紫杉醇誘導的神經(jīng)病理性疼痛大鼠和小鼠動物模型研究及其在中醫(yī)藥方面應用進展

于俊,李明珠,樸浩哲,崔穎,張立德,金圣博,王建波

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學,沈陽 110032;2. 中國醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院遼寧省腫瘤醫(yī)院,沈陽 110042;3. 遼寧中醫(yī)藥大學,沈陽 110032)

惡性腫瘤是導致世界上每個國家人口死亡的主要原因,也是延長預期壽命的重要障礙,根據(jù)2019 年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)的估計,在全球的183 個國家中,有112 個國家在70 歲之前的第一或第二大死亡原因是惡性腫瘤,在另外23 個國家中排名第三或第四[1]。 可見,惡性腫瘤作為全球人口主要死亡原因的地位日益突出[2]。 紫杉醇是一種廣譜抗惡性腫瘤的化合物,主要來源于一種藥用植物,特別是紫杉樹、紅豆杉的樹皮,是目前最常見的化療藥物,并作為多種癌癥如乳腺癌、肺癌和卵巢癌等惡性腫瘤的一線化療藥物,臨床上被廣泛應用[3]。 然而,紫杉醇的使用會產(chǎn)生不良反應,限制了其治療的連續(xù)性,該不良反應就是所謂化療誘導的神經(jīng)病理性疼痛,其患病率高達87%,主要是一種感覺癥狀,導致手和/或腳麻木、刺痛和疼痛,甚至影響運動功能,癥狀持續(xù)數(shù)月乃至數(shù)年,嚴重影響治療的連續(xù)性及患者的生活質量[4]。 近幾年,現(xiàn)代醫(yī)學一直致力于解決化療后所誘導的周圍神經(jīng)病理性疼痛(chemotherapyinduced peripheral neuropathic pain,CIPNP)的防治這一難題,所以CIPNP 的防治已成為各大醫(yī)家研究的熱點,而中醫(yī)藥因其獨特的辨證論治體系、安全有效且不良反應發(fā)生率低的優(yōu)勢而得到認可,在《2021 年化療所致周圍CINP 中西醫(yī)診治專家共識》中指出越來越多的臨床研究報道中使用中醫(yī)藥配合神經(jīng)營養(yǎng)劑、抗氧化劑和鈣鎂合劑可以進一步降低周圍CIPNP 發(fā)生率,改善生存質量,提高患者對化療耐受性和依從性,并將黃芪桂枝五物湯和通絡蠲痹湯作為治療CIPNP 的A+級推薦藥物,但中醫(yī)藥的防治機制有待進一步明確和探究[5]。 因此,在研究時選擇理想的CIPNP 動物模型及準確的行為檢測方法,已成為CIPNP 病因病機及中醫(yī)藥防治CIPNP 作用機制等熱點研究極為關鍵的一步;而目前國內(nèi)外的機理研究中經(jīng)常使用大鼠或小鼠的CIPNP 模型,但由于缺乏明確的分類和評價指標,使得現(xiàn)有的CIPNP 動物模型不能得到充分合理的利用,影響了研究結果的可靠性與真實性[6]。 因此,本文介紹了紫杉醇化療后所致的大鼠CIPNP 和小鼠CIPNP 模型的建立方法、具體成模檢測方法以及大鼠和小鼠CIPNP 模型在中醫(yī)藥臨床科研中的應用,以期為后續(xù)實驗中選擇出更符合實驗要求的CIPNP 模型提供理論依據(jù)和參考,建立更適合于臨床使用的動物模型,為國內(nèi)外學者研究中西醫(yī)治療腫瘤疼痛提供理想的實驗平臺。

