氚水長期暴露對斑馬魚子代生長發(fā)育影響的研究

顧鵬 誠 羅發(fā)堅 薛惠元 陳娜 孫亮 萬駿 崔鳳梅 涂彧

蘇州大學(xué)蘇州醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)與防護學(xué)院，放射醫(yī)學(xué)與輻射防護國家重點實驗室，蘇州 215123

氚是氫的同位素之一，隨著核技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展，核試驗、核反應(yīng)堆、核燃料后處理、核事故的發(fā)生等會導(dǎo)致大量的氚排放到環(huán)境中[1-3]。氚的理化性質(zhì)決定了其在環(huán)境中大多以氚水的形式存在，且可以經(jīng)皮膚、傷口、呼吸道、消化道等多種途徑進入生物體內(nèi)造成內(nèi)照射損傷[4]。高劑量氚的相對生物效能（relative biological effectiveness, RBE）值為1[5]，但近年來的一些研究結(jié)果表明，低劑量氚（＜100 mGy）的RBE 值可能＞1，且RBE 值在一定范圍內(nèi)隨氚水劑量的降低而升高[6-7]。低劑量氚水所致的生物效應(yīng)不易觀察，需要通過構(gòu)建合適的動物模型才可以檢測[8]。

斑馬魚是一種模式生物，其具有體型小、養(yǎng)成周期短、產(chǎn)卵量大、胚胎透明、成本低等優(yōu)點[9]，是國際標(biāo)準化組織（ISO）認可的5 種魚類實驗動物之一，被經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）推薦用于各種類型的生態(tài)毒理學(xué)試驗[10-11]。

本研究擬通過斑馬魚構(gòu)建氚水長期暴露動物模型，并在此基礎(chǔ)上檢測斑馬魚子代發(fā)生的改變[12]，初步探討斑馬魚長期氚水暴露可能導(dǎo)致的子代生物效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用成年AB 品系野生型斑馬魚購自國家斑馬魚資源中心。本實驗經(jīng)蘇州大學(xué)動物保護和使用委員會批準，符合《實驗動物護理和使用指南》的要求。

1.2 試劑與儀器

氚水購自美國PerkinElmer 公司；培養(yǎng)基（5 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl，0.33 mmol/L CaCl2，0.03 mmol/L MgSO4，0.01%亞甲基藍和1 L 去離子水）為本實驗室自行配制；PBS 購自美國AXYFEN 公司；總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒、活性氧（reactive oxygen species，ROS）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；三卡因（Tricaine）購自蘇州格瑞特醫(yī)藥技術(shù)有限公司；高氯酸購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；過氧化氫購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。5 ml 可立凍存管購自蘇州科技有限公司；斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)購自青島金水海洋生物設(shè)備有限公司；低本底液閃計數(shù)器（Tri-Carb 2910TR 型）購自美國PerkinElmer 公司；MoticSMZ-168 型體式顯微鏡購自廈門麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；十二孔細菌培養(yǎng)板購自上海賽默爾世飛科技（中國）有限公司；MF52-N 型熒光顯微鏡購自廣州明美光電技術(shù)有限公司；KZ-Ⅲ型研磨儀購自武漢賽維爾生物科技有限公司；DK-S22 型電熱恒溫水浴鍋購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 氚水長期暴露斑馬魚模型的建立

將正常斑馬魚所產(chǎn)胚胎分別暴露于0、1×102、1×105Bq/L 的氚水中3 個月以上作為親代（記作F0代），待其性成熟后進行繁殖得到子代（記作F1代）并繼續(xù)飼養(yǎng)在對應(yīng)濃度的氚水中。按照斑馬魚的發(fā)育階段，分別選取合適的指標(biāo)對胚胎期、幼苗期、幼魚期、成魚期斑馬魚進行相關(guān)檢測。

1.3.2 F1 代斑馬魚孵化率的檢測

采用簡單隨機方法分別從0、1×102、1×105Bq/L的3 組氚水暴露F0 代斑馬魚成魚所產(chǎn)胚胎中選取50 枚胚胎，繼續(xù)暴露在與F0 代對應(yīng)的0、1×102、1×105Bq/L 氚水中，第7 天時統(tǒng)計每組50 枚胚胎的孵化數(shù)并計算孵化率（孵化率=孵化的斑馬魚數(shù)量/50×100%），期間及時去除死卵。上述實驗至少重復(fù)3 次。

