李欣雨,孟毅,賀寶元,周妍,魏怡,連嚴(yán)慧,張磊,土雙靜,薛海燕
(1.陜西科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,西安 710021;2.陜西科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院,西安 710021;3. 陜西金牛乳業(yè)有限公司,陜西 渭南 714000)
羊乳成分被公認(rèn)為最接近人乳[1],因其自身超高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的風(fēng)味被譽(yù)為“奶中之王”[2],因此羊乳成為了嬰幼兒配方奶粉的良好原料[3]。要實(shí)現(xiàn)羊乳成分的母乳化調(diào)配通常需要降低羊乳總蛋白的含量,減少酪蛋白增加乳清蛋白以此來(lái)改善二者比例,所以羊乳中分離酪蛋白是組分化生產(chǎn)羊乳的關(guān)鍵[4]。目前,分離酪蛋白最常見(jiàn)的方法為酶法沉淀和酸法沉淀,但酶法和酸法分離酪蛋白容易受到pH 和溫度的影響,使得酪蛋白的持水性較差,鹽離子濃度的增加也會(huì)減弱酪蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性[5]。膜分離技術(shù)是在分子水平上不同粒徑分子的混合物在透過(guò)半透膜時(shí),實(shí)現(xiàn)選擇性分離的技術(shù)[6]。膜分離技術(shù)是物理過(guò)程,所以具有能耗低、效率高、操作條件溫和、對(duì)熱和酸的敏感性較低等優(yōu)點(diǎn),適合于處理熱敏物質(zhì)[7]。通過(guò)膜分離技術(shù)制備的酪蛋白膠束粉的天然結(jié)構(gòu)不會(huì)被破壞,溶解度更好,同時(shí)乳清粉的變性程度也較低[8]。利用膜分離技術(shù)生產(chǎn)的羊乳清粉,其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,功能性優(yōu)良,可廣泛用于嬰幼兒配方奶粉、功能性食品等領(lǐng)域[9],截留液中的酪蛋白也可用于生產(chǎn)干酪制品。
國(guó)內(nèi),張雨萌等[10]通過(guò)膜分離建立了牛羊乳酪蛋白和乳清蛋白的分離效果對(duì)比研究;李志賓等[11]利用膜分離提取牛乳中乳清蛋白,在一定程度上保護(hù)了乳清蛋白中的生物活性成分;陳建行等[12]通過(guò)比較100 nm和40 nm 孔徑的陶瓷膜對(duì)酪蛋白和乳清蛋白的分離效果,發(fā)現(xiàn)40 nm 孔徑的陶瓷膜能夠更好得到清澈透明的乳清。ZULEWSKA J 等[13]在50 ℃的條件下得出,聚合物膜與陶瓷膜相比對(duì)血清蛋白的截留率更高;HURT E 等[14]在50 ℃條件下將牛乳用陶瓷膜恒壓微濾,使得乳清蛋白的脫除率達(dá)到98.3%[15],而目前有關(guān)羊乳的膜分離技術(shù)研究還較少。
本研究采用不同孔徑的中空纖維膜和卷式有機(jī)膜對(duì)脫脂羊乳進(jìn)行分離,其中截留液可用于制作酪蛋白膠束粉或者干酪產(chǎn)品,滲透液則可用于制備高品質(zhì)的乳清蛋白產(chǎn)品[15]。對(duì)微濾過(guò)程中膜通量、料液組分構(gòu)成、pH 值、電導(dǎo)率值、顏色、脫除率和膜的污染與清洗等方面進(jìn)行分析,評(píng)估量化膜截留酪蛋白的能力。并對(duì)透過(guò)液和截留液分別進(jìn)行濃縮、噴霧干燥,期望能夠獲得純度較高的酪蛋白膠束粉,為工業(yè)化生產(chǎn)羊乳基料提供依據(jù)。
