不同溫度處理對(duì)珠芽魔芋球莖休眠調(diào)控的影響

王蕊嘉,李文涵,趙青青,謝雨琪,李 緣,吳學(xué)尉

(云南大學(xué) 資源植物研究院,昆明 650091)

珠芽魔芋是天南星科(Araceae)魔芋屬(AmorphophallusBlume)多年生球莖植物,其葉柄分叉、裂葉交叉點(diǎn)上生長(zhǎng)有棕色氣生珠芽,是植物界唯一能夠在地下球莖產(chǎn)生大量葡甘聚糖(konjac glucomannan,KGM)的單子葉草本植物[1]。魔芋精粉在食品、醫(yī)藥、化工、航天等領(lǐng)域有極大的應(yīng)用前景[2-3]。與大多數(shù)球莖類植物一樣,珠芽魔芋具有休眠特性,其休眠期長(zhǎng)達(dá)4～6個(gè)月,致使出苗率不整齊,產(chǎn)量不穩(wěn)定[4]。珠芽魔芋的休眠屬于生理休眠,是由植物內(nèi)部的生理因素所調(diào)控,即使在環(huán)境條件有利的情況下,休眠的球莖也不能萌發(fā),只有經(jīng)過(guò)一定時(shí)期的低溫處理后才能打破休眠,開(kāi)始萌發(fā)[5-8]。溫度變化引起球莖呼吸代謝物質(zhì)改變,球莖中含有大量淀粉,在打破休眠轉(zhuǎn)向萌發(fā)的過(guò)程中淀粉粒數(shù)量發(fā)生改變,并以可溶性糖(蔗糖、葡萄糖和果糖)的形式從球莖貯藏組織轉(zhuǎn)移到莖、根等各種器官中,成為細(xì)胞生長(zhǎng)和維持滲透壓所需物質(zhì)[9-11]。例如,馬鈴薯在16 ℃低溫打破休眠過(guò)程中,其塊莖淀粉含量逐漸下降,可溶性糖含量增加[12];大蒜氣生鱗莖在4℃低溫處理28 d后打破休眠效果最佳,其可溶性糖含量隨著時(shí)間的增加逐漸積累[13]。

球莖的休眠和萌發(fā)是2個(gè)獨(dú)立但連續(xù)的生理學(xué)過(guò)程,主要受到脫落酸(abscisicacid,ABA)和赤霉素(gibberellin,GA)2 種植物激素的調(diào)控。低溫和GA3處理會(huì)引起紫斑牡丹內(nèi)源激素發(fā)生轉(zhuǎn)變,使其向生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而促進(jìn)植株提前萌發(fā)[14]。在植物休眠過(guò)程中,ABA 含量逐漸增多,達(dá)到峰值后植物進(jìn)入休眠狀態(tài)[15]。ABA 合成途徑的關(guān)鍵限速酶是位于葉綠體類囊體膜和基質(zhì)上的9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarote noid dioxygenase,NCED),對(duì)ABA 的合成進(jìn)行調(diào)控[16]。在獼猴桃等水果中,NCED基因的表達(dá)量于果實(shí)成熟期間達(dá)到峰值,并與ABA 達(dá)到峰值的趨勢(shì)一致,說(shuō)明NCED可以調(diào)控ABA 的含量[17-19]。ABA 降解代謝主要有氧化降解和結(jié)合降解2種形式[20]。通過(guò)ABA 8′羥化酶的催化,形成ABA 8′甲基羥化反應(yīng),進(jìn)而生成8′-羥基-ABA (8′-OH-ABA),但8′-羥基-ABA 并不穩(wěn)定,容易產(chǎn)生自發(fā)異構(gòu)化,最終形成二氫紅花菜豆酸(dihydro-phaseic acid)[21]。ABA 8′羥化酶來(lái)源于CYP450單加氧酶超家族,其編碼的基因家族為CYP707A 家族[22]。茶樹(shù)CsCYP707A3基因經(jīng)過(guò)4 ℃低溫處理后表達(dá)量上調(diào),經(jīng)過(guò)38 ℃ 處理后表達(dá)量下調(diào)[23]。AtCYP707Aa1-1和AtCYP707Aa2-1在擬南芥突變體植株中的表達(dá)量分別是野生型的7倍和5倍,且在AtCYP707A2過(guò)表達(dá)擬南芥中,其ABA 含量低于野生型擬南芥,其休眠期比野生型擬南芥縮短,有利于打破休眠,促進(jìn)萌發(fā)[24-25]。

