米糠蛋白復(fù)合戊聚糖糖基化反應(yīng)條件的優(yōu)化及性質(zhì)研究

冷雪冬, 孫華軍, 朱 磊, 陳明明, 宋 妍, 楊斯琪, 錢麗麗,2,3

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1,大慶 163319)

(國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心2,大慶 163319)

(黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3,大慶 163319)

米糠是稻米加工的副產(chǎn)物,其中的營(yíng)養(yǎng)成分占稻谷中總營(yíng)養(yǎng)成分的64%[1],是一種廉價(jià)的蛋白質(zhì)來(lái)源,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%～16%。米糠蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白[2],主要是由清蛋白(37%)、球蛋白(36%)、醇溶蛋白(5%)、谷蛋白(22%)組成。米糠蛋白具有生物效價(jià)高等特點(diǎn),在營(yíng)養(yǎng)方面具有優(yōu)越性,氨基酸組成合理平衡,相比而言賴氨酸和蘇氨酸含量更高,是嬰兒和特殊人群營(yíng)養(yǎng)食品的合適成分[3-7]。由于米糠蛋白的一些功能特性較差,因此采用糖基化方法改善米糠蛋白的功能特性(例如溶解性、乳化性、起泡性等),眾多研究表明糖基化改性能對(duì)蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)進(jìn)行改善[8,9],并且反應(yīng)條件簡(jiǎn)單、迅速。

蛋白質(zhì)改性方法主要有物理方法、化學(xué)方法和生物酶法[10]。物理方法是通過(guò)適度的熱變性、擠壓膨化和超高壓等方法改變蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)和分子間的聚集方式,從而改善蛋白的功能性質(zhì)[11];化學(xué)方法包磷酸化、糖基化、脫酰胺化和共價(jià)交聯(lián)作用等方法改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來(lái)改善其功能特性[12];生物酶法主要有蛋白酶、過(guò)氧化物酶等,通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的斷裂、分子交聯(lián)或?qū)?cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行修飾,從而改變蛋白質(zhì)分子的組成及理化性質(zhì)影響其功能特性[13]。糖基化是將糖鏈以共價(jià)鍵的形式與蛋白質(zhì)分子上的氨基相連接而形成糖蛋白,此反應(yīng)僅在加熱條件下自發(fā)進(jìn)行不需添加催化劑[14]。戊聚糖具有多種生理活性,有益于促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌及乳桿菌的繁殖[15-17]、降血糖[18-20]等。糖基化反應(yīng)使其米糠蛋白分子中插入羥基從而改善蛋白質(zhì)的溶解度、起泡性和乳化性能等。

本實(shí)驗(yàn)選用米糠蛋白和戊聚糖進(jìn)行糖基化反應(yīng),制備米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物,通過(guò)在不同的反應(yīng)條件(pH、溫度、時(shí)間、米糠蛋白-戊聚糖比例)對(duì)該接枝反應(yīng)進(jìn)行分析,在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面分析,得出最優(yōu)的米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物制備工藝參數(shù)。并對(duì)米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物和米糠蛋白的褐變程度、溶解性進(jìn)行比較,以期為米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物的制備及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠蛋白(純度90%)、戊聚糖(純度98%)。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、四硼酸鈉,均為分析純;鄰苯二甲醛(o-Phthalic Aldehyde,OPA)、十二烷基硫酸鈉(SDS),分析純,β-巰基乙醇,生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA-120.4電子天平,SYG-1210恒溫水浴鍋,UV-2008紫外分光光度計(jì),HJ-3恒溫磁力攪拌器,ALPHA1-2真空冷凍干燥機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物的制備

稱取一定量的米糠蛋白,溶于pH=10的磷酸緩沖溶液中,使其體積分?jǐn)?shù)為1%,磁力攪拌30 min以充分溶解。將不同比例米糠蛋白(1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)與戊聚糖充分混合,進(jìn)行磁力攪拌,反應(yīng)的時(shí)間和溫度不同。將樣品錐形瓶放置在60 ℃的水浴鍋中保溫反應(yīng)90 min,反應(yīng)過(guò)程中每隔15 min取樣測(cè)定褐變值。樣品置于3 500 r/min離心20 min除去不溶性物質(zhì),進(jìn)行冷凍干燥。

1.3.2 米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物接枝度的測(cè)定

接枝度(DG)采用鄰苯二醛(OPA)法[21]測(cè)定:稱取80 mg OPA,在2 mL甲醇溶液中攪拌;將50 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉溶液、5 mL 200 mg/mL SDS溶液、200 μLβ-巰基乙醇充分混勻,加入OPA甲醇溶液攪拌,定容至100 mL于棕色瓶中。樣品測(cè)定時(shí),稱取4.00 mL OPA溶液,加入200 μL樣品溶液,置于35 ℃水浴中2 min后測(cè)定340 nm處吸光值。用去離子水做為空白對(duì)照組。接枝度(DG)按公式進(jìn)行計(jì)算:

