水稻矮化多蘗突變體mtd2/htd1-1的鑒定與圖位克隆

王曉雯，王媛媛，馮蓓祺，雷松翰，范駿揚(yáng)， 楊晶晶，仝瑞建，田維江，桑賢春

1. 西南大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400715；2. 菏澤學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，山東 菏澤 274000

有效穗、每穗實(shí)粒數(shù)和千粒質(zhì)量是水稻產(chǎn)量構(gòu)成的3大要素,其中有效穗由分蘗數(shù)直接決定,因此研究分蘗發(fā)育機(jī)理具有重要的生物學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值.與雙子葉植物相對應(yīng),水稻分蘗可以看作是其莖稈上發(fā)生的分枝,一級分蘗直接形成于水稻莖稈基部的分蘗節(jié),二級分蘗則產(chǎn)生于一級分蘗莖稈基部的分蘗節(jié),依次類推[1].水稻分蘗發(fā)育可分為兩個(gè)階段: 分蘗芽的形成和分蘗芽的伸長[2-3].水稻分蘗芽發(fā)育始于葉腋處,通常僅有位于根部和非伸長節(jié)間的腋芽才能正常發(fā)育成分蘗芽,并最終形成有效穗[4]．

水稻分蘗數(shù)既受環(huán)境因素的影響,也受內(nèi)源基因的調(diào)控[5].環(huán)境因素主要有溫度、光照、營養(yǎng)和水分等,基因調(diào)控則涉及糖、生長素(IAA)、獨(dú)腳金內(nèi)酯(SLs)等多種代謝和信號傳導(dǎo)途徑[6-8].以營養(yǎng)元素為例,孫祥武等[9]探討不同比例的氮磷鉀摻混肥對分蘗的影響,結(jié)果表明氮元素在水稻分蘗期起核心作用.蔣彭炎等[10]通過實(shí)驗(yàn)揭示了水稻幼苗期含氮量和分蘗之間的相關(guān)性,當(dāng)水稻幼苗期含氮量保持在2.7%～3.3%之間時(shí),分蘗發(fā)生才能正常進(jìn)行; 當(dāng)其值低于1.3%時(shí),分蘗芽的發(fā)育就只會進(jìn)行到3幼1基階段.處于分蘗期的水稻植株含磷量低于0.3%,分蘗芽則不會伸長發(fā)育; 分蘗期間水稻植株含鉀量如果低于0.5%,分蘗芽的伸長發(fā)育就會受阻; 含鉀量介于0.5%～1.4%之間分蘗芽的伸長發(fā)育正常[11]．