溫度是影響珠芽魔芋休眠調(diào)控的關(guān)鍵因素之一。本研究通過(guò)不同溫度處理珠芽魔芋球莖,旨在尋找有利于打破珠芽魔芋休眠的最適溫度,探討不同溫度影響珠芽魔芋球莖休眠的生物表型變化、內(nèi)源生理代謝物質(zhì)及其分子調(diào)控機(jī)理,為今后使用生物技術(shù)手段調(diào)控和改良珠芽魔芋休眠期提供理論基礎(chǔ),也為解決珠芽魔芋因休眠導(dǎo)致的休眠期過(guò)長(zhǎng)、出苗率不齊等問(wèn)題提供合理的技術(shù)保障。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

所有珠芽魔芋球莖從葉面摘下后,選取重量在6～12 g無(wú)病害、無(wú)破損的健康珠芽魔芋球莖。由前期預(yù)實(shí)驗(yàn)可知,魔芋貯藏期的適宜溫度為9～25℃,低于9 ℃珠芽魔芋球莖將會(huì)凍傷,但采用相對(duì)高溫催芽的方式在馬鈴薯塊莖催芽中有過(guò)報(bào)道。本研究先進(jìn)行不同溫度處理,以打破球莖休眠。即分別在24 ℃/9 ℃(D24/9℃)、24 ℃/13 ℃(D24/13℃)、24℃/17 ℃(D24/17℃)的晝/夜變溫,9 ℃(D9℃)、13 ℃(D13℃)、17 ℃(D17℃)、21 ℃(D21℃)的恒溫以及室溫(Droom,約10 ℃)條件下處理珠芽魔芋球莖,然后分別將以上溫度處理后的珠芽魔芋球莖置于26 ℃(G26℃)、33 ℃(G33℃)條件下進(jìn)行催芽處理,共組成16個(gè)(8×2)處理組合。

每個(gè)溫度處理放置300個(gè)珠芽魔芋球莖,總共處理120 d。根據(jù)溫度處理后珠芽魔芋球莖的表型變化,本試驗(yàn)將所處理的珠芽魔芋球莖根據(jù)處理時(shí)間分為6個(gè)時(shí)期,即休眠Ⅰ期(打破休眠處理30 d);休眠Ⅱ期(打破休眠處理60 d);萌發(fā)前期(催芽處理15 d);萌發(fā)中期(催芽處理22 d);萌發(fā)后期(催芽處理28 d);萌發(fā)末期(催芽處理40 d)。每個(gè)時(shí)期每個(gè)處理取樣9個(gè)珠芽魔芋球莖。分別在珠芽魔芋球莖的休眠 Ⅰ 期、休眠 Ⅱ 期、萌發(fā)初期、萌發(fā)中期、萌發(fā)后期、萌發(fā)末期對(duì)其進(jìn)行取材并拍照觀察。

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1發(fā)芽率和出芽比

自貯藏開(kāi)始每天1次觀察珠芽魔芋球莖生物表型變化,記錄不同溫度處理后珠芽魔芋球莖芽點(diǎn)的變化情況,待芽點(diǎn)冒出新芽后統(tǒng)計(jì)其發(fā)芽數(shù)量及其變化規(guī)律,最后計(jì)算發(fā)芽率(發(fā)芽球莖數(shù)/300×100%)。同時(shí),固定選取12個(gè)珠芽魔芋球莖,在不同溫度處理后6個(gè)時(shí)期,觀察記錄其新芽(頂破球莖表皮的芽體)占總芽孔的比率(新芽數(shù)/總芽孔數(shù)),即為出芽比(%)。