新鮮液態(tài)羊乳,陜西金牛乳業(yè)有限公司;小牛皺胃酶,上海源葉生物科技有限公司;濃鹽酸(分析純),南昌市昌九化工廠;無(wú)水氯化鈣,天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS),美國(guó)Amersham 公司;β-巰基乙醇,普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司;N,N,N',N'-四甲基乙二胺,上海源葉生物科技有限公司;考馬斯亮藍(lán)R-250,加拿大Bio Basic 公司;濃鹽酸,北京化學(xué)試劑廠;冰醋酸,廣州化學(xué)試劑廠;無(wú)水硫酸鉀,天津科密歐公司;無(wú)水硫酸銅,天津天力化學(xué)試劑公司;四甲基乙二胺(TEMED),美國(guó)Sigma 公司。
高速冷凍離心機(jī)(HC-3018R),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;電導(dǎo)率儀,上海般特儀器制造有限公司;pH 計(jì)(PB-10),賽托利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;卷式有機(jī)膜過(guò)濾裝置,同舟縱橫(廈門)流體有限公司;中空纖維素膜,美國(guó)通用電氣公司;移液槍(Transferpette),德國(guó)BRAND 公司;蛋白質(zhì)電泳儀,南京新校園生物技術(shù)研究所;穩(wěn)壓電源,鴻寶電氣股份有限公司;半自動(dòng)凱式定氮儀(KN780),阿爾瓦儀器有限公司。
1.3.1 膜過(guò)濾操作、樣品pH 值和電導(dǎo)率的測(cè)定
1.3.1.1 膜參數(shù)及切向流過(guò)濾原理
膜基本參數(shù)如表1 所示。
表1 膜基本參數(shù)
切向流過(guò)濾與直流過(guò)濾原理不同,其原理如圖1所示,過(guò)濾速度能在相對(duì)長(zhǎng)的一段時(shí)間里保持在一個(gè)較高的水平,可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)化運(yùn)行,工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程主要使用切向流過(guò)濾。
圖1 切向流
1.3.1.2 中空纖維膜過(guò)濾操作流程
首先將800 mL 脫脂鮮羊乳加入物料罐中,打開電源后開泵,設(shè)備運(yùn)行30 s 后調(diào)節(jié)進(jìn)口壓力閥(137.9 kPa),設(shè)備繼續(xù)運(yùn)行1 min 平穩(wěn)后開始計(jì)時(shí)收集所需樣品。在透過(guò)液管下端放置第一個(gè)燒杯收集透過(guò)液1 min,之后每間隔2 min 更換燒杯收集1 min,將收集液按順序進(jìn)行編號(hào)1.2.3……。每個(gè)時(shí)段收集結(jié)束,立即測(cè)定每一個(gè)燒杯中透過(guò)液的體積、pH 和電導(dǎo)率,同時(shí)再將每個(gè)燒杯中的透過(guò)液混勻以觀察顏色。物料罐中的膜上截留液回流至物料罐混合均勻后立即測(cè)定pH 和電導(dǎo)率,測(cè)定后立即倒回物料罐混勻,每2 min 循環(huán)一次。循環(huán)操作直至物料罐中樣品達(dá)到物料罐最小容納體積量(200 mL)時(shí)關(guān)泵。
1.3.1.3 卷式有機(jī)膜過(guò)濾操作流程
