高效聚合抗赤霉病基因育種技術(shù)體系的研制

李式昭,鄧清燕,涂 洋,伍 玲

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南地區(qū)小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/糧油作物綠色種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部天府種業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(部省共建),成都 610066)

由禾谷鐮刀菌復(fù)合種(Fusariumgraminearumcomplex)引起的小麥赤霉病(Fusariumheadblight, FHB)是一種世界性真菌病害,在我國廣泛分布于溫暖潮濕或半潮濕麥區(qū)[1]。21世紀(jì)以來,隨著全球性氣候變暖,耕作制度的改變?nèi)琨湹尽Ⅺ溣褫喿骱徒斩掃€田等因素的影響[2],赤霉病呈蔓延擴(kuò)展趨勢,頻繁流行,不僅造成小麥大面積減產(chǎn),還大幅度降低籽粒品質(zhì),嚴(yán)重威脅我國小麥生產(chǎn)安全[3]。與此同時(shí),致病菌還產(chǎn)生雪腐鐮孢菌烯醇(Nivalenol,NIV)、脫氧雪腐鐮孢菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)等毒素污染小麥籽粒,進(jìn)一步威脅人、畜健康[4]。因此,挖掘抗病基因,解析抗病作用機(jī)理,改良品種赤霉病抗性就成為了防治小麥赤霉病危害的有效途徑[5]。

小麥對赤霉病的抗性有五種類型,包括抗初始侵入(Type Ⅰ)、抗單穗病癥擴(kuò)展(Type Ⅱ)、抗毒素積累(Type Ⅲ)、籽粒對赤霉病的抗性(Type Ⅳ)和耐病性(Type Ⅴ)[6],屬數(shù)量性狀,受多基因控制。目前已定位的小麥赤霉病抗病QTL數(shù)量高達(dá)數(shù)百個(gè),廣泛分布于小麥的21條染色體上[7-8],正式命名的主效抗病基因有7個(gè),其中Fhb4和Fhb5屬抗侵染類型,Fhb1、Fhb2、Fhb3、Fhb6和Fhb7則屬抗擴(kuò)展類型。Fhb1、Fhb2、Fhb4和Fhb5源自普通小麥蘇麥3號及望水白,Fhb3、Fhb6和Fhb7則源自小麥近緣屬種中的大賴草、披堿草及長穗偃麥草[9-15]。7個(gè)主效抗赤霉病基因中,Fhb1是抗性最強(qiáng)且最穩(wěn)定的抗病基因,對我國抗赤霉病育種有著重要意義[16]。

我國長江中下游麥區(qū)、東北春麥區(qū)和南部沿海省份等雨量充沛地區(qū)一直是赤霉病常發(fā)和重發(fā)區(qū)域。近年來,西南麥區(qū)受耕作制度改變及小麥花期暖濕陰雨氣候等影響,赤霉病也開始呈現(xiàn)逐年加重的趨勢。由于西南麥區(qū)屬赤霉病偶發(fā)病區(qū),有針對性的抗赤霉病育種研究還較少,不僅缺乏抗赤霉病育種資源材料,本地育成品種的赤霉病抗性也普遍較差[17]。因此,建立高效聚合抗赤霉病基因的育種技術(shù)體系,快速選育適合當(dāng)?shù)丨h(huán)境的抗赤霉病小麥新品種就成為當(dāng)前西南麥區(qū)的迫切需求。本文使用改良農(nóng)藝性狀后的抗赤霉病種質(zhì)與西南麥區(qū)主栽品種雜交或復(fù)交,在低世代分離群體進(jìn)行抗赤霉病性彌霧接種鑒定,高世代群體采用單花滴注法接種鑒定,并利用抗赤霉病基因標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種,以提高西南麥區(qū)小麥抗赤霉病育種效率。該技術(shù)體系規(guī)范了育種過程中赤霉病抗性鑒定及分子標(biāo)記檢測的世代和方法,有效降低了育種成本,結(jié)合夏繁加代技術(shù),有望準(zhǔn)確、高效選育出適應(yīng)西南麥區(qū)地理環(huán)境且聚合已知抗赤霉病基因的小麥新品種。

1 育種目標(biāo)

通過高效聚合有效的赤霉病抗性基因,實(shí)現(xiàn)赤霉病抗性和本地品種(系)豐產(chǎn)性的結(jié)合,育成綜合性狀優(yōu)良的抗赤霉病小麥新品種。對低世代群體,要側(cè)重于抗性和個(gè)體豐產(chǎn)性的選擇;對高世代群體,要側(cè)重于抗性、產(chǎn)量性狀和群體協(xié)調(diào)性的結(jié)合,并利用抗赤霉病基因標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記篩選。