通過正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué),目前已經(jīng)克隆了許多水稻分蘗數(shù)發(fā)育的相關(guān)基因(https: //www.ricedata.cn/gene/).MONOCULM1(MOC1)是水稻中克隆的第1個(gè)調(diào)控分蘗芽形成的關(guān)鍵基因,編碼1個(gè)GRAS轉(zhuǎn)錄因子[12];MONOCULM3(MOC3)編碼1個(gè)WOX蛋白家族的轉(zhuǎn)錄抑制因子[13];FLORALORGANNUMBER1(FON1)則編碼1個(gè)與擬南芥中CLAVATA1(CLV1)同源的受體激酶,fon1的表型主要集中在花器官的發(fā)育異常上[14].研究發(fā)現(xiàn)FON1在水稻腋生分生組織中也高度表達(dá),突變后盡管能形成正常的分蘗芽,但是芽向外伸長有缺陷,從而導(dǎo)致分蘗數(shù)減少.在moc1和moc3突變體中發(fā)現(xiàn)FON1的表達(dá)水平顯著降低,MOC3蛋白能直接結(jié)合FON1的啟動子,激活后者表達(dá).MOC1蛋白盡管不能直接結(jié)合FON1啟動子,但作為MOC3蛋白的共激活因子,可以和MOC3蛋白共同激活FON1的表達(dá),促進(jìn)分蘗芽的正常伸長[15].大量的實(shí)驗(yàn)及研究證明,激素對分蘗發(fā)育也會產(chǎn)生影響.IAA可以阻止OsIPT的表達(dá)以此降低細(xì)胞分裂素(CKs)的水平來抑制水稻分蘗芽的發(fā)育[16],外源IAA還可以提高D10,D17和D27的表達(dá)量以增加SLs的含量[17].此外,負(fù)責(zé)降解CKs的CKX家族基因也受到IAA的調(diào)控[18].近年來SLs作為激素調(diào)節(jié)分蘗的分子機(jī)制已成為研究熱點(diǎn).在由SLs調(diào)控的水稻分蘗通路中,TB1是一個(gè)作用于SLs下游的基因,其編碼1個(gè)TCP家族的轉(zhuǎn)錄因子,抑制水稻側(cè)芽的伸出,從而負(fù)調(diào)控水稻的分蘗數(shù).過量表達(dá)OsTB1則會造成分蘗數(shù)顯著減少.TB1功能喪失型突變體fc1的分蘗數(shù)會顯著增加[19].IPA1蛋白能與OsTB1的啟動子直接結(jié)合,抑制水稻分蘗發(fā)生,也是一個(gè)負(fù)向調(diào)控分蘗的轉(zhuǎn)錄因子[20].此外,IPA1還作為D53的下游直接調(diào)控元件,可誘導(dǎo)SLs的基因表達(dá)[21].D10編碼類胡蘿卜素裂解雙加氧酶OsCCD8,是SLs生物合成過程中的重要參與酶之一.OsCCD8通過SLs控制水稻側(cè)芽向外生長,最終造成d10突變體株高變矮,分蘗增多[22].D27蛋白是參與SLs生物合成的一個(gè)成員,其突變之后造成植株株高矮化,分蘗數(shù)增多.d27突變體中生長素極性運(yùn)輸增強(qiáng),在根部分泌液中檢測不到SLs,導(dǎo)致分蘗芽向外生長的抑制作用被解除,因此出現(xiàn)多分蘗的表型[23].T20編碼1個(gè)15-順式-ζ-胡蘿卜素異構(gòu)酶,參與SLs前體物質(zhì)類β胡蘿卜素的合成,致使其突變體t20體內(nèi)的β胡蘿卜素和SLs的含量降低,表現(xiàn)為株高變矮,分蘗增多[24].HIGHTILLERINGDWARF1(HTD1)編碼1個(gè)SLs生物合成過程中重要的酶—胡蘿卜素裂解雙加氧酶OsCCD7,該酶是SLs調(diào)控分蘗途徑中重要的一員[25].MTD1編碼蛋白酶抑制因子,通過調(diào)控OsmiR156f的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)株高和分蘗數(shù)[26],OsmiR156f過表達(dá)植株表現(xiàn)為矮化多蘗[27]．

目前水稻分蘗發(fā)育盡管已有一定的分子基礎(chǔ),但其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不清晰.克隆新基因或者等位基因,對于研究其功能和選育水稻高產(chǎn)優(yōu)產(chǎn)的種質(zhì)資源具有重要的意義．

1 材料與方法

1.1 材料

矮化多蘗突變體mtd2來源于西南大學(xué)水稻研究所秈稻保持系西大1B的甲基磺酸乙酯(EMS)誘變體庫,突變表型已穩(wěn)定遺傳.配制mtd2與西大1B雜交組合用于遺傳分析,利用mtd2與縉恢10號的F2隱性群體進(jìn)行基因定位.所用材料均種植于西南大學(xué)水稻研究所歇馬田間試驗(yàn)基地(重慶北碚),常規(guī)管理．

1.2 表型鑒定

水稻田間播種后,全生育期觀察其分蘗數(shù)和株高變化; 成熟后,隨機(jī)取10株mtd2突變體和10株西大1B野生型,對株高、節(jié)間長度、穗長、有效穗、結(jié)實(shí)率、穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量等農(nóng)藝性狀進(jìn)行考種,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析．

1.3 分蘗芽表型鑒定

取4葉期野生型與突變體幼苗,去除根部和多余葉鞘,留下1 cm左右包含分蘗芽的組織于體式顯微鏡下觀察.材料經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟包埋于石蠟中,縱向切片,再經(jīng)過脫蠟、復(fù)水、染色等步驟制成石蠟切片,于微分干涉差顯微鏡(DIC)下觀察．

1.4 圖位克隆

選取F2群體中隱性單株為定位群體,采用BSA法篩選連鎖標(biāo)記[28].CTAB法[29]提取親本、基因池和定位單株DNA.利用SSR引物進(jìn)行初步定位,并構(gòu)建遺傳圖譜.基因初步定位后,在區(qū)間內(nèi)繼續(xù)設(shè)計(jì)SSR和InDel引物,利用全部F2隱性單株數(shù)進(jìn)行精細(xì)定位,所用引物序列見表1.PCR產(chǎn)物經(jīng)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,快速銀染后觀察．