1.3.3 F1 代斑馬魚自主運動、心率、體長的檢測

在F1 代受精后24、36 h，采用簡單隨機方法分別從1.3.2 中的3 組F1 代斑馬魚胚胎中各選取10 枚胚胎，使用體式顯微鏡對斑馬魚胚胎1 min內(nèi)的自主運動次數(shù)計數(shù)；受精后48、60 h，采用簡單隨機方法分別從上述3 組胚胎中各選取10 枚胚胎，使用體式顯微鏡對斑馬魚胚胎20 s 內(nèi)的心臟跳動次數(shù)計數(shù)；受精后72、84 h，采用簡單隨機方法分別從上述3 組斑馬魚胚胎中各選取10 條斑馬魚幼苗，在體式顯微鏡下拍照，應(yīng)用麥克奧迪圖像軟件（Motic Images Plus，廈門麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）計算3 組斑馬魚幼苗的體長。上述實驗均至少重復(fù)3 次。

1.3.4 F1 代斑馬魚幼苗ROS 含量的檢測

將F0 代3 組斑馬魚所產(chǎn)胚胎繼續(xù)暴露于與F0代對應(yīng)的0、1×102、1×105Bq/L 3 組不同濃度的氚水中，在斑馬魚胚胎受精4～5 h 時加入0.003% 苯基硫脲（PTU）溶液以抑制斑馬魚體內(nèi)黑色素的生成。在斑馬魚幼苗魚齡達4 d 時，采用簡單隨機方法從0、1×102、1×105Bq/L 的3 個濃度氚水暴露組中各選取10 條斑馬魚魚苗進行實驗。每組斑馬魚魚苗分別加入12 孔板中，用PBS 清洗3 次，隨后加入1 ml 含10 μmol/L DCFH-DA（2, 7-二氯熒光素二乙酸酯）的PBS，于28.5℃、避光環(huán)境中孵育1 h。孵育結(jié)束后，用PBS 清洗3 次以去除多余的探針，在熒光顯微鏡下拍照記錄3 組斑馬魚體內(nèi)的ROS 熒光強度。采用簡單隨機方法從3 組中分別選取4 條斑馬魚，采用Image J 軟件（美國NIH 公司）對其全身的熒光強度進行定量分析。

1.3.5 F1 代斑馬魚幼魚T-SOD、MDA 含量的檢測

采 用 簡 單 隨 機 方 法 選取F1 代0、1×102、1×105Bq/L 3 個濃度氚水暴露組斑馬魚幼魚中魚齡達45、60 d 的各3 條，準確稱量體重后按照體重（g）∶生理鹽水（ml）=1∶9 的比例在研磨儀上研磨制成10%的組織勻漿，再使用生理鹽水稀釋為5%的組織勻漿。吸取5%的組織勻漿30 μl，使用生理鹽水稀釋為1%的組織勻漿檢測T-SOD 的含量；吸取5%的組織勻漿100 μl，使用二喹啉甲酸（BCA）法對蛋白濃度進行定量分析；吸取5%的組織勻漿100 μl 檢測MDA 的含量。實驗步驟均嚴格按照對應(yīng)試劑盒的說明書進行。

1.3.6 F1 代斑馬魚成魚產(chǎn)卵量的統(tǒng)計

采用簡單隨機方法分別選取0、1×102、1×105Bq/L 3 個濃度氚水暴露組中4 月齡以上性成熟的F1 代斑馬魚雌、雄魚各1 條，在交配前1 天晚上放入配魚缸，中間用隔板隔開。第二天上午9 點，自動光照系統(tǒng)（本實驗室自制）開啟后將隔板拿開，雌魚開始產(chǎn)卵2 h 后收集斑馬魚胚胎并計數(shù)。上述實驗至少重復(fù)3 次。