2 育種技術(shù)體系流程

2.1 親本選擇

西南麥區(qū)缺乏抗赤霉病育種資源材料,而目前已有的抗病品種如蘇麥3號、望水白、Frontana等,往往伴隨不抗條銹病、產(chǎn)量低、穗密度稀、植株偏高等不良農(nóng)藝性狀,難以在育種中直接應(yīng)用。因此,要使用農(nóng)藝性狀改良后的抗赤霉病種質(zhì)與西南麥區(qū)豐產(chǎn)品種(系)雜交或復(fù)交,才能有效提高小麥抗赤霉病育種效率?，F(xiàn)階段,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)已培育出抗赤霉病改良新品系如NMAS07(Fhb1+Fhb4+Fhb5)、NMAS22(Fhb1+Fhb2+Fhb4+Fhb5)等,長江中下游麥區(qū)也新審定一批抗赤霉病品種如生選6號、寧麥20、揚(yáng)麥33等,這類品種(系)赤霉病抗性好且穩(wěn)定,農(nóng)藝性狀相對優(yōu)良,可作為抗赤霉病育種親本加以利用。

2.2 低世代群體田間選擇及抗赤性彌霧鑒定

對低世代(如單交為F2～F4代,復(fù)交為BC1F2～BC1F4代)分離群體,應(yīng)盡量種植為小區(qū),行長3～6m,行距26.7cm,每小區(qū)3～6行,以方便噴霧及后期蓋膜保濕。赤霉病接種:采用小區(qū)彌霧接種法進(jìn)行鑒定。在鑒定小區(qū)大約10%麥穗揚(yáng)花(揚(yáng)花初期)時(shí),利用大型機(jī)械噴霧設(shè)施或噴壺,向小區(qū)內(nèi)小麥穗部均勻噴灑赤霉病菌分生孢子懸浮液,對育種材料進(jìn)行大規(guī)?？钩嘈詮涭F接種鑒定。注意開始接種前,應(yīng)將培養(yǎng)好的分生孢子懸浮液濃度調(diào)整至1×104個(gè)孢子/mL,并加入1/1000比例的Tween-20。噴霧效果以全區(qū)麥穗基本形成霧珠為宜,在彌霧接種后若天氣干燥應(yīng)對鑒定小區(qū)進(jìn)行蓋膜保濕處理,以確保分生孢子充分萌發(fā)并發(fā)病,避免接種失敗。

彌霧接種于鑒定小區(qū)處于乳熟中后期進(jìn)行抗性調(diào)查,抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考《小麥品種抗赤霉病性田間鑒定技術(shù)規(guī)程》(DB51/T 1680-2013),根據(jù)發(fā)病麥穗的平均病害嚴(yán)重度和小區(qū)發(fā)病普遍率綜合進(jìn)行抗性評價(jià)。0級為無發(fā)病小穗;1級為零星小穗發(fā)病,發(fā)病小穗占全穗的5%以下;2級為發(fā)病小穗占全穗的5%～24%;3級為發(fā)病小穗占全穗的25%～50%;4級為發(fā)病小穗占全穗的50%以上;為節(jié)約鑒定時(shí)間,小區(qū)發(fā)病普遍率可目測估計(jì)。評價(jià)標(biāo)準(zhǔn):平均嚴(yán)重度0級表示免疫(I);1級表示高抗(HR);2級或3～4級且發(fā)病普遍率≤20%表示中抗(MR);3級且發(fā)病普遍率>20%表示中感(MS);4級且發(fā)病普遍率>20%表示高感(HS)。

在低世代群體,田間綜合選擇農(nóng)藝性狀好,同時(shí)抗條銹病和赤霉病的單穗混收混播。至F4代或BC1F4代選種后,得到的F5代或BC1F5代種子單穗單收,進(jìn)入高世代群體篩選。

2.3 分子標(biāo)記輔助選擇

對F5代或BC1F5代單穗種子,每穗取4粒采用SDS法[18]提取基因組DNA。采用與赤霉病抗性基因Fhb1、Fhb2、Fhb4和Fhb5[19]緊密相關(guān)的8個(gè)分子標(biāo)記(表1)對單穗材料進(jìn)行檢測,均以聚合赤霉病抗性基因的川麥64近等基因系(CM64Fhb1+2+4+5)為陽性對照。