式中:A0為反應(yīng)前溶液吸光度值;A1為取樣樣品溶液吸光度值。

1.3.3 米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 溶液pH對(duì)接枝反應(yīng)的影響

固定蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%,設(shè)置pH分別為7、8、9、10、11作為實(shí)驗(yàn)條件,其他條件為反應(yīng)時(shí)間60 min、反應(yīng)溫度40 ℃及米糠蛋白復(fù)合戊聚糖比例為1∶2,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察不同pH對(duì)接枝度的影響。

1.3.3.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)接枝反應(yīng)的影響

固定蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%,設(shè)置反應(yīng)時(shí)間分別為30、40、50、60、70、80 min作為實(shí)驗(yàn)條件,其他條件為pH=10、反應(yīng)溫度40 ℃及米糠蛋白復(fù)合戊聚糖比例為1∶2,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)接枝度的影響。

1.3.3.3 反應(yīng)溫度對(duì)接枝反應(yīng)的影響

固定蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%,設(shè)置反應(yīng)溫度分別為20、30、40、50、60、70、80 ℃作為實(shí)驗(yàn)條件,其他條件為pH=10、反應(yīng)時(shí)間60 min及米糠蛋白復(fù)合戊聚糖比例為1∶2,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察不同反應(yīng)溫度對(duì)接枝度的影響。

1.3.3.4 米糠蛋白復(fù)合戊聚糖比例對(duì)接枝反應(yīng)的影響

固定蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%,設(shè)置米糠蛋白復(fù)合戊聚糖分別為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4作為實(shí)驗(yàn)條件,其他條件為pH=10、反應(yīng)時(shí)間60 min及反應(yīng)溫度40 ℃,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察不同米糠蛋白復(fù)合戊聚糖比例對(duì)接枝度的影響。

1.3.4 米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面分析法考察溶液pH(A)、反應(yīng)時(shí)間(B)、反應(yīng)溫度(C)和米糠蛋白復(fù)合戊聚糖比例(D)4個(gè)因素與接枝度(Y)進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平表如表1所示。

表1 因素與水平

1.3.5 米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物褐變度的測(cè)定

測(cè)定不同比例樣品溶液,在不同反應(yīng)時(shí)間段褐變度的變化。取樣品溶液于離心管中,在3 500r/min條件下離心15 min,取上清液,用蒸餾水做空白,用0.1 mg/100 mL的SDS溶液稀釋,在420 nm處測(cè)定吸光度[22],以此表示體系的褐變程度。

1.3.6 米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物溶解度的測(cè)定

分別配置pH值分別為 3、4、5、6、7、8、9的磷酸鹽緩沖液,溶解米糠蛋白及其復(fù)合物制成1 mg/mL的溶液,混合均勻。在室溫下放入離心機(jī),3 500r/min離心力下離心20 min。取上清液在280 nm 處測(cè)量吸光度,每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析和響應(yīng)模型的建立由Origin 2019和Design Expert 8.6.0軟件處理,采用SPSS26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物單因素實(shí)驗(yàn)

由圖1可知,隨著溶液pH值的逐漸增大,米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物的接枝度呈現(xiàn)上升趨勢(shì),當(dāng)pH值為7～10時(shí),接枝度顯著上升,當(dāng)pH等于10時(shí)接枝度最大為28.38%,pH值在10～12呈下降趨勢(shì),差異不顯著。隨著pH值增大使得溶液的堿性越大,濃度過(guò)高會(huì)使米糠蛋白發(fā)生變性和蛋白交聯(lián),導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而降低樣品的接枝度。接枝度在反應(yīng)時(shí)間為60 min時(shí)有最高值為28.58%。此后接枝度隨著反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì),最后趨于平緩。隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,米糠蛋白分子結(jié)構(gòu)開(kāi)始發(fā)生變化,米糠蛋白中的氨基與戊聚糖中的羥基進(jìn)行接枝反應(yīng);隨著反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行,接枝度在70 min后趨于平緩。隨著反應(yīng)溫度的升高,接枝度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),在40 ℃取得最高值為28.49%。隨著反應(yīng)溫度的升高,米糠蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微改變,分子中的游離氨基含量升高,濃度增加從而提高接枝反應(yīng)速率,接枝度顯著升高。但溫度過(guò)高會(huì)引發(fā)蛋白的熱變性和粒子重新聚集,游離氨基酸含量降低,從而導(dǎo)致接枝度下降。當(dāng)米糠蛋白與戊聚糖質(zhì)量比為1∶2時(shí),其接枝度最高為28.96%,此后接枝度隨著戊聚糖添加比例的改變呈現(xiàn)下降趨勢(shì),由于蛋白添加比例變小,戊聚添加比例增大,溶液黏稠度增加從而不利反應(yīng)的發(fā)生,導(dǎo)致接枝度的下降。在一定的添加范圍內(nèi),增加戊聚糖濃度,可提高米糠蛋白的游離氨基與戊聚糖中的羥基反應(yīng),使接枝反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)可知,選取pH 10、反應(yīng)時(shí)間60 min、反應(yīng)溫度40 ℃和米糠蛋白-戊聚糖比例1∶2作為最佳的單因素制備工藝條件。