1.2.2球莖質(zhì)量

固定選取12個(gè)珠芽魔芋球莖,在不同溫度處理后6個(gè)時(shí)期,使用電子天平稱量其質(zhì)量(g)并記錄貯藏期間的質(zhì)量變化。

1.2.3葡萄糖含量

將分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至620 nm,將2 mL H2O加入5 mL蒽酮溶液調(diào)零。取1.2 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液(蒽酮溶液做空白),在620 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)及空白吸光度值D標(biāo)準(zhǔn)和D空白,并計(jì)算△D(D標(biāo)準(zhǔn)-D空白)。以0,20,40,60,80,100 mg/g葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液為橫坐標(biāo)(x),以ΔD為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程y=kx+b,將樣品溶液實(shí)測(cè)的ΔD代入方程得到葡萄糖含量(mg/g)。

1.2.4淀粉含量

取不同溫度處理6個(gè)時(shí)期的樣品(每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)),每個(gè)樣品研磨混樣取0.1 g,加入5 mL 80%乙醇,80 ℃水浴30 min后,3 000 r/min離心10 min;去上清留沉淀,加入5 mL 雙蒸水,在沸水中煮15 min,待冷卻后加入0.5 mL 高氯酸,60℃水浴15 min,中途應(yīng)上下?lián)u晃顛倒6次,且每次都搖勻,3 000 r/min 離心10 min;取上清液0.1 mL,加入0.9 mL雙蒸水,再加入5 mL 0.2%蒽酮硫酸溶液,沸水煮10 min;冷卻后,在分光光度計(jì)上測(cè)定吸光度值,并進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù),記錄結(jié)果。按照相關(guān)公式計(jì)算淀粉含量(mg/g)。

1.2.5可溶性糖含量

取不同溫度處理6個(gè)時(shí)期的樣品,每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。每個(gè)樣品研磨混樣取0.1 g,加入5 mL 80%乙醇,80 ℃水浴30 min后,3 000 r/min離心10 min,取上清液1 mL,加入5 mL 0.2%蒽酮硫酸溶液,沸水煮10 min,冷卻后,在分光光度計(jì)上測(cè)定吸光度值,按照相關(guān)公式計(jì)算可溶性糖含量(mg/g)。

1.2.6ABA含量

取在液氮中迅速研磨的珠芽魔芋球莖勻漿樣品0.05 g,使用上海酶聯(lián)生物植物激素脫落酸(ABA)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒,應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定不同溫度處理不同時(shí)期珠芽魔芋球莖中ABA含量。

1.2.7GA3 含量

取在液氮中迅速研磨的珠芽魔芋球莖勻漿樣品0.05 g,使用上海酶聯(lián)生物植物赤霉素(GA3)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒,應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定不同溫度處理不同時(shí)期珠芽魔芋球莖中GA3含量。

1.2.8球莖休眠調(diào)控相關(guān)基因克隆和表達(dá)分析

(1)基因克隆:使用華越洋生物有限公司的快速通用植物RNA 提取試劑盒提取總RNA,并根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整,每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)重復(fù),并使用TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Code NO.RR047)按照說(shuō)明書(shū)將 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。利用Primer 6.0設(shè)計(jì)引物,根據(jù)課題珠芽魔芋轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中CYP707A基因的cDNA 序列,在起始密碼子和終止密碼子位置設(shè)計(jì)引物(表1),PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn),觀測(cè)條帶是否正確,若條帶位置正確,則將膠回收連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌,搖菌測(cè)序?qū)Ρ冉Y(jié)果。

表1 CYP707A 基因引物序列Table 1 Primer sequences for CYP707A gene

(2)基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè):利用ProtParam 軟件對(duì)CYP707A 蛋白進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析;利用SignaIP-4.1 分析工具對(duì)CYP707A 蛋白性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè);利用TMHMM 法分析CYP707A 蛋白是否存在跨膜區(qū);利用PSIPRED 預(yù)測(cè)CYP707A 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu);利用SWISS-MODEL 同源建模預(yù)測(cè)CYP707A 的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

(3)qRT-PCR:利用Primer 6.0設(shè)計(jì)珠芽魔芋球莖休眠相關(guān)基因qPCR引物序列(表2);使用華越洋生物有限公司的快速通用植物RNA 提取試劑盒提取總RNA;并使用TaKaRa 的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Code NO.RR047)按照說(shuō)明書(shū)將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA;qRTPCR在美國(guó)Applied Biosystems公司實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀ABI7500上進(jìn)行,以魔芋EF1α為內(nèi)參基因,對(duì)珠芽魔芋球莖的NCED基因和CYP707A基因,使用南京Vazyme生物的2×AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q511-02/03)試劑盒的SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。