表1 小麥赤霉病抗性基因相應(yīng)分子標(biāo)記信息

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為15μL,包含20ng DNA模板,上下游引物各0.5μmol/L,TaqPCR Mix預(yù)混液(2 ×,含藍(lán)染料)。PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性3min;94℃變性 30s,52～61℃退火30s,72℃延伸40s,共36個(gè)循環(huán);72℃延伸5min,最后4℃保存(程序中退火溫度因引物不同而異)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5%(w/v)瓊脂糖或8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分析。

含有抗赤霉病基因的單穗應(yīng)優(yōu)先保留,特別是含有多個(gè)抗赤霉病基因的單穗更應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注,入選單穗按穗行進(jìn)入下一代田間種植。若時(shí)間緊迫,也可優(yōu)先對抗赤霉病Fhb1基因[16]進(jìn)行檢測。

2.4 高世代群體田間選擇及抗赤性單花鑒定

對高世代(如單交為F5～F6代,復(fù)交為BC1F5～BC1F6代)群體,將經(jīng)分子標(biāo)記輔助選擇后入選的單穗種子種植為穗行,行長1.8m,行距26.7cm。赤霉病接種:采用小麥穗部單花滴注接種法進(jìn)行鑒定。在待鑒定小麥穗行大約10%麥穗揚(yáng)花(揚(yáng)花初期)時(shí),選擇不同單株的主莖穗,剪去部分麥芒以區(qū)別其余麥穗,隨后用微量移液器將10μL稀釋好的赤霉病菌分生孢子懸浮液(濃度1×106個(gè)孢子/mL)注射至麥穗中上部的一個(gè)小花內(nèi)(為方便接種,可將待注射小穗剪去1/3)。每個(gè)穗行接種10～15個(gè)穗子,接種后用透明塑料薄膜將整個(gè)麥穗套住保濕,并注意及時(shí)掛牌記載接種日期,保濕72h后去掉塑料袋,之后根據(jù)空氣濕度情況定期進(jìn)行噴霧保濕,以保證充分發(fā)病。

單花滴注鑒定于各材料接種后25～30d(根據(jù)氣候每年時(shí)間有所差別)進(jìn)行抗性調(diào)查,抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考《小麥抗赤霉病評價(jià)技術(shù)規(guī)范》(NY/T 1443.4-2007)和《小麥區(qū)域試驗(yàn)品種抗赤霉病鑒定技術(shù)規(guī)程》(NY/T 2954-2016),根據(jù)接種麥穗的平均病害嚴(yán)重度進(jìn)行抗性評價(jià)。0級為接種小穗無可見發(fā)病病狀;1級為僅接種小穗發(fā)病或相鄰的個(gè)別小穗發(fā)病,病斑不擴(kuò)展到穗軸;2級為穗軸發(fā)病,發(fā)病小穗占全穗的1/4以下;3級為穗軸發(fā)病,發(fā)病小穗占全穗的1/4～1/2;4級為穗軸發(fā)病,發(fā)病小穗占全穗的1/2以上。以接種的10～15個(gè)麥穗赤霉病嚴(yán)重度的平均值作為平均病害嚴(yán)重度,評價(jià)標(biāo)準(zhǔn):=0表示免疫(I);0<<2.0表示抗病(R);2.0≤<3.0表示中抗(MR);3.0≤<3.5表示中感(MS);≥3.5表示高感(HS)。

在高世代群體,田間綜合選擇農(nóng)藝性狀好且基本穩(wěn)定,群體協(xié)調(diào)性好,株高適中,穗層整齊,褪色落黃好,且同時(shí)抗條銹病和赤霉病的穗子單穗單收,繼續(xù)播種為穗行。至F6代或BC1F6代穗行選擇后,得到的F7代或BC1F7代種子混收進(jìn)入品系鑒定試驗(yàn)。

2.5 品系鑒定

對已穩(wěn)定的高世代(如單交為F7代,復(fù)交為BC1F7代)群體,種植為小區(qū),小區(qū)面積6.67m2,參照《農(nóng)作物品種(小麥)區(qū)域試驗(yàn)技術(shù)規(guī)程》(NY/T 1301-2007)對入選品系進(jìn)行農(nóng)藝性狀和抗性調(diào)查,重點(diǎn)考察產(chǎn)量三因素和條銹病、赤霉病抗性,擇優(yōu)升入多點(diǎn)品比試驗(yàn)直至推薦參加正式區(qū)域試驗(yàn)。