首先將4 000 mL 脫脂鮮羊乳加入物料罐中,打開電源后開泵,設(shè)備運(yùn)行30 s 后調(diào)節(jié)進(jìn)口壓力閥(25 kPa),設(shè)備繼續(xù)運(yùn)行1 min 平穩(wěn)后開始計(jì)時(shí)收集所需樣品。在透過(guò)液管下端放置第一個(gè)燒杯收集透過(guò)液1 min,之后每間隔2 min 更換燒杯收集1 min,將收集液按順序進(jìn)行編號(hào)1.2.3……。每個(gè)時(shí)段收集結(jié)束,立即測(cè)定每一個(gè)燒杯中透過(guò)液的體積、pH 和電導(dǎo)率,同時(shí)再將每個(gè)燒杯中的透過(guò)液混勻以觀察顏色。物料罐中的膜上截留液回流至物料罐混合均勻后立即測(cè)定pH 和電導(dǎo)率,測(cè)定后立即倒回物料罐混勻,每2 min 循環(huán)一次。循環(huán)操作直至物料罐中樣品達(dá)到物料罐最小容納體積量(200 mL)時(shí)關(guān)泵。
利用pH 計(jì)和電導(dǎo)率儀直接測(cè)量各溶液的pH 和電導(dǎo)率,使用前分別在室溫下進(jìn)行儀器校正。
1.3.2 料液蛋白質(zhì)含量分析
采用凱式定氮法,對(duì)脫脂乳、截留液和滲透液中的總氮、非蛋白氮和非酪蛋白氮含量進(jìn)行測(cè)定??偟繀⒄瘴墨I(xiàn)[16]測(cè)定,此方法測(cè)定的值包括蛋白氮和非蛋白氮;按照GB/T21704—2008《乳與乳制品中非蛋白氮含量的測(cè)定》方法測(cè)定非蛋白氮含量[17];按照王宜生[18]方法對(duì)非酪蛋白氮含量進(jìn)行測(cè)定。按式(1)~(4)計(jì)算各蛋白含量:
1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)蛋白質(zhì)鑒定與分析
利用凝膠電泳測(cè)定各個(gè)階段的截留液和透過(guò)液中蛋白質(zhì)類型及大致含量。分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5%,將截留液(稀釋10 倍)、透過(guò)液和脫脂乳(稀釋5 倍),按照1∶1 的比例加入2×SDS 裂解液,搖勻后于恒溫器95 ℃加熱1 min,離心后取10 μL 點(diǎn)樣,電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)對(duì)凝膠進(jìn)行染色,脫色至膠背景透明用凝膠成像儀進(jìn)行拍攝。
1.3.4 膜通量、濃縮倍數(shù)與脫除率的計(jì)算、膜的污染與清洗
膜通量的計(jì)算公式:
式中:F為膜通量,L/(m2·h);V為滲透液的體積,L;J為膜面積,m2;t為過(guò)濾時(shí)間,h。
濃縮倍數(shù)的計(jì)算公式:
式中:M為脫脂羊乳的質(zhì)量,kg;m為過(guò)濾過(guò)程中某個(gè)時(shí)間滲透液的質(zhì)量,kg。
膜對(duì)乳清蛋白脫除率的計(jì)算公式:
式中:M1為滲透液中乳清蛋白的質(zhì)量,g;M2為脫脂乳中乳清蛋白的質(zhì)量,g。
膜對(duì)酪蛋白脫除率的計(jì)算公式:
式中:M1為截留液中酪蛋白的質(zhì)量,g;M2為脫脂乳中酪蛋白的質(zhì)量,g。
純水通量衰減系數(shù)(WFD),可衡量膜的污染程度,值越大表示膜污染程度越高。
式中:J0和Jt分別為膜過(guò)濾前及過(guò)濾后只用水清洗一次后的純水通量,L·m-2·h-1。
純水通量恢復(fù)系數(shù)(WFR),用于衡量膜的清洗效果。
式中:JQ和J0分別表示膜過(guò)濾前和清洗后的純水通量,L·m-2·h-1。
各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3 次,結(jié)果表示為±s。利用SPSS 18.5 和Origin Pro 9.1 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理與繪圖分析。采用方差分析法進(jìn)行差異顯著性比較。