表2 qRT-PCR 的引物序列Table 2 Primer sequences for qRT-PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2021進(jìn)行記錄,使用GraphPad Prism 8.0.1 進(jìn)行分析及做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度處理對(duì)不同時(shí)期珠芽魔芋球莖質(zhì)量的影響

不同溫度處理珠芽魔芋球莖的質(zhì)量均隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低,在不同時(shí)期并沒(méi)有因?yàn)槌掷m(xù)的低溫或高溫而產(chǎn)生驟降,沒(méi)有損傷珠芽魔芋球莖。26 ℃催芽處理(圖1,A)的珠芽魔芋球莖的質(zhì)量在不同時(shí)期相比相應(yīng)的33 ℃催芽處理(圖1,B)均更為穩(wěn)定,且33 ℃催芽處理的珠芽魔芋球莖質(zhì)量在萌發(fā)末期下降速率較快。同時(shí),不同溫度處理珠芽魔芋球莖的質(zhì)量在26 ℃催芽處理下差異相對(duì)明顯,在33 ℃催芽處理下差異相對(duì)較小(圖1)。以上結(jié)果表明,本試驗(yàn)過(guò)程中處理溫度設(shè)置合理,沒(méi)有對(duì)參試珠芽魔芋球莖造成損傷。

圖1 不同休眠溫度和催芽溫度組合處理下珠芽魔芋球莖質(zhì)量的變化D24/9℃,D24/13℃,D24/17℃,D9℃,D13℃,D17℃,D21℃,Droom stand for day/night temperature (24 ℃/9 ℃,24 ℃/13 ℃,24 ℃/17 ℃),constant temperature (9 ℃,13 ℃,17 ℃,21 ℃) and room temperature treatments during the dormancy period,while G26℃and G33℃ stand for high temperature (26 ℃ and 33 ℃) treatments during the germination period.The same as below.Fig.1 The mass changes of konjac bulbil under different dormant temperature and germination temperature combinations

2.2 不同溫度處理對(duì)珠芽魔芋球莖發(fā)芽率的影響

8個(gè)休眠溫度處理珠芽魔芋球莖在26 ℃催芽處理后,其發(fā)芽速率以D13℃+G26℃處理的最快,在處理83 d達(dá)到最大值,而以Droom+G26℃處理的最慢,在處理86 d達(dá)到最大值(圖2,A);8個(gè)休眠溫度處理珠芽魔芋球莖在33 ℃催芽處理后,其珠芽魔芋球莖出芽以D21℃+G33℃處理最快,在處理80 d達(dá)到最大值,而以D9℃+G33℃處理最慢,在處理87 d達(dá)到最大值,而且D9℃+G33℃處理珠芽魔芋球莖發(fā)芽率低于其他所有溫度處理,其發(fā)芽率僅有75%(圖2,B);進(jìn)一步比較26 ℃和33 ℃催芽下的最佳處理組合發(fā)芽時(shí)間可知,33 ℃最佳催芽處理(D21℃+G33℃)的發(fā)芽時(shí)間比26 ℃最佳催芽處理(D13℃+G26℃)快3 d,33 ℃最佳催芽處理的發(fā)芽時(shí)間比其最差催芽處理(D9℃+G33℃)快7 d。

圖2 各休眠處理溫度和催芽處理溫度組合下珠芽魔芋球莖發(fā)芽率的變化Fig.2 The changes in germination rate of konjac bulbil under different dormant temperature and germination temperature combinations

2.3 不同溫度處理對(duì)休眠期和萌發(fā)期珠芽魔芋球莖淀粉、可溶性糖含量的影響

在休眠期,經(jīng)不同溫度處理后,珠芽魔芋球莖淀粉含量整體上表現(xiàn)為休眠期Ⅱ期均低于休眠Ⅰ期,且D13℃和D24℃/13℃處理的下降速率明顯高于其他溫度處理;在休眠Ⅰ和Ⅱ期,珠芽魔芋球莖淀粉含量均以D17℃處理最高,以D24℃/17℃處理最低,其余溫度處理居中(圖3,A)。