需要注意的是,以上世代選擇和鑒定操作應(yīng)根據(jù)具體育種情況為準(zhǔn),若材料穩(wěn)定很快可提前進(jìn)入高世代選擇,若持續(xù)分離則應(yīng)增加低世代選擇的代數(shù)和時(shí)間。

3 育種實(shí)例

3.1 抗赤霉病新材料川1147選育流程

川1147系譜為:17139/NMAS07,其中母本17139(系譜(CM107//CM107/Yr15)F4/川農(nóng)16)系課題組自育品系,表現(xiàn)豐產(chǎn)性好,高抗條銹病;父本NMAS07引自南京農(nóng)業(yè)大學(xué),含有Fhb1、Fhb4、Fhb5 3個(gè)抗赤霉病基因。

按上述高效聚合抗赤霉病基因育種技術(shù)體系流程,以17139為母本,NMAS07為父本配置雜交組合,馬爾康夏繁F1代,于F2～F4代連續(xù)3代進(jìn)行大規(guī)?？钩嘈詮涭F鑒定,獲得的F5代種子(每穗4粒)經(jīng)提取DNA后進(jìn)行分子標(biāo)記篩選,選擇含有抗赤霉病基因Fhb1的單穗繼續(xù)種植為穗行,于F5～F6代連續(xù)2代進(jìn)行抗赤性單花滴注鑒定,獲得的F7代種子混收進(jìn)入品系鑒定試驗(yàn),表現(xiàn)農(nóng)藝性狀好,遺傳穩(wěn)定,性狀整齊一致,兼抗條銹病和赤霉病,命名為川1147。

3.2 抗赤霉病新材料川782選育流程

川782系譜為:17140/生選6號//川16316,首先利用17140與生選6號進(jìn)行雜交,其中17140(系譜(CM107//CM107/Yr15)F4/川農(nóng)16)系課題組自育品系,表現(xiàn)豐產(chǎn)性好,抗條銹病;生選6號引自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所,經(jīng)國審抗赤霉病。由于F1代組合優(yōu)勢明顯但穗子偏小,將F1再次與大穗大粒種質(zhì)川16316(系譜98-1231//貴農(nóng)21/生核3295)配置復(fù)交組合,馬爾康夏繁BC1F1代。

同樣按上述流程,BC1F2～BC1F4代連續(xù)3代進(jìn)行大規(guī)?？钩嘈詮涭F鑒定,經(jīng)分子標(biāo)記篩選后BC1F5～BC1F6代連續(xù)2代進(jìn)行抗赤性單花滴注鑒定,獲得的BC1F7代種子混收進(jìn)入品系鑒定試驗(yàn),表現(xiàn)農(nóng)藝性狀好,遺傳穩(wěn)定,性狀整齊一致,兼抗條銹病和赤霉病,命名為“川782”。

4 結(jié)語

由于機(jī)械化易操作,目前西南麥區(qū)小麥生產(chǎn)的經(jīng)營主體已逐步轉(zhuǎn)變?yōu)檗r(nóng)業(yè)種植大戶,小麥生產(chǎn)出現(xiàn)播期延長、花期集中、品種多樣性下降的特點(diǎn)。而隨著全球氣候變暖和耕作制度的改變,西南麥區(qū)赤霉病流行風(fēng)險(xiǎn)呈逐年增加趨勢,若發(fā)生赤霉病爆發(fā)

圖1 抗赤霉病小麥新品系川1147和川782選育流程

流行,將比以往造成更加嚴(yán)重的產(chǎn)量損失和經(jīng)濟(jì)損失,因此,培育并推廣抗病新品種已成為西南麥區(qū)防治小麥赤霉病的關(guān)鍵。本文建立了高效聚合抗赤霉病基因的育種技術(shù)體系,在低世代分離群體進(jìn)行抗赤霉病性彌霧接種鑒定,高世代群體采用單花滴注法接種鑒定,并利用抗赤霉病基因標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種。該技術(shù)體系發(fā)揮了從低代起即可有效對農(nóng)藝性狀和抗病性同時(shí)展開篩選的優(yōu)勢,且結(jié)合分子標(biāo)記篩選可以大大降低育種成本,并能有效防止選擇過程中抗病基因的丟失,提高抗赤霉病育種效率,有望準(zhǔn)確、高效選育出適應(yīng)西南麥區(qū)地理環(huán)境且聚合已知抗赤霉病基因的小麥新品種。