1.3.7 F1 代斑馬魚體內(nèi)氚含量的檢測

采用簡單隨機方法分別選取0、1×102、1×105Bq/L 3 個濃度氚水暴露組中魚齡為45、60 d的斑馬魚幼魚各3 條，使用三卡因?qū)⑵渎樽砗笥眉儍羲疀_洗3 次，擦干幼魚體表水分后稱量體重，按照體重（g）∶生理鹽水（ml）=1∶9 的比例在研磨儀上研磨制成10%的組織勻漿。吸取10%的組織勻漿500 μl 于5 ml 可立凍存管中，加入500 μl 消解液（HClO4∶H2O2=2∶3），在70℃電熱恒溫水浴鍋中消解至少1 h，待消解完全后吸取全部液體于20 ml液閃瓶中，加入7 ml 純凈水混合均勻。對照組為8 ml 純凈水。在避光條件下，向液閃瓶中加入12 ml 閃爍液并充分振蕩，加蓋密封暗化12 h 以上至液體澄清后，使用低本底液閃計數(shù)器對斑馬魚體內(nèi)的總氚含量進行檢測。檢測過程全程避光，檢測時間10 min，檢測設(shè)置內(nèi)循環(huán)1 次，外循環(huán)3 次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad Prism 9 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組間的比較采用t檢驗（方差齊）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 F1 代斑馬魚孵化率的比較

由圖1 可知，0、1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組斑馬魚的孵化率分別為（90.66±0.05）%、（85.63±0.10）%、（78.06±0.15）%。與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚孵化率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.785、1.370，P=0.462、0.220）。

圖1 不同濃度氚水長期暴露F1 代斑馬魚孵化率的比較Figure 1 Comparison of hatching rate of F1 generation zebrafish after long-term exposure to different concentrations of tritiated water

2.2 F1 代斑馬魚自主運動、心率、體長的比較

由圖2 可知，0、1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組斑馬魚受精后24 h 的自主運動次數(shù)分別為（12.93±2.70）、（11.30±0.78）、（10.50±0.80） 次/min。與0 Bq/L氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚受精后24 h 自主運動次數(shù)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.008、1.499，P=0.370、0.208）。3 組斑馬魚受精后36 h 的自主運動次數(shù)分別為（3.63±1.43）、（4.50±1.15）、（5.40±3.55） 次/min。與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚受精后36 h 自主運動次數(shù)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.817、0.799，P=0.460、0.469）。

圖2 不同濃度氚水長期暴露F1 代斑馬魚受精后不同時間自主運動次數(shù)、心率、體長的比較Figure 2 Comparison of autonomous movement, heart rate and body length of F1 generation zebrafish at different times after fertilization after long-term exposure to different concentrations of tritiated water

3 組斑馬魚受精后48 h 的心率分別為（59.43±6.93）、（65.00±3.30）、（61.23±4.55） 次/20 s。與0 Bq/L氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚受精后48 h 心率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.256、0.376，P=0.278、P=0.726）。3 組斑馬魚受精后60 h 的心率分別為（69.87±2.71）、（66.17±6.97）、（69.77±9.08） 次/20 s。與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚受精后60 h 心率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.857、0.018，P=0.440、0.986）。

3 組斑馬魚受精后72 h 的體長分別為（3.20±0.22）、（3.32±0.08）、（3.29±0.06） mm。與0 Bq/L氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚受精后72 h 體長的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.614、0.178，P=0.525、0.868）。3 組斑馬魚受精后84 h 的體長分別為（3.42±0.07）、（3.46±0.11）、（3.40±0.04） mm。與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚受精后84 h 體長的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.527、0.496，P=0.626、0.646）。

2.3 F1 代斑馬魚幼苗體內(nèi)ROS 熒光強度的比較

由圖3 可知，0、1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組斑馬魚的ROS 熒光強度分別為（21.07±4.74）、（23.71±7.73）、（23.19±5.32）。與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚幼苗ROS 熒光強度的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.582、0.593，P=0.582、0.575）。

圖3 不同濃度氚水長期暴露F1 代斑馬魚幼苗活性氧熒光強度的比較Figure 3 Comparison of reactive oxygen species fluorescence intensity of F1 generation zebrafish seedlings after long-term exposure to different concentrations of tritiated water

