斷和分子分型，適用樣本包括外周血樣本、新鮮組織樣本，亦適用于靶向藥治療方案選擇指導(dǎo)。

瑞金醫(yī)院內(nèi)分泌腫瘤特色

瑞金醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科于20 世紀(jì)50 年代成功診治國(guó)內(nèi)第1 例原發(fā)性醛固酮增多癥，2003 年報(bào)道了國(guó)內(nèi)第1 例基因診斷明確的MEN2[12]。 以此為基礎(chǔ)，逐步建立基因檢測(cè)平臺(tái)，協(xié)助內(nèi)分泌腫瘤的臨床診療，2007 年成功建立科學(xué)完備的程式化基因診斷平臺(tái)。 2008 年“單基因遺傳性內(nèi)分泌疾病的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用”獲得國(guó)家科技進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)。 2010 年后利用高通量測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)多種致病新基因與分子標(biāo)志物，包括發(fā)現(xiàn)65.5%腎上腺庫(kù)欣腺瘤存在PRKACAL205R熱點(diǎn)突變， 突變型腫瘤體積小、分泌能力強(qiáng)、StAR表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性[13]；報(bào)道30%胰島細(xì)胞瘤存在YY1T372R位點(diǎn)突變， 突變型起病年齡大[14]；發(fā)現(xiàn)24.3%甲狀腺腺瘤樣結(jié)節(jié)存在SPOPP94R/EZH1Q571R/ZNF148特異基因變異， 為良性結(jié)節(jié)分子標(biāo)志物[15]；循證證實(shí)人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2） 表達(dá)可預(yù)測(cè)嗜鉻細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移，預(yù)測(cè)率達(dá)77%[16]。 2017 年“內(nèi)分泌腫瘤發(fā)病機(jī)制新發(fā)現(xiàn)與臨床診治技術(shù)的建立和應(yīng)用”獲得國(guó)家科技進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)。目前已建立國(guó)際單中心最大的多個(gè)基因型明確的疾病隊(duì)列，如多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病，嗜鉻細(xì)胞瘤，原發(fā)性醛固酮增多癥、原發(fā)性雙側(cè)大結(jié)節(jié)樣腎上腺增生癥，先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥等。 提出疾病預(yù)后與治療反應(yīng)的基因型特征，如KCNJ5突變型腺瘤型原發(fā)性醛固酮增多癥手術(shù)效果好[17]。 目前分子診斷平臺(tái)通過(guò)內(nèi)分泌疑難病例報(bào)告系統(tǒng)向全國(guó)通道開(kāi)放，可通過(guò)上海市內(nèi)分泌代謝病研究所微信公眾號(hào)“疑難病例”模塊注冊(cè)登錄，已向全國(guó)30 余家單位提供相關(guān)基因檢測(cè)服務(wù)。