為確定候選基因,取突變體mtd2和西大1B新鮮葉片,送至諾禾致源生物科技有限公司進(jìn)行全基因組測序,利用IGV軟件查找精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)注釋基因的堿基差異,從而初步判定候選基因．

確定候選基因后,將候選基因的野生型基因組全長DNA,包含啟動子區(qū)域2 000 bp以及3′端500 bp連入pCAMBIA1301,構(gòu)建互補(bǔ)載體; 后由武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司將互補(bǔ)載體轉(zhuǎn)化為突變體,形成互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株．

1.5 RNA提取和qRT-PCR

取4葉期野生型與突變體幼苗,提取分蘗芽總RNA,然后體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA.利用qRT-PCR分析調(diào)控分蘗相關(guān)基因在野生型與突變體中的表達(dá)差異.所用引物見表1.

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體mtd2的表型觀察

相同常規(guī)田間種植條件下,我們發(fā)現(xiàn)灌漿期突變體mtd2分蘗數(shù)為70.00±15.11個(gè),遠(yuǎn)高于野生型的11.20±5.26個(gè),相差約6.25倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)(圖1a和1f); 有效穗數(shù)29.00±8.54個(gè),較野生型9.80±4.08個(gè)相差約3倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)(圖1g).mtd2的株高為49.12±1.79 cm,極顯著低于野生型82.70±4.33 cm(圖1a和1h),僅為野生型的59.40%.成熟期統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),mtd2的倒1節(jié)間長18.26±2.03 cm,倒2節(jié)間長9.47±1.50 cm和倒3節(jié)間長4.31±0.98 cm都明顯短于野生型的31.8±3.35 cm,19.23±1.39 cm和6.27±1.12 cm (圖1b和1j); 倒1節(jié)間長和倒2節(jié)間長較野生型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01),倒3節(jié)間長差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),而倒4節(jié)間長差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這些節(jié)間長度的差異導(dǎo)致突變體株高矮化.mtd2穗長14.80±0.90 cm也短于野生型22.82±0.60 cm(圖1c和1i).除此之外,成熟期mtd2的倒1葉、倒2葉和倒3葉的葉片長度較野生型更短(圖1d和1k),葉片寬度也更窄(圖1e和1l)．

2.2 突變體mtd2的農(nóng)藝性狀

由表2可知,mtd2的結(jié)實(shí)率較野生型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但由于一次枝梗數(shù)和二次枝梗數(shù)的減少,其穗粒數(shù)極顯著減少,由野生型平均139.20粒降低為72.20粒.此外,mtd2籽粒的粒長、粒寬和粒厚變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,致使千粒質(zhì)量下降,但mtd2相較于野生型產(chǎn)生了更多的有效穗(圖1g),使單株產(chǎn)量遠(yuǎn)超野生型．

*表示p<0.05,**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 同組中左為野生型(WT),右為突變體(mtd2)．圖1 野生型與mtd2的表型觀察

表2 野生型和突變體的農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)

2.3 突變體mtd2分蘗芽觀察

水稻分蘗數(shù)增多主要有兩方面原因: 一是分蘗芽數(shù)量增多,二是側(cè)生分生組織活躍導(dǎo)致分蘗芽提前伸長.為了探究mtd2分蘗數(shù)量增多的具體原因,我們對4葉期也就是側(cè)生分生組織發(fā)育時(shí)期的幼苗莖基部進(jìn)行了體式顯微鏡觀察.在去除外層葉鞘后發(fā)現(xiàn)野生型的外側(cè)分蘗芽尚未發(fā)育(圖2a),但突變體的分蘗芽已經(jīng)伸長(圖2b); 而后對4葉期野生型和mtd2的幼苗莖基部進(jìn)行石蠟切片觀察,發(fā)現(xiàn)野生型在此時(shí)期有2個(gè)分蘗芽(圖2c),mtd2則有5個(gè)分蘗芽(圖2d),并且外側(cè)4個(gè)分蘗芽均已開始發(fā)育變長.綜上表明mtd2不僅分蘗芽的數(shù)量變多,而且側(cè)生分生組織也變得活躍．