2.4 F1 代斑馬魚幼魚體內(nèi)T-SOD、MDA 含量的比較

由圖4 可知，0、1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組斑馬魚45 d 的T-SOD 含量分別為（41.84±4.91）、（42.30±5.04）、（36.97±5.26） U/mgprot。與0 Bq/L氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚45 d T-SOD 含量的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.112、1.171，P=0.916、0.307）。3 組斑馬魚60 d 的T-SOD 含量分別為（36.93±1.91）、（34.07±3.02）、（33.54±1.87） U/mgprot。與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚60 d T-SOD 含量的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.397、2.195，P=0.240、0.093）。

圖4 不同濃度氚水長期暴露F1 代不同魚齡斑馬魚幼魚體內(nèi)T-SOD、MDA 含量的比較 a 表示與0 Bq/L 氚水暴露組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.831，P=0.047）。T-SOD 為總超氧化物歧化酶；MDA 為丙二醛Figure 4 Comparison of total superoxide dismutase and malondialdehyde content in F1 generation zebrafish of different age after long-term exposure to different concentrations of tritiated water

3 組斑馬魚45 d 的MDA 含量分別為（3.60±1.56）、（3.59±0.44）、（2.95±0.58） nmol/mgprot。與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚45 d MDA 含量的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.007、0.677，P=0.995、0.536）。3 組斑馬魚60 d 的MDA 含量分別為（4.00±0.52）、（4.19±1.37）、（3.01±0.32） nmol/mgprot。與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚60 d MDA 含量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.229，P=0.830），1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚MDA含量的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.831，P=0.047）。

2.5 F1 代斑馬魚產(chǎn)卵量的比較

由圖5 可知，0、1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組斑馬魚產(chǎn)卵量分別為（188±88）、（204±22）、（220±40）枚。與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L氚水暴露組F1 代斑馬魚產(chǎn)卵量的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.400、0.757，P=0.700、0.477）。

圖5 不同濃度氚水長期暴露F1 代斑馬魚成魚產(chǎn)卵量的比較Figure 5 Comparison of eggs laid by adult F1 generation zebrafish after long-term exposure to different concentrations of tritiated water

2.6 F1 代斑馬魚體內(nèi)總氚含量的比較

1×105Bq/L 氚水長期暴露條件下，F(xiàn)1 代斑馬魚的魚齡達60 d 時，測得其體內(nèi)總氚含量為（32.23±1.97） Bq/g。

3 討論

在研究低劑量氚水長期暴露所致生物效應(yīng)時需要選取合適的暴露濃度與實驗動物模型。目前對于氚水濃度高低劃分的標(biāo)準尚未統(tǒng)一，且不同國家之間差異顯著。以飲用水中氚含量的限值為例，歐盟大部分國家的標(biāo)準為1×102Bq/L，加拿大為7×103Bq/L，俄羅斯為7.7×103Bq/L，芬蘭為3×104Bq/L，澳大利亞為＞7.6×103Bq/L[13]。同時，核電站排放的氚水濃度通常為1×106Bq/L[14]。對于在內(nèi)陸建造的核電站，我國要求其排放口下游1 km 處受納水體中氚濃度不超過1×102Bq/L[15]。因此，本文綜合環(huán)境因素選取低劑量氚水暴露濃度為1×102和1×105Bq/L。

由于低劑量氚水的生物效應(yīng)不易被觀察到，一些研究者通過構(gòu)建更為敏感的動物模型，如轉(zhuǎn)入Rev1 基因的C57BL/6N 小鼠、轉(zhuǎn)染人源X 染色體的Hprt 基因缺失的倉鼠細胞等對低劑量氚水的生物效應(yīng)進行研究[16-17]。然而這些模型目前并不適用于低劑量氚水長期暴露的生物效應(yīng)研究。斑馬魚作為一種理想的實驗動物模型被廣泛應(yīng)用于氚水的毒性效應(yīng)研究中，且由于其體型小、養(yǎng)成周期短、產(chǎn)卵量大、胚胎透明、成本低等優(yōu)勢十分適合用于氚水長期暴露的生物效應(yīng)研究[18-19]。Li 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，氚水對斑馬魚胚胎的行為、生理和基因的表達產(chǎn)生綜合影響。Arcanjo 等[21-22]研究發(fā)現(xiàn)，氚水暴露后斑馬魚幼苗參與肌肉收縮、眼晶體透明度、DNA 損傷修復(fù)的基因出現(xiàn)錯誤表達。雖然上述研究中的氚水濃度均高于本實驗設(shè)置的濃度，但是考慮斑馬魚作為模型動物的優(yōu)勢，可以對其在低濃度氚水暴露方面的研究進行探索。