圖1 米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物單因素影響

2.2 米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 方差分析及回歸方程

以單因素實(shí)驗(yàn)作為依據(jù)得出結(jié)論,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

以pH(A)、反應(yīng)時(shí)間(B)、反應(yīng)溫度(C)、米糠蛋白-殼聚糖質(zhì)量比(D)為自變量,可得出接枝度的回歸方程為:Y=28.81-0.44A-0.57B+0.13C+1.05D-2.06AB-0.72AC+1.75AD-0.69BC+0.48BD+0.26CD-2.09A2-2.67B2-0.58C2-1.39D2。

表3 響應(yīng)面回歸方程方差分析

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

影響米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物的接枝度的各個(gè)因素之間的交互作用。由各因素交互作用的響應(yīng)面圖,根據(jù)響應(yīng)面陡峭程度和F值可以得出4個(gè)因素對(duì)米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物接枝度的影響程度為:接枝反應(yīng)溫度(℃)>接枝反應(yīng)時(shí)間(min)>pH>米糠蛋白復(fù)合戊聚糖質(zhì)量比(g/g)。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化可知最佳工藝參數(shù)為pH=10.11、反應(yīng)時(shí)間58.71 min、反應(yīng)溫度44.15 ℃及米糠蛋白復(fù)合戊聚糖質(zhì)量比1.00∶2.21時(shí),在此條件下接枝度為29.07%。考慮到實(shí)際操作,將實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整為反應(yīng)溫度44 ℃、反應(yīng)時(shí)間60 min、pH=10米糠蛋白復(fù)合戊聚糖質(zhì)量比1∶2,進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),取平均值得到接枝度度為29.01%,與實(shí)際相符,則模型可以較好地預(yù)測(cè)米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物的制備。

2.3 米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物褐變度的測(cè)定

美拉德反應(yīng)會(huì)有褐色產(chǎn)物產(chǎn)生,褐變度是通過(guò)呈色物質(zhì)吸光度的變化來(lái)表現(xiàn)美拉德反應(yīng)的高級(jí)產(chǎn)物的形成[23],褐變程度的增加也表明反應(yīng)進(jìn)行程度。由圖2可知,反應(yīng)時(shí)間的逐漸延長(zhǎng),吸光度在前45 min逐漸增大,之后趨于平緩,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間到70 min以后美拉德反應(yīng)呈現(xiàn)結(jié)束或逆轉(zhuǎn)。隨著戊聚糖添加量增加,同一時(shí)刻不同比例樣品的美拉德反應(yīng)的呈現(xiàn)先增加后減小趨勢(shì),當(dāng)添加比例為1∶2時(shí)吸光度值最高,而當(dāng)比例為4∶1、3∶1或1∶4、1∶3時(shí)吸光度值有所下降,表明戊聚糖或米糠蛋白濃度提高對(duì)于美拉德高階反應(yīng)有抑制作用。

圖2 米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物褐變度的測(cè)定

2.4 米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物溶解度的測(cè)定

由圖3可知,上清液的吸光度值越高,其溶解度越高。在pH為3～9之間,溶解度先減少后增加,在pH=4附近最低,通過(guò)前后對(duì)比分析可知,米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物的溶解度高于米糠蛋白的溶解度。溶解度與蛋白質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)[24],蛋白質(zhì)在酸性或堿性條件下,體系中電荷的增加,有利于蛋白分子與水分子間作用,溶解性呈現(xiàn)逐漸增大趨勢(shì)[25]。可知糖基化改性能提高米糠蛋白溶解度對(duì)于pH變化環(huán)境下的敏感性,使得糖基化后的米糠蛋白與水的親和力進(jìn)一步提高。

圖3 糖基化反應(yīng)對(duì)米糠蛋白溶解度的影響

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)以米糠蛋白和戊聚糖為原料,采用糖基化方法進(jìn)行復(fù)合,探究不同反應(yīng)條件對(duì)接枝度的影響。通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)建立其模型并進(jìn)行工藝優(yōu)化,得到米糠蛋白戊聚糖復(fù)合物優(yōu)化后的最佳工藝條件為pH=10.11、反應(yīng)時(shí)間58.71 min、反應(yīng)溫度44.15 ℃及米糠蛋白復(fù)合戊聚糖質(zhì)量比1.00∶2.21時(shí),在此條件下接枝度為29.07%。獲得最優(yōu)的制備條件,為后續(xù)米糠蛋白特性的研究提供了基礎(chǔ)。