2.1.1 不同孔徑中空纖維膜所得透過(guò)液外觀比較
為了充分對(duì)比3 種孔徑中空纖維膜對(duì)脫脂乳中乳蛋白的分離效果,試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)這幾種膜所得滲透液進(jìn)行了外觀對(duì)比。由圖2 可知,100、300 ku 和750 ku中空纖維膜滲透液分別呈清澈透明的黃綠色、輕微白色混濁和嚴(yán)重白色混濁,滲透液呈現(xiàn)黃綠色是含有VB 的緣故,ZULEWSKA J 等[19]研究發(fā)現(xiàn)透過(guò)液中的白色渾濁是由于部分酪蛋白發(fā)生滲透所造成的。
圖2 不同孔徑中空纖維膜所得透過(guò)液外觀
2.1.2 不同孔徑中空纖維膜羊乳蛋白分離效果定性分析
由圖3 可以看出,100、300、750 ku 這3 種孔徑的中空纖維膜對(duì)酪蛋白和乳清蛋白的分離效果是不同的,其中100 ku 的膜在過(guò)濾后酪蛋白和乳清蛋白均被截留,透過(guò)液中不含乳清蛋白,表明該孔徑并沒(méi)有將其分離,只是進(jìn)行了濃縮;300 ku 的膜在過(guò)濾后可以看出有少量的乳清蛋白存在于透過(guò)液中,同時(shí)截留液中依然存在部分乳清蛋白,表明酪蛋白和乳清蛋白并未完全分開;750 ku 的膜可以將酪蛋白和乳清蛋白有效地分離,大部分的乳清蛋白均被透過(guò),只有極少部分的乳清蛋白存于截留液中,表明該孔徑的膜過(guò)濾效果較好。綜上所述,750 ku 的中空纖維膜能夠有效地將酪蛋白和乳清蛋白分離。
圖3 中空纖維膜乳蛋白分離SDS-PAGE
2.1.3 不同孔徑中空纖維膜羊乳蛋白分離效果定量分析
由表2 可以看出,隨著中空纖維膜孔徑的增大,酪蛋白占真蛋白的比例在截留液中有所增加,在透過(guò)液中減小;清蛋白占真蛋白的比例在截留液中減小,在透過(guò)液中增加。結(jié)合蛋白質(zhì)的電泳定性分析,實(shí)驗(yàn)選擇750 ku 的中空纖維膜可以兼顧截留酪蛋白和有效濾除乳清蛋白。
表2 3 種中空纖維膜乳蛋白分離樣品的蛋白質(zhì)含量
2.1.4 中空纖維膜截留液與透過(guò)液pH 和電導(dǎo)率的測(cè)定
由圖4(a)和(b)可知隨著時(shí)間的延長(zhǎng)截留液的pH升高,透過(guò)液的pH 降低。這是由于在過(guò)濾中H+透過(guò)膜進(jìn)到透過(guò)液中導(dǎo)致透過(guò)液pH 降低,截留液pH 增加。
圖4 中空纖維膜截留液與透過(guò)液pH、電導(dǎo)率隨過(guò)濾時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化
電導(dǎo)率能夠及時(shí)反映液體物料體系中電解質(zhì)的多寡,是動(dòng)態(tài)跟蹤膜過(guò)濾過(guò)程的良好指標(biāo)。由圖4 的(c)和(d)可知,截留液的電導(dǎo)率隨時(shí)間逐漸降低,而透過(guò)液的電導(dǎo)率則增大。這是由于在過(guò)濾中Na+、K+、P3-等離子透過(guò)膜進(jìn)到透過(guò)液中導(dǎo)致透過(guò)液電導(dǎo)率上升,截留液電導(dǎo)率下降。這與李啟明等[20]的研究結(jié)果一致,牛乳中的Na+、K+、Cl-等一價(jià)離子幾乎全部在乳清相中,呈可溶性狀態(tài)。
2.2.1 不同孔徑卷式有機(jī)膜所得透過(guò)液外觀比較