本研究中，在低劑量氚水長期暴露的條件下，與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚的孵化率、自主運動、心率、體長、產(chǎn)卵量等指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明斑馬魚在1×102、1×105Bq/L 濃度的氚水中僅暴露到F1 代并未對其基本生長發(fā)育造成影響。目前，氚水長期暴露的生物效應(yīng)的相關(guān)研究較少，一些發(fā)現(xiàn)氚水暴露對斑馬魚生長發(fā)育指標(biāo)產(chǎn)生影響的研究中所設(shè)置的氚水濃度較高且均為急性暴露[20,23]，因此本實驗結(jié)果仍需做進一步研究。

氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)（ROS、SOD、MDA 等）在氚水的毒性效應(yīng)評價中得到了廣泛應(yīng)用，但不同濃度氚水暴露的生物效應(yīng)仍不明確[12]。Huang 等[24]對在3.7×106Bq/L 氚水中暴露96 h 的小球藻和萊茵衣藻的氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)進行檢測，結(jié)果表明，小球藻的ROS 熒光強度增加、SOD 含量降低，MDA含量無明顯變化；萊茵衣藻的ROS 熒光強度、SOD含量、MDA 含量均無明顯變化，與之前的研究結(jié)果[25]不一致，他們認為可能是由于氚水的暴露濃度與時間不一致所致。Gagnaire 等[26]對在1×108Bq/L氚水中暴露的斑馬魚進行了ROS 檢測，結(jié)果表明，魚齡為4 d 的斑馬魚的ROS 熒光強度增加，但是魚齡為7 d 和10 d 的斑馬魚的ROS 熒光強度無明顯變化。本研究中，與0 Bq/L 氚水暴露組比較，1×102Bq/L 氚水暴露組斑馬魚的ROS 熒光強度、T-SOD 含量、MDA 含量的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；1×105Bq/L 氚水暴露組60 d 的 F1 代斑馬魚的MDA含量降低。因此仍需就相關(guān)指標(biāo)做進一步研究。

1×105Bq/L 氚水暴露組60 d 的F1 代斑馬魚體內(nèi)的總氚含量為（32.23±1.97） Bq/g。其他濃度氚水和暴露時間的樣品未檢測到明顯的氚含量積累，其原因可能為樣本中的氚含量過低或低本底液閃計數(shù)器的檢測性能不足所致。斑馬魚體內(nèi)氚含量的明顯積累提示氚水長期暴露可能會對斑馬魚產(chǎn)生一定影響，較多研究結(jié)果均表明相同氚含量下有機結(jié)合氚比游離氚產(chǎn)生的生物效應(yīng)更加顯著[23,27-29]。后續(xù)需要對氚水的暴露時間、暴露濃度、測量指標(biāo)等做進一步優(yōu)化，以更好地觀察氚水長期暴露的毒性。

本研究依據(jù)核電站實際排放核廢水的標(biāo)準及環(huán)境水體中氚濃度的變化設(shè)置了氚水濃度，并以斑馬魚為實驗?zāi)Ｐ蛯υ摑舛入八L期暴露所致F1 代斑馬魚的生物效應(yīng)做了初步探討。未來應(yīng)對氚水長期暴露斑馬魚子代作進一步研究，觀察F1 代后續(xù)子代的各項指標(biāo)以進一步明確低劑量氚水長期暴露的生物效應(yīng)，為環(huán)境評價和生物健康提供完善的參考數(shù)據(jù)。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 顧鵬誠負責(zé)現(xiàn)場實驗的實施、論文的撰寫；羅發(fā)堅、薛惠元負責(zé)實驗?zāi)Ｐ偷慕ⅰ?shù)據(jù)的收集與分析；陳娜、孫亮、萬駿負責(zé)實驗思路的提出與實驗設(shè)計的指導(dǎo)；崔鳳梅、涂彧負責(zé)論文的審閱與修改