圖3 不同溫度處理下休眠期珠芽魔芋球莖淀粉和可溶性糖含量的變化Ⅰ and Ⅱ represent the dormancy stage Ⅰ and Ⅱ.The different normal letters within the same treatment temperature indicate significant difference between stages at 0.05 level.The same as below.Fig.3 Changes of starch and soluble contents in konjac bulbil treated with different temperatures during dormant period

與此同時(shí),珠芽魔芋球莖可溶性糖含量整體上表現(xiàn)為休眠期Ⅱ期均高于休眠Ⅰ期,且D21℃處理上升速率最高,D13℃處理上升速率次之,其他溫度處理的上升速率比較平穩(wěn);在休眠Ⅰ和Ⅱ期,珠芽魔芋球莖可溶性糖含量均以D13℃處理最高,與其他溫度處理存在明顯差異(圖3,B)。

在萌發(fā)期,打破休眠過(guò)程中珠芽魔芋球莖淀粉含量降低速率較大的處理D13℃、D24℃/13℃,及其可溶性糖含量升高速率較大的處理D21℃、D24℃/17℃,經(jīng)后期G26℃、G33℃催芽處理后,它們的珠芽魔芋球莖淀粉和可溶糖含量的測(cè)定結(jié)果(圖4)顯示,前期采用恒溫處理打破休眠的,經(jīng)后期高溫催芽處理的珠芽魔芋球莖淀粉和可溶性糖含量在萌發(fā)前期與萌發(fā)后期之間均存在顯著性差異(P＜0.05);而在前期采用晝夜變溫處理打破休眠的,經(jīng)后期高溫催芽處理的珠芽魔芋球莖淀粉含量在萌發(fā)前期與萌發(fā)后期之間沒(méi)有顯著性變化(P＞0.05),但其可溶性糖含量在萌發(fā)前期與萌發(fā)后期之間仍存在顯著性差異(P＜0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明隨著珠芽魔芋球莖打破休眠,其淀粉含量降低,可溶性糖含量增加,并以13℃恒溫處理的珠芽魔芋球莖淀粉含量下降最快,可溶性糖含量最高。

圖4 不同溫度處理下萌發(fā)期珠芽魔芋球莖淀粉和可溶性糖含量變化Different lowercase letters within same treatment indicate significant difference between early and later periods at 0.05 level (P＜0.05).Fig.4 Changes of starch and soluble sugar contents in konjac bulbil treated by different temperatures during germination period

2.4 不同溫度處理對(duì)珠芽魔芋球莖出芽比的影響

前期低溫打破休眠,后期經(jīng)26 ℃催芽處理后,以D13℃+G26℃處理組合的珠芽魔芋球莖出芽比(新芽占芽孔的比率)最高,這與26 ℃催芽處理后,D13℃+G26℃處理發(fā)芽速率最快的結(jié)果一致(圖5,A);在前期低溫打破休眠,后期經(jīng)33 ℃催芽處理后,整體上出芽比較高(圖5,B)。另外,進(jìn)一步對(duì)比前期恒溫、晝/夜變溫打破休眠,后期經(jīng)26 ℃、33 ℃催芽處理的珠芽魔芋球莖出芽比結(jié)果可以看出,前期低溫打破休眠時(shí),使用恒溫處理的珠芽魔芋球莖出芽比更佳(圖5)。

圖5 不同溫度處理下珠芽魔芋球莖出芽比變化Fig.5 Changes of sprouting ratio of konjac bulbil under different temperature treatments

2.5 不同溫度處理對(duì)珠芽魔芋球莖ABA 和GA3含量的影響

休眠期珠芽魔芋球莖ABA 含量隨著處理時(shí)間逐漸增加,而其GA3含量隨著處理時(shí)間逐漸減少。對(duì)比打破休眠最快的D21℃處理和最慢的Droom處理的珠芽魔芋球莖ABA 和GA3含量(圖6,A、B)可知,在休眠Ⅰ期和休眠Ⅱ期,D13℃和D21℃處理珠芽魔芋球莖ABA 含量均明顯低于Droom處理;在相同溫度處理下,休眠Ⅱ期珠芽魔芋球莖ABA 含量在D13℃處理下顯著低于休眠Ⅰ期,在D21℃處理下顯著高于休眠Ⅰ期(P＜0.05),而在Droom處理下沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。在休眠Ⅰ期和休眠Ⅱ期,珠芽魔芋球莖GA3含量在D13℃和D21℃處理下同樣低于Droom處理;在相同溫度處理下,休眠Ⅱ期珠芽魔芋球莖GA3含量在D13℃處理下顯著高于休眠Ⅰ期,在D21℃和Droom處理下均顯著低于休眠Ⅰ期(P＜0.05)。