1 紫杉醇所致大鼠和小鼠CIPNP 模型建立的主要方法

無論是大鼠還是小鼠CIPNP 模型,常用注射方式都為腹腔注射或者靜脈注射,且這兩種注射方式相對來說都是安全性高且可操作性強的,但目前國內(nèi)外對于CIPNP 模型的造模還是以腹腔注射為主,腹腔注射主要的不良反應為腹膜腫脹[7]。 在對惡性腫瘤患者使用紫杉醇化療時,單次治療的起始劑量為135 mg/m2或175 mg/m2(分別為3.6 mg/kg和4.7 mg/kg)時,在治療后的“24 ~ 72 h”可能出現(xiàn)神經(jīng)損傷急性癥狀,但尚未報告關節(jié)或肌肉骨骼系統(tǒng)的客觀變化,這種急性疼痛在輸注后約1 周緩解;而當紫杉醇的注射時間達到每3 周靜脈注射3 ~24 h, 累積注射劑量達到1400 ~ 1500 mg/m2(37.8~ 40.5 mg/kg)的時候,這時患者會伴有“感覺喪失或感覺異?！被颉翱赡芨蓴_日常生活活動”的慢性疼痛的癥狀,所以紫杉醇所致的CIPNP 大鼠和小鼠模型建立目前只有慢性模型,沒有急性模型[8-10]。

目前報道中,對于紫杉醇所致的CIPNP 大鼠模型的建立,大多數(shù)學者選擇1 mg/kg 或2 mg/kg,第0、2、4、6 天注射,模擬臨床多次化療的方式造CIPNP 慢性模型[11-14];并且在一些學者的研究中發(fā)現(xiàn),當紫杉醇單次注射劑量為1.0 ~ 32.0 mg/kg,總劑量為8.0 ~ 82.0 mg/kg 時,按照動物種屬與用藥轉換公式,換算成人體的注射總劑量為1.3 ~ 12.9 mg/kg,此時大鼠在接受該劑量范圍的紫杉醇溶液注射后會出現(xiàn)一些行為學變化,如會出現(xiàn)肢體末端皮膚略顯蒼白,舔趾和抬足的次數(shù)增加等行為變化,進一步會出現(xiàn)機械性痛閾、機械痛覺過敏、冷痛閾等的疼痛行為改變[7,15]。

對于紫杉醇所致的CIPNP 小鼠模型的建立,大多數(shù)學者選擇2 mg/kg,每天注射1 次,共5 次的注射方式進行造模[16-23];并且在一些學者的研究中發(fā)現(xiàn),當紫杉醇單次注射劑量為4.0 ~ 18.0 mg/kg,累計總劑量為4.0 ~ 8.0 mg/kg 時,按照動物種屬與用藥轉換公式,換算成人體的注射總劑量0.33 ~3.1 mg/kg,此時小鼠在接受紫杉醇注射后會出現(xiàn)機械性痛覺過敏、冷熱痛覺過敏等疼痛行為學改變[15]。

在實驗研究中,上述疼痛的行為表現(xiàn)的變化可以用來確定建模是否成功。 表1~3 從造模方法、藥物注射方式、藥物總劑量、大鼠或小鼠種類、行為表現(xiàn)、安全性以及適用的研究范圍方面詳細敘述國內(nèi)外常用的紫杉醇所致的CIPNP 大鼠和小鼠的模型。大鼠均選取SD 或Wistar 大鼠,小鼠種類的選取較多,但還是以C57BL/6J 或CD1 小鼠為多數(shù),大鼠雄性或者雌性無明顯差別,但小鼠在相同的注射方式和種類下,不同性別會出現(xiàn)不同的行為表現(xiàn)。

表1 大鼠CIPNP 模型Table 1 CIPNP acute model of rat

表2 小鼠CIPNP 模型Table 2 CIPNP acute model of mice

表3 大、小鼠CIPNP 造模注射方式Table 3 CIPNP model injection method of rat and mice

2 成模檢測方法

紫杉醇化療所引起的CIPNP 的臨床表現(xiàn),如手和/或腳的麻木、刺痛、疼痛和感覺障礙等癥狀,這些癥狀在大鼠或小鼠的CIPNP 模型中也會有對應的行為表現(xiàn),而建立模型和評估療效的成功,通常是通過機械痛閾值、機械性痛覺過敏、冷熱痛閾值以及冷熱痛覺過敏的變化來評估的。 下文詳細介紹了近幾年國內(nèi)外常用的成模檢測方法。

