聚焦基因治療的擴(kuò)張型心肌病模型構(gòu)建及進(jìn)展

陳玉林蔣虎剛安濤李雯嚴(yán)春艷黃倩劉凱李應(yīng)東趙信科*

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,蘭州 730000;2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,甘肅白銀 730900;3. 甘肅省中醫(yī)藥防治慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730000;4. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院國(guó)家心血管病中心阜外醫(yī)院心力衰竭中心,北京 100037)

擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)是在沒(méi)有異常負(fù)荷條件或冠狀動(dòng)脈疾病能夠引起左心室收縮功能障礙的情況下存在左心室(left ventricle,LV)擴(kuò)張和收縮功能障礙[1]。 DCM 存在病因?qū)W異質(zhì)性,非遺傳性占75%。 DCM 的患病率約為1/250 ~ 1/2500,在成人中發(fā)病率每年可達(dá)7/100 000,在兒童中發(fā)病率每年可達(dá)0.57/100 000,男性高于女性,且66%的兒童患有特發(fā)性疾病[2]。人DCM 遺傳背景特定致病突變?nèi)晕疵鞔_,其研究也是當(dāng)前熱點(diǎn)。 心肌病的遺傳復(fù)雜性挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)“單基因疾病”理念,目前研究集中于“力傳導(dǎo)缺陷”假說(shuō),未來(lái)研究希望發(fā)現(xiàn)遺傳突變組合,理解心肌病的分子亞型[3]。 基因突變是DCM 的重要病因,核纖層蛋白A(Lamin A, LMNA)突變是導(dǎo)致DCM 的常見(jiàn)突變之一。

1 LMNA 突變是遺傳性DCM 的重要病因

LMNA 突變是遺傳性DCM 的重要病因。 在包含2032 名DCM 患者的研究中,導(dǎo)致家族及散發(fā)性DCM 病例的合并頻率為5%;152 名患者中有105 名(69%)為男性;LMNA 突變攜帶者DCM 診斷的平均年齡為40 歲。 LMNA 突變DCM 患者的平均LVEF為 35%, 受損程度稍低; 心臟移植( heart transplantation, HTx)的平均年齡為41 歲;26%的LMNA 突變DCM 患者中進(jìn)行了植入式心律轉(zhuǎn)復(fù)除顫器(Implantable cardioverter-defibrillator,ICD)的植入來(lái)干預(yù)臨床心律失常問(wèn)題[4-7]。 LMNA 突變導(dǎo)致心臟損傷機(jī)制有結(jié)構(gòu)假說(shuō):LMNA 突變相關(guān)層粘連蛋白結(jié)構(gòu)缺陷導(dǎo)致細(xì)胞核結(jié)構(gòu)軟化和形態(tài)異常;機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)假說(shuō):A 型層粘連蛋白突變導(dǎo)致收縮組織的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)失常,機(jī)械應(yīng)力抵抗力降低;基因轉(zhuǎn)錄假說(shuō):Lamin A/C 能夠直接結(jié)合染色質(zhì),調(diào)節(jié)其空間組織,影響轉(zhuǎn)錄和基因定位;線粒體功能破壞:LMNA突變導(dǎo)致異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和表觀遺傳標(biāo)志物(H3K9me2/3)增加,并破壞線粒體超微結(jié)構(gòu)[4,7]。LMNA 突變通過(guò)影響細(xì)胞核機(jī)械結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致心肌病的發(fā)生。

2 心律失常是LMNA-DCM 的重要臨床表征

心律失常是LMNA-DCM 的重要臨床表征。 其中包括房室傳導(dǎo)阻滯、束支傳導(dǎo)阻滯、竇房結(jié)功能異常的傳導(dǎo)系統(tǒng)疾病占73%;心房顫動(dòng)、心房撲動(dòng)、室上性心動(dòng)過(guò)速占61%;室性心律失常占50%;另外還有心源性猝死[8]。

3 LMNA-DCM 的突變發(fā)生率及突變類(lèi)型

在一項(xiàng)關(guān)于LMNA 突變的臨床研究中發(fā)現(xiàn)66名心臟移植受者或轉(zhuǎn)診心臟移植患者中有5 個(gè)突變(7.6%),另外一項(xiàng)研究中44 名擴(kuò)張型心肌病患者中有4 個(gè)突變(9.1%)(LMNA 突變的類(lèi)型及表型如表1)。 所有LMNA-DCM 都伴有不同程度的心律失常。 LMNA 突變的類(lèi)型 有p. Arg541Cys、p.Arg541Gly、p.Arg89Leu、p.Val256Gly、p.Gly400Argfs*11、p.Thr510Tyrfs*42、p.Gln246*、p. Ser431*、p. Tyr481*, 其中p. Arg89Leu、p.Val256Gly、p.Gly400Argfs*11、p.Thr510Tyrfs*42、p.Gln246*、p.Ser431*、p.Tyr481*突變伴有房室傳導(dǎo)阻滯,p.Gly400Argfs*11 突變伴有病態(tài)竇房結(jié)綜合征[9]。