圖6 不同溫度處理下珠芽魔芋球莖休眠期的ABA 和GA3 含量The different normal letters within the same temperature treatment indicate significant difference between stages at 0.05 level (P＜0.05)Fig.6 The ABA and GA3 contents in konjac bulbil treated by different temperatures during dormant period

珠芽魔芋萌發(fā)期球莖ABA含量在不同催芽溫度處理下均表現(xiàn)出先升后降的單峰變化趨勢(shì),其GA3含量在26 ℃催芽處理下也先升后降,而在33 ℃催芽處理下逐漸升高(圖7,A、B)。其中,珠芽魔芋ABA含量在萌發(fā)前期和萌發(fā)后期均表現(xiàn)為33 ℃催芽處理

2.6 珠芽魔芋球莖調(diào)控相關(guān)基因克隆、鑒定及表達(dá)

2.6.1 CYP707A基因克隆、鑒定

以3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的珠芽魔芋球莖cDNA 為模板,利用已設(shè)計(jì)的CYP707A基因引物,PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳。結(jié)果顯示,3個(gè)生物重復(fù)均得到2 000 bp附近的單一條帶(圖8)。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后,連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌,搖菌后挑菌測(cè)序得到1 965 bp 的序列,開(kāi)放閱讀框(open reading frame ORF)為1 221 bp,序列對(duì)比一致性為99.59%(圖9)。

圖8 CYP707A 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.8 PCR amplification results of CYP707A gene

圖9 測(cè)序結(jié)果序列對(duì)比圖Fig.9 Sequence comparison plot

利用ProtParam 軟件對(duì)CYP707A蛋白進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析,結(jié)果表明,其氨基酸數(shù)目為386,共含有賴氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、蛋氨酸(Met)、蘇氨酸(Thr)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)、精氨基酸(Arg)、組氨基酸顯著高于26 ℃催芽處理(P＜0.05),在萌發(fā)中期2種溫度處理之間沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05);珠芽魔芋球莖GA3含量在萌發(fā)初期表現(xiàn)為26 ℃催芽處理顯著高于33 ℃催芽處理,在萌發(fā)中期和后期2種催芽溫度處理之間均無(wú)顯著性差異。(His)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)、天門冬酰胺(Asn)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Try)和絲氨酸(Ser)20種氨基酸,其中精氨酸(Arg)占比最高為16.40%,酪氨酸(Tyr)占比最低為0.8%。

CYP707A 蛋白分子式為C2945H4621N1007O790S42,分子質(zhì)量為68 120.88,總原子數(shù)為9 405,等電點(diǎn)為11.88,脂肪系數(shù)為43.96,正電荷殘基數(shù)為20,總平均親水性為-0.684,負(fù)電荷殘基數(shù)為109。進(jìn)一步利用SignaIP-4.1分析工具對(duì)CYP707A 蛋白性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),CYP707A 蛋白為非分泌性蛋白,不存在信號(hào)肽(圖10,A);利用TMHMM 法分析表明CYP707A 蛋白不存在跨膜區(qū)(圖10,B)。

圖10 CYP707A 蛋白性質(zhì)預(yù)測(cè)(A)和跨膜區(qū)預(yù)測(cè)(B)Fig.10 CYP707A protein property prediction (A) and transmembrane region prediction (B)

利用PSIPRED預(yù)測(cè)CYP707A 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)卷曲的形式(圖11,A),利用SWISS-MODEL同源建模預(yù)測(cè)CYP707A 的三級(jí)結(jié)構(gòu),其三級(jí)結(jié)構(gòu)為單體結(jié)構(gòu)(圖11,B)。

圖11 CYP707A 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(A)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(B)預(yù)測(cè)圖Fig.11 Prediction of the secondary (A) and tertiary (B) structures of the protein CYP707A

2.6.2休眠調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)分析

以EF1α為內(nèi)參基因,不同溫度處理后不同時(shí)期珠芽魔芋球莖的NCED和CYP707A基因的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖12。