2.1 機械痛閾檢測

2.1.1 Von Frey 法

機械異常性疼痛是指大鼠或小鼠對機械刺激的過度疼痛反應,最常見的測試是使用Von Frey 纖維絲的單絲進行評估。 這項測試一共需要選擇其中8 根不同壓力值的單絲,分別觸壓大鼠或小鼠的后腳掌中部,逐漸增加硬度,用垂直于表面的力施加到Von Frey 纖維絲上,力會使單絲弓起大約6 ~ 8 s,這對健康的大鼠或小鼠來說,會導致爪子急劇縮回,這樣可以通過測量閾值來評估機械性異常痛[58]。

2.1.2 足底動態(tài)實驗

使用動態(tài)足底感覺計(意大利)測量大鼠或小鼠的機械痛覺,讓大鼠或小鼠在穿孔平臺頂部的塑料外殼內(nèi)棲息30 ~ 60 min,然后啟動微處理器,該微處理器會自動抬起一根金屬絲,大鼠或小鼠落定時,該金屬絲在后爪上施加線性增加的力(0.25 g/s, 切斷時間為20 s),當大鼠或小鼠移除爪子或金屬絲施加在后爪的重量達到5 g 而產(chǎn)生切斷力時,處理器會自動獲得停止信號,此時大鼠或小鼠對機械刺激的退出閾值自動記錄為g,需要對大鼠或小鼠后爪進行至少3 次測試[56,59]。

2.2 機械痛覺過敏檢測

2.2.1 Von Frey 纖維絲法(4.0 g 、15.0 g、0.6 g)

使用Von Frey 纖維絲評估機械敏感性(英國林頓儀器公司),將大鼠放置在帶金屬絲的透明有機玻璃盒(15 cm × 16 cm × 21 cm)中,并使其適應環(huán)境;當4 只爪子都與地板接觸時,將Von Frey 纖維絲(4 g、15 g)按力的升序施加到后爪上,且將每根Von Frey 纖維絲施加到每個后爪足底中部區(qū)域的五個離散點上,并保持5 s,記錄退出次數(shù),以2 min 的時間間隔進行5 次實驗,結果記錄為大鼠對每根纖維絲的戒斷發(fā)生率[13,39]。 將小鼠單獨放置在透明有機玻璃盒(9 cm × 7 cm × 11 cm)中,行為測試開始前,使其適應玻璃盒1 h,然后當小鼠后爪的腹面接近高架鋼絲網(wǎng)平臺(意大利)時,將0.6 g Von Frey 纖維絲(芝加哥,美國)從下方輸送至右后爪的足底表面,并對后爪施加力,需要用0.6 g Von Frey纖維絲測試10 次(每次持續(xù)時間為3 s,每次間隔時間為10 s,然后測量脫絲反應頻率),其中在紫杉醇處理的大鼠或小鼠中,機械超敏反應的發(fā)生率為90%[18]。

2.2.2 蘭德爾足壓(Randall-Selitto)實驗

Randall-Selitto 實驗是機械痛覺過敏的一種測量方法,這項測試有助于評估大鼠而不是小鼠的傷害性閾值,因為需要動物用爪子進行沉重的物理約束測試,而小鼠很少能容忍這種處理;測試時需要把大鼠被限制在一個可以接觸到后爪的背包、毛巾或圓柱體中;為了獲得可靠的數(shù)據(jù),大鼠需要習慣于實驗設備一段時間,然后用Ugo Basile 鎮(zhèn)痛儀將壓力施加于大鼠足底表面,然后使壓力以恒定的速率增加,直至觀察到大鼠出現(xiàn)傷害性行為反應(如發(fā)出痛苦叫聲),測試結果是需要得到兩個相似的連續(xù)壓力值[60]。