表1 LMNA 突變的類(lèi)型及表型Table 1 Types and phenotypes of LMNA mutations

4 聚焦基因治療的嚙齒類(lèi)動(dòng)物DCM模型

近年來(lái)基于C57/B6 遺傳背景小鼠聚焦基因治療的嚙齒類(lèi)動(dòng)物DCM 模型構(gòu)建及其干預(yù)也是研究的熱點(diǎn)(總結(jié)如表2)。

表2 聚焦基因治療嚙齒類(lèi)動(dòng)物DCM 模型Table 2 A rodent DCM model that is focused on gene therapy

對(duì)含p. H222P LMNA 突變的小鼠模型中LmnaH222P/H222P突變導(dǎo)致小鼠胚胎體內(nèi)心臟缺陷,賴氨酸特異性去甲基化酶1 抑制劑(lysine-specific demethylase 1, LSD1 ) GSK-LSD1 挽 救 了LmnaH222P/H222P胚胎的心臟發(fā)育,且可預(yù)防小鼠的纖維化和心力衰竭,靶向組蛋白去甲基化酶LSD1 可在核纖層蛋白病小鼠模型中預(yù)防心肌病[29];對(duì)相同遺傳背景的兩個(gè)獨(dú)立的大鼠品系,建立近端和遠(yuǎn)端TTNtv 模型(TTNtvA:A 帶變異;TTNtvZ: Z 盤(pán)變異;純合突變的大鼠無(wú)法存活,雜合突變的大鼠以正常的孟德?tīng)柋嚷食錾?實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)核糖體分析確定了titin 的截短變異體的翻譯足跡,TTN 的近端和遠(yuǎn)端TTNtv 改變亞型加工并觸發(fā)NMD,大鼠和人類(lèi)的TTNtv 對(duì)心臟幾何形狀和功能產(chǎn)生不利影響,未來(lái)的研究聚焦于確定在TTNtv 和遺傳或環(huán)境的二次觸發(fā)相互作用中風(fēng)險(xiǎn)最大[30];對(duì)Rbm20R636Q-KO 小鼠模型,純合子突變小鼠的短軸縮短分?jǐn)?shù)顯著降低表現(xiàn)出與DCM 一致的形態(tài)學(xué)特征[31-32]。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)心臟基因的異常剪接(如TTN 突變)是RBM20 相關(guān)心肌病的主要原因,通過(guò)AAV9 對(duì)這些小鼠進(jìn)行包含ABEmax-VRQR-SpCas9 和單向?qū)NA 的ABE 成分的全身遞送,心功能恢復(fù)且壽命延長(zhǎng)[33]。 RNAseq 顯示,ABE 校正挽救了R636Q/R636Q 小鼠的心臟轉(zhuǎn)錄譜,全身校正ABE 減少了CMs 中存在的毒性RNP 顆粒,并挽救了小鼠的心功能障礙[34]。

5 擴(kuò)張型心肌病大動(dòng)物模型研究

大動(dòng)物構(gòu)建模型有著絕對(duì)優(yōu)勢(shì),包括生理、認(rèn)知能力、神經(jīng)解剖學(xué)、社會(huì)復(fù)雜性、繁殖和發(fā)育等方面非人靈長(zhǎng)類(lèi)與人類(lèi)具有高度相似性。 神經(jīng)系統(tǒng)相似性:研究腦脊髓接口的可植入組件,為脊髓損傷患者的概念驗(yàn)證研究提供了一條實(shí)用的轉(zhuǎn)化途徑[35];器官解剖學(xué)相似性:基于基因編輯技術(shù),NHPs 被用于開(kāi)發(fā)模擬人類(lèi)疾病(如癌癥)的高效轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)平臺(tái)[36];生殖系統(tǒng)相似性:自體鞘膜干細(xì)胞移植可以改善NHPs 激素水平以及早發(fā)性卵巢功能不全的癥狀[37]。 非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(non-human primates, NHPs)的大型的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜已構(gòu)建,包含了來(lái)自成年NHPs 食蟹猴45 個(gè)組織、113 個(gè)細(xì)胞群的超過(guò)100 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,提供了一個(gè)巨大的注釋資源[38-39]。 基于超靈敏序貫熒光原位雜交(USeqFISH)的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)已開(kāi)發(fā),可用于非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中原位AAV 分析和多模態(tài)單細(xì)胞分析[40-41]。 在蛋白層面,反義寡核苷酸(anti-sense oligonucleotides, ASO)在NHPs 肌肉中的效力的探究:調(diào)節(jié)與血漿蛋白的結(jié)合可以以物種依賴性的方式影響ASO 活性和在肝外組織的分布,為確定增強(qiáng)ASO 在肌肉組織中的效力的其他策略奠定了基礎(chǔ)[42];分泌蛋白PCSK9(LDL 受體的拮抗劑)失活對(duì)治療高膽固醇血癥的探究[43-44]:在6 只非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中單次輸入表達(dá)靶向PCSK9 的工程巨核酸酶的AAV 載體可導(dǎo)致肝中PCSK9 的劑量依賴性破壞,以及循環(huán)PCSK9 和血清膽固醇的穩(wěn)定減少,證明了在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中具有生理學(xué)意義的高效體內(nèi)編輯[45]。