圖12 不同溫度處理不同時(shí)期珠芽魔芋球莖中NCED(A、B)和CYP707A(C、D)基因的表達(dá)量D1 and D2 stand for dromancy Ⅰ and Ⅱ stage,while GE,GM,GL,GT stand for early,midde,later,terminal germinalion stages,respectively.Fig.12 NCED (A,B) and CYP707A (C,D) gene expression in konjac bulbil under different temperatures at different developmental stages

其中,NCED基因的相對(duì)表達(dá)量隨著休眠的加深逐漸增加,而在萌發(fā)期逐漸減少;Droom+G26℃處理的珠芽魔芋球莖NCED基因表達(dá)量均始終高于相應(yīng)最佳處理溫度D13℃+G26℃;由此推測(cè)珠芽魔芋球莖NCED基因會(huì)維持休眠,抑制萌發(fā)(圖12,A)。

同時(shí),珠芽魔芋球莖的CYP707A基因相對(duì)表達(dá)量隨著休眠加深逐漸減少,卻在萌發(fā)期逐漸增加;最佳溫度處理的珠芽魔芋球莖CYP707A基因表達(dá)量均始終高于室溫+催芽處理;由此推測(cè)CYP707A基因的表達(dá)能夠打破珠芽魔芋球莖休眠,促進(jìn)其萌發(fā)(圖12,B)。

3 討論

溫度是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的環(huán)境因子,對(duì)球莖植物打破休眠和萌發(fā)起著關(guān)鍵作用[26-27]。在本研究中也發(fā)現(xiàn),溫度不僅影響著珠芽魔芋球莖休眠調(diào)控,也使珠芽魔芋球莖表型、內(nèi)源生理特征以及休眠相關(guān)基因表達(dá)量發(fā)生改變,是影響珠芽魔芋休眠的關(guān)鍵因子。研究表明,卷丹百合珠芽在5 ℃低溫層積處理下最有利于打破休眠[28];蘭州百合在23 ℃/18 ℃、18 ℃/13 ℃和13 ℃/8 ℃晝/夜變溫處理135 h 皆可以打破休眠,并以晝/夜溫18 ℃/13℃處理打破休眠的效果最佳[29];溫度保持在10～13℃有益于魔芋打破休眠,產(chǎn)生新芽[30]。本研究對(duì)比休眠期晝/夜變溫(24 ℃/9 ℃、24 ℃/13 ℃、24 ℃/17 ℃)和恒溫(9 ℃、13 ℃、17 ℃、21 ℃)處理珠芽魔芋球莖的萌發(fā)結(jié)果發(fā)現(xiàn),恒溫13 ℃處理最有利于珠芽魔芋打破休眠,33 ℃催芽處理更有利于珠芽魔芋球莖的萌發(fā)。

據(jù)報(bào)道,馬鈴薯經(jīng)過(guò)室溫和20 ℃恒溫處理的出芽數(shù)明顯高于1.5 ℃處理[31];唐菖蒲通過(guò)5 ℃低溫處理40 d后,新芽的數(shù)量最多,芽長(zhǎng)均達(dá)到1 cm[32]。本試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn),珠芽魔芋球莖上具有很多芽孔,但并不是所有芽孔都能長(zhǎng)出新芽。珠芽魔芋起源于印度尼西亞熱帶叢林地區(qū),所以其生境決定了其生長(zhǎng)發(fā)育所需溫度較高,且常年處于溫?zé)岘h(huán)境中,晝夜溫差變化不大,氣溫相對(duì)恒定。本研究結(jié)果表明前期低溫處理打破催眠時(shí),恒溫處理會(huì)誘導(dǎo)珠芽魔芋球莖出芽數(shù)量更多。