為了充分對(duì)比2 種孔徑卷式有機(jī)膜對(duì)脫脂乳中乳蛋白的分離效果,試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)這幾種膜所得滲透液進(jìn)行了外觀對(duì)比。由圖5 可知,0.1 μm 和0.45 μm 卷式有機(jī)膜滲透液呈清澈透明的黃綠色和輕微白色混濁的黃綠色,這說(shuō)明0.45 μm 膜過(guò)濾時(shí)有酪蛋白透過(guò)。
圖5 不同孔徑卷式有機(jī)膜所得透過(guò)液外觀
2.2.2 不同孔徑卷式有機(jī)膜羊乳蛋白分離效果定性分析
由圖6 所示,脫脂乳在0.1 μm 的卷式有機(jī)膜過(guò)濾后酪蛋白幾乎全部被截留,同時(shí)大部分的乳清蛋白均被透過(guò);0.45 μm 的膜過(guò)濾后,有一部分的酪蛋白進(jìn)到了透過(guò)液中,表明該孔徑的膜偏大。綜上所述,0.1 μm 孔徑的卷式有機(jī)膜能夠有效的將酪蛋白和乳清蛋白分離。
圖6 卷式有機(jī)膜乳蛋白分離SDS-PAGE
2.2.3 不同孔徑卷式有機(jī)膜羊乳蛋白分離效果定性分析
由表3 可知,當(dāng)卷式有機(jī)膜的孔徑增大時(shí),截留液中酪蛋白占真蛋白的比例增加,乳清蛋白占真蛋白的比例減??;透過(guò)液中酪蛋白占真蛋白的比例明顯增加,乳清蛋白占真蛋白的比例明顯減少。結(jié)果表明,0.1 μm 的膜可以有效截留酪蛋白并濾除乳清蛋白。
表3 2 種卷式有機(jī)膜乳蛋白分離樣品的蛋白質(zhì)含量
2.2.4 卷式有機(jī)膜截留液與透過(guò)液pH 和電導(dǎo)率的測(cè)定
如圖7(a)和(b)所示,隨著過(guò)濾時(shí)間的延長(zhǎng),截留液的pH 逐漸上升,透過(guò)液的pH 逐漸下降。截留液pH 在5.8~7.4 之間,透過(guò)液pH 在6.2~6.6 之間,變化趨勢(shì)較小,這是由于分離過(guò)程中離子變化導(dǎo)致的。
圖7 卷式有機(jī)膜截留液與透過(guò)液pH、電導(dǎo)率隨過(guò)濾時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化
如圖7(c)和(d)所示,截留液與透過(guò)液的電導(dǎo)率呈現(xiàn)相反的趨勢(shì),隨著分離時(shí)間的延長(zhǎng),截留液電導(dǎo)率逐漸降低,透過(guò)液電導(dǎo)率逐漸增加,截留液電導(dǎo)率在6.16~6.32 間進(jìn)行波動(dòng),透過(guò)液電導(dǎo)率在6.25~6.50間波動(dòng),兩者的變化浮動(dòng)都比較緩慢,0.45 μm 膜分離的截留液與透過(guò)液均略高于0.1 μm。電導(dǎo)率變化趨勢(shì)與中空纖維膜一致。
由于酪蛋白和乳清蛋白直徑有很大差異,因此可以通過(guò)膜技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分離。膜過(guò)濾過(guò)程中,隨著時(shí)間的推移,截留液中固形物含量和料液黏度不斷增加,膜表面濃差化現(xiàn)象加劇且膜過(guò)濾的阻力增加,導(dǎo)致膜通量下降[21]。由圖8 可知,100、300、750 ku 的中空纖維膜初始膜通量分別為25.6、26.4、21.97 L/(m2·h),使用后膜通量為9.2、10.1、10.9 L/(m2·h);0.1 μm 和0.45 μm 的卷式有機(jī)膜初始膜通量為29.5 L/(m2·h) 和42.9 L/(m2·h),使用后膜通量為20.1 L/(m2·h)和34.1 L/(m2·h)。卷式有機(jī)膜形成“二次膜”的速度小于中空纖維膜。由表2~3可知,750 ku 的中空纖維膜和0.1 μm 的卷式有機(jī)膜過(guò)濾效果較好。綜上所述,0.1 μm 的卷式有機(jī)膜即能有效地分離乳蛋白又能較慢的形成濾餅層。
