超聲輔助提取-LC-MS/MS法測(cè)定豬肉中9種β-受體激動(dòng)劑

閆順華 馬 君 蘇比努爾

（新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，烏魯木齊 830054）

1 前言

β-受體激動(dòng)劑是一組苯乙醇胺化合物，常被用作支氣管擴(kuò)張劑和抗宮縮劑[1，2]，大劑量用在飼料中可以提高動(dòng)物的生長速度，減少動(dòng)物體內(nèi)的脂肪比例，提高瘦肉率[3，4]。β-受體激動(dòng)劑會(huì)在動(dòng)物肌肉和內(nèi)臟中殘留，消費(fèi)者長期食用，會(huì)造成肌肉抽搐、心臟病、中樞神經(jīng)疾病甚至誘發(fā)惡性腫瘤[5-7]。由于其嚴(yán)重的危害性，歐盟和中國已經(jīng)禁止在飼料中添加這類化合物[8-10]。

目前現(xiàn)行有效的檢測(cè)食品中β-受體激動(dòng)劑的國家標(biāo)準(zhǔn)主要有GB 31658.22-2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[11]、SN/T 1924-2011《 進(jìn)出口動(dòng)物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[12]和農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-18-2008《動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[13]，在這3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中，β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)都需要酶解步驟，均采用37℃酶解16h的方式把與蛋白結(jié)合的目標(biāo)化合物釋放出來[12，13]。由于酶解時(shí)間長、前處理方法繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以滿足大批量樣品快速且準(zhǔn)確的分析需求。

本研究對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行了改進(jìn)，用乙腈飽和的正己烷除去樣品中的脂肪，用1%乙酸-乙腈溶液作為提取液對(duì)豬肉樣品進(jìn)行超聲提取，將提取液氮吹至近干，用0.1%甲酸水復(fù)溶后進(jìn)行測(cè)定，方法回收率在70%以上。該樣品前處理方法操作簡單，樣品提取效率高，既縮短了檢驗(yàn)時(shí)間、又節(jié)約了成本（β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶價(jià)格昂貴）、大大提高了工作效率。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：I-Class/Xevo TQS, 美國Waters公司；電子天平：百分之一，Mettler Toledo公司；組織絞碎機(jī)：B-400型，瑞士步琦公司；離心機(jī)：SIGMA 1-14型，德國 Sigma 公司；多用途恒溫超聲儀：BASIC550型，德國Elma公司；氮吹儀：Eva50a型，北京普立泰科儀器有限公司。

β-受體激動(dòng)劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 μg/mL，批號(hào)-S084895，F(xiàn)irstStandard；克倫特羅-D9:100 μg/mL，批號(hào)-S074679，F(xiàn)irstStandard；沙丁胺醇-D3：100 μg/mL，批號(hào)-S074701，F(xiàn)irstStandard；鹽酸萊克多巴胺-D3：100 μg/mL，批號(hào)-S070751，F(xiàn)irstStandard；

乙腈和甲酸：色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；正己烷：色譜純，TEDIA COMPANY，INC；乙酸和乙腈：分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

豬肉粉中克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林分析質(zhì)控樣品：北京美正檢測(cè)技術(shù)有限公司。

2.2 樣品處理

2.2.1 樣品預(yù)處理

取樣品適量，切成小塊，置組織絞碎機(jī)中絞成肉糜，分裝至200mL的樣本袋中，貼樣品狀態(tài)標(biāo)簽，密封后冷凍保存。

2.2.2 樣品制備

稱取2克樣品，置于50mL塑料離心管中，加入1000ng/mL的沙丁胺醇-D3、萊克多巴胺-D3、克倫特羅-D9 3種內(nèi)標(biāo)混合溶液10μL，混勻，加入10mL1%乙酸-乙腈溶液，加入5～10mL經(jīng)乙腈飽和的正己烷，渦旋混勻，超聲提取15min，渦旋混勻，8000r/min離心5min，準(zhǔn)確移取10mL乙腈層在40℃氮吹濃縮至近干，加入2.0mL0.1%甲酸水溶液，渦旋混勻，過0.22μm水系濾膜，上機(jī)待測(cè)。

其中沙丁胺醇-D3作為沙丁胺醇、特布他林的內(nèi)標(biāo)物、萊克多巴胺-D3作為萊克多巴胺的內(nèi)標(biāo)物[16]、克倫特羅-D9作為其余β-受體激動(dòng)劑的內(nèi)標(biāo)物，

2.2.3 方法檢出限、定量限制備

稱取2份陰性樣品2g（精確至0.01g）置于兩個(gè)三角燒瓶中，分別精密加入10ng/mL外標(biāo)混合溶液40μL、100μL，同時(shí)各加入1000ng/mL內(nèi)標(biāo)混合溶液10μL，混勻，按樣品制備方法同法處理。

2.2.4 加標(biāo)樣品制備

稱取陰性樣品2g（精確至0.01g）各置于三角燒瓶中，分別精密加入100ng/mL的9種β-受體激動(dòng)劑外標(biāo)混合溶液10μL、50μL、1000ng/mL外標(biāo)混合溶液40μL，同時(shí)各加入1000ng/mL內(nèi)標(biāo)混合溶液10μL，混勻，按樣品制備方法同法處理。

2.2.5 質(zhì)控樣品處理

稱取2g質(zhì)控樣品（精確至0.01g），加入1000ng/mL內(nèi)標(biāo)混合溶液10μL，按樣品制備方法同法處理。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

精密量取0.1mLβ-受體激動(dòng)劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至1 0 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，得到濃度為1000ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