植物休眠的內(nèi)在生理變化受到物質(zhì)代謝的影響[33-34]。休眠期碳水化合物與其物質(zhì)代謝有關(guān),而可溶性糖和淀粉是植物營(yíng)養(yǎng)組織中碳水化合物的主要儲(chǔ)存形式[35-36]。本研究發(fā)現(xiàn),休眠期珠芽魔芋球莖淀粉含量不斷下降,可溶性糖含量不斷上升;萌發(fā)期珠芽魔芋球莖淀粉含量也在下降,可溶性糖含量不斷上升,且恒溫處理的球莖淀粉含量比晝夜變溫處理的下降速率更快,而其可溶性糖含量比晝夜變溫處理的上升速率更快。許多研究表明桃、歐李等植物在打破休眠過(guò)程中,其淀粉含量逐漸下降,而可溶性糖含量逐漸上升[37-38],本研究中珠芽魔芋球莖可溶性糖和淀粉含量的變化與之相符,但球莖中其他糖類物質(zhì)的代謝特征還有待進(jìn)一步研究。

ABA、GA3兩類激素含量的變化會(huì)影響珠芽魔芋球莖休眠。球莖休眠過(guò)程中低溫處理會(huì)使ABA含量增加,而GA3含量下降[39]。本研究中休眠期珠芽魔芋球莖的ABA 含量不斷增多,GA3含量不斷減少。前人的研究表明[40],當(dāng)植物受到各種環(huán)境脅迫(如干旱、溫度等)時(shí),其體內(nèi)ABA 會(huì)合成和積累,ABA 含量增加,本研究中不同溫度處理珠芽魔芋球莖后,其萌發(fā)期ABA 含量呈現(xiàn)“先升后降”的規(guī)律,本試驗(yàn)結(jié)論與前人研究結(jié)論相符。33 ℃處理萵苣后,在休眠后期積累大量的內(nèi)源激素GA3,將會(huì)打破休眠,進(jìn)而開(kāi)始萌發(fā)[40],本試驗(yàn)中,經(jīng)過(guò)不同溫度處理珠芽魔芋球莖后,萌發(fā)期珠芽魔芋球莖GA3含量呈現(xiàn)“先升后降”的規(guī)律,萌發(fā)后期球莖GA3含量最高,且存在顯著性差異,結(jié)論與之相符。在萵苣(Lactucasativa)中,溫度通過(guò)誘導(dǎo)NCED4調(diào)節(jié)ABA 合成,而通過(guò)細(xì)胞色素CYP707A2調(diào)節(jié)ABA 分解[41]。番茄SlNCED1基因是調(diào)控ABA合成的關(guān)鍵基因,而SlCYP707A2是調(diào)控ABA 分解代謝的關(guān)鍵基因,在番茄成熟過(guò)程中分別作為正調(diào)控因子和負(fù)調(diào)控因子發(fā)揮作用[42]。本研究中NCED基因表達(dá)量在珠芽魔芋休眠期增加,而在萌發(fā)期減少,CYP707A基因表達(dá)量卻在休眠期減少,在萌發(fā)期增加。NCED、CYP707A兩個(gè)基因可以作為珠芽魔芋球莖休眠和萌發(fā)過(guò)程中的關(guān)鍵基因,或?yàn)榍蚯o休眠和萌發(fā)的標(biāo)志基因,這對(duì)以后研究珠芽魔芋休眠相關(guān)機(jī)理具有重要意義,但與GA3合成相關(guān)調(diào)控途徑及作用基因還待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究以珠芽魔芋葉面球莖為材料,在球莖休眠期設(shè)置晝/夜變溫、恒溫及室溫處理,萌發(fā)期設(shè)置不同溫度催芽處理,分析了各處理珠芽魔芋球莖在休眠期以及萌發(fā)期的生物表型、內(nèi)源淀粉、可溶性糖、ABA、GA3含量及其休眠調(diào)控相關(guān)基因的變化情況。結(jié)果表明,珠芽魔芋打破休眠的最佳溫度為恒溫13 ℃,促進(jìn)萌發(fā)的最佳溫度為33 ℃;隨著珠芽魔芋打破休眠,球莖中的淀粉含量降低,可溶性糖含量升高,ABA 含量先升后降,GA3含量先降后升;NCED和CYP707A基因可能是珠芽魔芋休眠調(diào)控中的關(guān)鍵基因,它們可以作為珠芽魔芋球莖休眠的生物標(biāo)志物來(lái)使用。該研究結(jié)果為珠芽魔芋產(chǎn)業(yè)化發(fā)展措施制定,以及通過(guò)生理、基因敲除和過(guò)表達(dá)等手段提早打破珠芽魔芋球莖休眠提供理論依據(jù)。