圖2 4葉期野生型和突變體mtd2分蘗芽細(xì)胞學(xué)觀察

2.4 突變體mtd2的遺傳調(diào)控

2.5 MTD2基因的圖位克隆

以390株mtd2/縉恢10號的F2隱性單株為定位群體進(jìn)行基因定位,所用引物為實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的西大1B和縉恢10號之間的差異引物[30].從F2群體中選擇10株典型矮化多蘗單株,利用親本間的差異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,統(tǒng)計(jì)帶紋數(shù),計(jì)算交換值.結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記RM17407交換值為10%,暗示其可能與MTD2連鎖.以RM17407為中心,在其兩端設(shè)計(jì)Indel和SSR標(biāo)記,以同樣的10株典型矮化多蘗單株DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Indel標(biāo)記C04-1的交換值為15%,且交換株與RM17407不同,從而初步將MTD2限定在第4染色體標(biāo)記C04-1和RM17407之間．

為精細(xì)定位目標(biāo)基因,在初步定位區(qū)間內(nèi)設(shè)計(jì)新的Indel標(biāo)記,其中C04-2和C04-3在西大1B和縉恢10號之間具有多態(tài)性.利用C04-1,C04-2,C04-3和RM17407共4對差異引物對390株mtd2/縉恢10號的F2隱性單株進(jìn)行電泳分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其交換株分別為16,3,4和19個(gè),且前兩個(gè)標(biāo)記的交換株與后兩個(gè)不同,從而最終將MTD2限定在水稻第4染色體Indel標(biāo)記的C04-2和C04-3之間157 kb的物理范圍內(nèi)(圖3a)．

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)定位區(qū)間內(nèi)有28個(gè)注釋基因(表3),其中就有已報(bào)道的多孽矮桿基因LOC_Os04g46470-HTD1,編碼1個(gè)類胡蘿卜素裂解雙加氧酶.隨后利用野生型(WT)和mtd2的全基因組測序,在IGV軟件上查找LOC_Os04g46470-HTD1堿基差異,發(fā)現(xiàn)LOC_Os04g46470-HTD1在編碼區(qū)有1個(gè)AGATTCCTCCC共計(jì)11 bp的缺失,從而導(dǎo)致移碼突變(圖3b).進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),相較于野生型全長609個(gè)氨基酸,該移碼突變導(dǎo)致HTD1在509位后編碼的所有氨基酸均發(fā)生了改變,全長則變?yōu)?04個(gè)氨基酸(圖3c),所以我們初步將LOC_Os04g46470-HTD1定為MTD2的候選基因.將野生型中包含2 000 bp啟動子和3′端500 bp的全長LOC_Os04g46470-HTD1基因組DNA導(dǎo)入突變體mtd2中,發(fā)現(xiàn)陽性轉(zhuǎn)基因植株mtd2com的株高和分蘗數(shù)均回復(fù)至野生型水平(圖3d),因此,我們確認(rèn)該突變體的表型是由mtd2/htd1的突變導(dǎo)致,并且mtd2是LOC_Os04g46470-HTD1的一個(gè)全新等位突變體．

圖3 MTD2基因的精細(xì)定位及候選基因鑒定

表3 定位區(qū)間內(nèi)注釋基因

**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．圖4 調(diào)控分蘗相關(guān)基因的qRT-PCR結(jié)果

2.6 分蘗相關(guān)基因qRT-PCR分析

為了探究MTD2在分蘗調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用,我們進(jìn)行了分蘗相關(guān)基因的qRT-PCR分析(圖4).TB1,IPA1,D10,D27和T20均是獨(dú)角金內(nèi)酯(SLs)調(diào)控分蘗通路中的關(guān)鍵基因.TB1,IPA1和D10在qRT-PCR結(jié)果中相較于野生型(WT)均出現(xiàn)下調(diào)趨勢,這與它們在SLs調(diào)控分蘗通路中起負(fù)調(diào)控的作用相吻合,也證實(shí)了MTD2/HTD1確實(shí)是由SLs介導(dǎo)的分蘗調(diào)控途徑.另外D27和T20雖然也是SLs通路中的成員,D27是通過生長素運(yùn)輸抑制SLs運(yùn)輸,T20是合成SLs前體物質(zhì)β胡蘿卜素的重要基因,但兩者在qRT-PCR結(jié)果中未出現(xiàn)明顯變化.另外FON1,MOC1和MOC3是調(diào)控分蘗的經(jīng)典基因,三者在mtd2中的表達(dá)量均明顯上調(diào),表明MTD2也可能參與此三者的通路進(jìn)而影響分蘗.TAD1通過赤霉素(GA)和脫落酸(ABA)信號降解MOC1來調(diào)控分蘗,在mtd2中呈下調(diào)趨勢.此外影響表達(dá)量下調(diào)的還有一個(gè)生長素運(yùn)輸基因OsPIN1b,暗示MTD2可能也通過生長素調(diào)控分蘗．