分別精密量取3種內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.10mL至同一10mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，得到濃度為1000ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液配制

精密量取1000ng/mL的外標(biāo)混合溶液0.20mL至10mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，得到濃度為20ng/mL的外標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

2.3.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液系列配制

分別精密量取不同體積的外標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液至6個(gè)10mL容量瓶，再分別精密加入1000ng/mL內(nèi)標(biāo)混合溶液0.05mL，然后再用甲醇定容至刻度，得到外標(biāo)濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0ng/mL和內(nèi)標(biāo)濃度均為5.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液系列。

2.4 液質(zhì)聯(lián)用儀工作條件

色譜柱：ACQUITY UPLC? BEH C18，(2.1×100mm,1.7μm) ；流動(dòng)相： 0.1%甲酸/水（A相）+0.1%甲酸/乙腈（B相），梯度洗脫條件見表1；流速：0.3mL/min；電離模式：ESI；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：MRM ，質(zhì)譜條件見表2；進(jìn)樣量：5.0μL 。

表1 梯度洗脫條件

表2 9種-受體激動(dòng)劑質(zhì)譜條件

2.5 9種-受體激動(dòng)劑總離子流圖（圖1）

圖1 9種-受體激動(dòng)劑總離子流圖

3 結(jié)果分析與討論

3.1 線性方程、方法檢出限和定量限

用LC-MS/MS對(duì)2.3.3項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液系列進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定2次。以相對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（y），以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

對(duì)2.2.3項(xiàng)下方法檢出限樣品進(jìn)行測(cè)定，9種β-受體激動(dòng)劑的信噪比均大于3，則9種β-受體激動(dòng)劑的檢出限為：=0.2ng/g=0.2μg/kg。對(duì)2.2.3項(xiàng)下方法定量限樣品進(jìn)行測(cè)定，9種β-受體激動(dòng)劑的信噪比均大于10，則9種β-受體激動(dòng)劑的定最限為：種β-受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限的測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 9種β-受體激動(dòng)劑的標(biāo)曲方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

從表3可以看出，9種β-受體激動(dòng)劑在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.996，檢出限均為0.2μg/kg，定量限均為0.5μg/kg。本研究中的方法檢出限和定量限與國家標(biāo)準(zhǔn)GB 31658.22-2022是一致的，說明本研究建立的方法能夠滿足國標(biāo)GB 31658.22-2022的要求。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)個(gè)別β-受體激動(dòng)劑比較容易殘留，因此標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)的濃度不易配制過大，且應(yīng)注意走完標(biāo)準(zhǔn)曲線后應(yīng)多進(jìn)幾針空白以降低或消除殘留。

3.2 方法回收率

對(duì)2.2.4項(xiàng)下低、中、高加標(biāo)樣品進(jìn)行測(cè)定，回收率結(jié)果如表4所示。

表4 9種β-受體激動(dòng)劑加標(biāo)回收率（n=6）

按照GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[14]中的質(zhì)量控制要求，當(dāng)被測(cè)組分含量小于0.1μg/mL(即小于100ng/mL)時(shí)，回收率應(yīng)在60%～120%的范圍內(nèi)。表4中9種β-受體激動(dòng)劑低、中、高的回收率在70.3%～100.1%之間，符合要求。本方法在樣品前處理時(shí)，在樣品中加入經(jīng)乙腈飽和的正己烷是為了除脂，并顯著減少脂質(zhì)和脂肪酸引起的離子抑制效應(yīng)[15]。

按照GB 31658.22-2022的方法制備樣品，由于樣品前處理較復(fù)雜且受到所使用的MCX陽離交換柱的柱效影響，目標(biāo)組分損失較大，造成加標(biāo)樣品的回收率略低于本研究的回收率。

3.3 樣品分析

從2022年的抽檢樣品中隨機(jī)抽取10批次豬肉樣品，按本研究制定的樣品前處理方法制備后進(jìn)行留樣再測(cè)，經(jīng)LC-MS/MS分析，結(jié)果表明10批次樣品中9種β-受體激動(dòng)劑均未檢出，與按國家標(biāo)準(zhǔn)GB 31658.22-2022進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果一致。

3.4 質(zhì)控樣分析

對(duì)2.2.5項(xiàng)下的質(zhì)控樣品進(jìn)行測(cè)定，帶入標(biāo)曲方程計(jì)算，測(cè)定結(jié)果如表5所示。

表5 4種β-受體激動(dòng)劑質(zhì)控樣測(cè)定結(jié)果

按照GB 31658.22-2022的方法處理質(zhì)控樣品，4種β-受體激動(dòng)劑的測(cè)定結(jié)果均在滿意值范圍內(nèi)；用本研究制定的方法對(duì)質(zhì)控樣處理后上機(jī)測(cè)定，4種β-受體激動(dòng)劑的測(cè)定結(jié)果也均在滿意值范圍內(nèi)，證明了該樣品前處理方法的適用性。在參加中國檢科院《豬肉中鹽酸克倫特羅的測(cè)定》能力驗(yàn)證活動(dòng)中，實(shí)驗(yàn)人員采用本研究制定的方法處理樣品后測(cè)定，取得了滿意結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究建立了一種液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定豬肉中9種β-受體激動(dòng)劑的樣品前處理方法，該方法的檢出限、定量限和加標(biāo)回收率均滿足相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)要求，質(zhì)控樣的測(cè)定值均在滿意值范圍之內(nèi)，說明建立的樣品前處理方法是可行的。該方法不用酶解，省時(shí)省力，大大降低了檢測(cè)成本，為動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)提供了參考和借鑒。