大動(dòng)物犬模型目前存在犬類(lèi)天然DCM 模型及突變基因,易患天然DCM 的犬類(lèi)有紐芬蘭犬、圣伯納犬、杜賓獵犬、大丹犬、愛(ài)爾蘭獵狼犬、拳師犬、英國(guó)可卡犬,其中與人DCM 相關(guān)的基因有ACTC1、ACTN2、CSRP3[46]。 犬類(lèi)模型構(gòu)建方式為小劑量(0.7 mg/kg)阿霉素經(jīng)5F Judkins 導(dǎo)管注入左冠狀動(dòng)脈主干,每周重復(fù)輸注,持續(xù)5 周。 模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肌纖維萎縮和細(xì)胞質(zhì)空泡化,并伴有間質(zhì)纖維化,主要見(jiàn)于左心室;證明反復(fù)冠狀動(dòng)脈內(nèi)灌注阿霉素是一種簡(jiǎn)單可靠的制備犬?dāng)U張型心肌病模型的方法[47]。

在關(guān)于基因突變相關(guān)的模型上,2019 年,家系研究揭示位于1 號(hào)染色體長(zhǎng)臂的RBM20 基因第九個(gè)外顯子錯(cuò)義突變可導(dǎo)致DCM[48]。 正常RBM20存在于細(xì)胞核,突變RBM20 在胞質(zhì)異常聚集,突變RBM20 導(dǎo)致TTN、CAMK2D 等重要功能基因轉(zhuǎn)錄的pre-mRNA 異常剪切[49-51]。 RBM20 存在多種突變,其中位于RS 區(qū)域的最常見(jiàn)[50],人R636S 突變被用于DCM 豬模型,通過(guò)具有高度精確性和可控性的TALEN 基因編輯里的同源定向修復(fù)技術(shù)(HDR)引入錯(cuò)義突變序列(R636S)及一個(gè)防再次被切割的BglⅡ序列[51],超聲顯示純合突變豬EF 值明顯下降,雜合子無(wú)明顯改變,MRI 也顯示純合突變豬心臟擴(kuò)大,EF 下降。 新生純合突變豬出生時(shí)心臟即明顯改變:心臟體積增大,心室擴(kuò)張,室壁更薄,更柔軟和脆弱,心臟重量明顯增加;雜合突變胞質(zhì)少量聚集RBM20,純合突變大量聚集;電鏡顯示肌節(jié)縮短且結(jié)構(gòu)受損,心肌細(xì)胞排列紊亂。 另外參照文獻(xiàn)[52],在iPCS 中驗(yàn)證了堿基編輯和先導(dǎo)編輯在RBM20 基因突變的效果,并進(jìn)一步在其DCM 小鼠模型中得到證實(shí),由此提出在大動(dòng)物模型中是否可以有此效果,需進(jìn)一步驗(yàn)證。 純合突變豬生存率明顯降低;豬血漿ANP 和BNP 明顯增加;RBM20 純合突變豬心肌纖維化、心肌肥大、心肌受損等相關(guān)基因上調(diào),細(xì)胞周期、DNA 合成相關(guān)基因下調(diào)。

6 總結(jié)與展望

非人靈長(zhǎng)類(lèi)依然是更貼近人類(lèi)的模型,猴在免疫相關(guān)基因表達(dá)模式和細(xì)胞通訊方面與人類(lèi)的相似程度顯著高于小鼠[52],目前對(duì)于非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的心臟疾病模型并未涉及DCM,而猴模型是很好的大動(dòng)物心臟疾病模型,但目前并未從基因?qū)用鎰?chuàng)建DCM 模型。 目前對(duì)于DCM 的治療集中于心衰層面,暫未發(fā)現(xiàn)可治療因基因突變導(dǎo)致DCM 的藥物,有研究利用iPSCs 表明洛伐他汀改善LMNA 心肌病的內(nèi)皮功能障礙,他汀類(lèi)藥物可能為新的藥物選擇。 最新研究利用堿基編輯和先導(dǎo)編輯等方式修正基因突變,在小動(dòng)物模型中已取得了成果,不僅在iPSC 中驗(yàn)證了堿基編輯和先導(dǎo)編輯在修正RBM20 突變的效果,還在其DCM 小鼠模型中證實(shí)了ABE 可有效修正基因突變,恢復(fù)其心臟功能并延長(zhǎng)壽命[53]。 在今后的研究中基于基因治療的大動(dòng)物及非人靈長(zhǎng)類(lèi)模型的發(fā)展,借助高層次平臺(tái)和科研團(tuán)隊(duì)可以從基因?qū)用嬷委烡CM 實(shí)現(xiàn)更大的突破。