3 討論與結(jié)論

獨(dú)腳金內(nèi)酯(SLs)是近年來發(fā)現(xiàn)的、由類胡蘿卜素衍生而來的一類新型植物激素.最早發(fā)現(xiàn)SLs能誘導(dǎo)種子萌發(fā)、促進(jìn)叢枝菌的根生長和抑制植物分枝,后來發(fā)現(xiàn)其在葉片衰老、生物脅迫和非生物脅迫等方面也發(fā)揮著重要的作用[31].以擬南芥、水稻等為材料,已鑒定出30多種不同結(jié)構(gòu)的SLs分子,在SLs生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及信號傳導(dǎo)等方面均取得了系列研究進(jìn)展[32].研究發(fā)現(xiàn),SLs合成及信號傳導(dǎo)與生長素(IAA)、細(xì)胞分裂素(CK)、赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、乙烯、水楊酸等其他植物激素存在廣泛的交叉互作[33]．

在水稻等農(nóng)作物中,SLs通過抑制側(cè)芽的伸長進(jìn)而控制分蘗的發(fā)育,從而形成有效穗.理論上,干擾SLs的合成和信號傳導(dǎo)途徑有望塑造育種需要的理想株型,而長期以來,SLs相關(guān)基因在育種中的利用還很不清晰.HTD1/D17編碼胡蘿卜素裂解雙加氧酶OsCCD7,是類胡蘿卜素裂解合成獨(dú)腳金內(nèi)酯過程中的1個(gè)關(guān)鍵酶,負(fù)調(diào)節(jié)水稻分蘗數(shù)[24-25].研究發(fā)現(xiàn),HTD1/D17部分功能缺失等位基因可顯著增加分蘗數(shù),進(jìn)而提高水稻產(chǎn)量,在水稻生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用.本文通過圖位克隆鑒定到1個(gè)HTD1的新等位基因MTD2,MTD2在HTD1編碼區(qū)中有1個(gè)11堿基的缺失,導(dǎo)致移碼突變,致使509位后翻譯的氨基酸完全錯亂,并在翻譯95個(gè)氨基酸后終止.mtd2中HTD1的缺失位點(diǎn)發(fā)生在基因相對靠后的位置,這為研究HTD1的C端功能提供了條件.對分蘗相關(guān)基因進(jìn)行qRT-PCR分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了參與SLs途徑的基因表達(dá)量發(fā)生變化外,FON1,MOC1和MOC3表達(dá)量上調(diào),TAD1和PIN1表達(dá)量下調(diào)(圖4).MOC1-MOC3-FON1途徑通過調(diào)控分蘗芽的生長調(diào)控分蘗數(shù),FON1功能喪失突變體能形成正常的芽,但芽向外伸長有缺陷,導(dǎo)致分蘗數(shù)減少[13].TAD1通過泛素-26S蛋白酶體途徑降解MOC1,從而調(diào)控分蘗數(shù),其功能缺失突變體表現(xiàn)出多蘗性狀．

許多基因具有“一因多效”的功能,如SUI1,其功能缺失突變體sui1-1穗頸節(jié)間變短且部分包穗,sui1-2突變體穗頸節(jié)間極度變短導(dǎo)致完全包穗.smg2除部分包穗外,還表型小籽粒等[28,34].HTD1同樣具有一因多效性,大多功能缺失突變體表現(xiàn)為多蘗和植株半矮化,部分功能缺失突變體表現(xiàn)為株高略矮、分蘗能力增強(qiáng),來自皮泰的HTD1HZ與來自低腳烏尖的SD1DGWG同時(shí)被育種家選擇并利用,促進(jìn)了秈型水稻育種的 “綠色革命”[35].與已報(bào)道的htd1等位突變體相比,mtd2穗與各節(jié)間均極顯著變短,穗粒數(shù)和千粒質(zhì)量也極顯著下降,但由于有效穗極顯著增加而結(jié)實(shí)率無明顯變化,導(dǎo)致單株產(chǎn)量提高約45%(表2).由于mtd2來自秈稻保持系西大1B的EMS誘變,生育期只有90 d左右,因此mtd2在工廠化種植及太空利用等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值．

綜上所述,mtd2是一個(gè)新鑒定到的HTD1等位突變體,其單株產(chǎn)量提高和多蘗矮化等性狀為種質(zhì)資源創(chuàng)制和分蘗的分子機(jī)制挖掘提供了新材料．