圖8 中空纖維膜與卷式有機(jī)膜通量變化
在整個(gè)過(guò)濾過(guò)程中經(jīng)過(guò)不斷的稀釋,濾餅層逐漸形成,中空纖維膜和卷式有機(jī)膜的膜通量由最初的142、435 L/(m2·h)降至51.5、262.5 L/(m2·h),這是因?yàn)樵谀け砻嫘纬闪艘粚訛V餅,增加了滲透液體的阻力,說(shuō)明膜受到了一定程度的污染。稀釋過(guò)濾后對(duì)2 種膜分別進(jìn)行了1 mol/L NaOH 清洗、pH=3 磷酸清洗和0.3 %次氯酸鈉與NaOH 混合清洗。污染與清洗情況如表4 所示,由表4 數(shù)據(jù)可知750 ku 中空纖維膜的純水通量衰減系數(shù)(63.7%)大于0.1 μm 的卷式有機(jī)膜的純水通量衰減系數(shù)(39.7%),說(shuō)明在過(guò)濾過(guò)程中中空纖維膜的污染速度較快,污染程度較高。同時(shí)可以看出,以上的3 種清洗方法中,次氯酸鈉與NaOH 混合清洗后中空纖維膜的純水通量恢復(fù)系數(shù)為88.5%;卷式有機(jī)膜的純水通量恢復(fù)系數(shù)為97.1%,清洗效果優(yōu)于其他2 種清洗方法,膜通量得到了很好的恢復(fù)。綜上所述,0.1 μm 的卷式有機(jī)膜用次氯酸鈉與NaOH 混合的方法清洗膜通量恢復(fù)效果最佳。
表4 不同階段純水通量變化
由表5 可知,750 ku 中空纖維膜過(guò)濾后,透過(guò)液中羊乳酪蛋白脫除率為98.8 %,截留液中乳清蛋白脫除率為82.7 %;0.1 μm 卷式有機(jī)膜過(guò)濾后透過(guò)液中羊乳酪蛋白脫除率為99.6 %,截留液中清蛋白脫除率為82.7 %。與徐殊等[22]采用100 nm 陶瓷膜所分離酪蛋白和乳清蛋白相比,分離效果更佳。膜法分離能夠有效的截留酪蛋白,可用于奶酪的生產(chǎn)。透過(guò)液中清蛋白/酪蛋白的比值都大概為11,比原料乳中的0.22 提高了50 倍,該乳清蛋白與酪蛋白的比例滿足嬰幼兒配方奶粉的應(yīng)用要求。比較2 種膜分離過(guò)程中膜通量的變化來(lái)看,0.1 μm 卷式有機(jī)膜出現(xiàn)“二次膜”的速度較慢,污染程度更低,清洗后膜通量恢復(fù)率更大,表明其更易于清洗和恢復(fù)。與傳統(tǒng)的酶法和酸法提取酪蛋白相比,膜法所得的酪蛋白中不含殘留的凝乳酶、發(fā)酵劑、乳酸等,更加綠色環(huán)保,所以0.1 μm 卷式有機(jī)膜更適于工業(yè)化應(yīng)用。
表5 最佳膜分離效果比較
將2 種不同材質(zhì)的中空纖維膜(100、300、750 ku)與卷式有機(jī)膜(0.1 μm、0.45 μm)進(jìn)行比較分析后發(fā)現(xiàn),750 ku 中空纖維膜和0.1 μm 卷式有機(jī)膜既能將酪蛋白較好的截留,又能有效的將乳清蛋白透過(guò),2 種孔徑膜通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到的平均膜通量值分別是25.7 和25.2 L/(m2·h)。比較膜的污染與清洗結(jié)果,0.1 μm 卷式有機(jī)膜純水通量衰減系數(shù)(39.7%)小于750 ku 中空纖維膜系數(shù)(63.7%),說(shuō)明該卷式有機(jī)膜污染慢,污染程度低,通過(guò)3 種膜清洗方案比較,發(fā)現(xiàn)次氯酸鈉與NaOH 混合液清洗的效果最佳,使750 ku 中空纖維膜的水通量恢復(fù)系數(shù)達(dá)到88.5%,0.1 μm 卷式有機(jī)膜的純水通量恢復(fù)系數(shù)達(dá)到97.1%。綜上所述,0.1 μm 卷式有機(jī)膜是最適合分離乳蛋白的膜。