2.3 冷痛覺過敏檢測

2.3.1 丙酮實驗

通過丙酮實驗評估冷痛覺過敏,將每只大鼠或小鼠放置在由鐵絲網(wǎng)制成的盒子(20.0 cm × 13.5 cm × 27.0 cm)中,并在實驗前讓其棲息30 min。 用針頭和注射器將1 L 丙酮(日本大阪市和谷純化學有限公司)噴灑在每個后爪的足底皮膚上3 次,并在丙酮噴灑開始后40 s 內(nèi)記錄退出反應的次數(shù)。還有1 種方式是將大鼠或小鼠置于封閉的矩形金屬絲網(wǎng)室中,在右后爪的足底表面噴灑約100 μL 丙酮,用1 min 的持續(xù)時間觀察冷感覺,根據(jù)反應用5 分制評分:1 分= 舔爪反應;2 分= 抖動反應;3 分= 右后爪抬起持續(xù)時間在4 s 內(nèi);4 分= 右后爪抬起的持續(xù)時間為5 ~ 8 s; 5 分= 右后爪抬起的持續(xù)時間超過8 s;需要檢測3 次,得到累積分數(shù),最低得0 分,最高得15 分,得15 分時被認為是嚴重的神經(jīng)元損傷[19,34]。

2.3.2 冷水浸泡實驗

為了測試冷痛覺過敏反應,可以進行冷水浸泡實驗。 將大鼠或小鼠為1 只后爪浸泡在充滿冷水(4 ± 1℃)的水浴中,在整個實驗過程中,用溫度計(克利夫頓,新澤西州)監(jiān)測并保持水浴的溫度。 每只后爪每隔10 min 測試2 次,以便在測試之間恢復,截止時間設置為20 s,以防止組織損傷,計算從冷水浴中垂直或水平抽出后爪的潛伏期的平均值,此平均值用作測試數(shù)據(jù)[39]。

2.3.3 冷水浴鼠尾撤尾法

在使用尾部浸入實驗測試冷痛覺異常時,將大鼠或小鼠的尾部末端(5 cm 遠端)浸入裝滿10℃冷水的容器中。 在整個實驗過程中保持恒定溫度(10℃),記錄大鼠或小鼠尾尖拔出的潛伏期,浸入時間不能超過20 s,避免任何組織損傷。 對每只大鼠或小鼠重復該程序3 次,并計算平均值[61-62]。

2.3.4 冷足底實驗

冷足底實驗可以客觀、廉價地評估大鼠或小鼠的冷痛覺反應,并可以量化鎮(zhèn)痛和超敏反應。 使用裝滿濕冰或干冰的鋁盒(或鋁箔盒)將玻璃板冷卻至所需的起始溫度,使用T 型燈絲的熱電偶探頭測試中心測量板的溫度,一旦平板達到所需的起始溫度,使房間的溫度保持穩(wěn)定,將大鼠或小鼠放在觀察箱中15 min,使其安靜,再將大鼠或小鼠后爪放在有壓縮干冰的玻璃表面上,記錄大鼠或小鼠開始到出現(xiàn)縮爪、舔腳或抓撓的時間,截止時間為90 s,以避免皮膚凍傷,此期間被稱為潛伏期,用作冷痛覺反應的衡量標準,每只大鼠或小鼠在正式實驗前1 周接受適應性測試[63-64]。

2.4 熱痛覺過敏檢測

2.4.1 熱輻法

(1)熱輻鼠尾法

用甩尾測試評估熱痛覺時,需要使用甩尾鎮(zhèn)痛儀(型號:35100;意大利)提供主要刺激,該裝置擁有一個紅外(I.R.)源(50 W 燈泡),熱輻射能量從該紅外源發(fā)出,并將光束集中到大鼠或小鼠的尾巴上。 熱源的刺激強度設置為50 W,因為該水平在未處理的對照大鼠或小鼠中能產(chǎn)生6 ~ 8 s 的基線甩尾反射潛伏期。 將大鼠或小鼠放在測試板上,并用無菌毛巾覆蓋。 光束聚焦在距離尾巴尖端5 cm 的位置。 為了防止組織損傷,第2 次和第3 次刺激在距離第一個部位1 cm 的兩個方向上進行,將大鼠或小鼠的最大反應延遲15 s 后的時間設置為截止時間,以避免任何潛在的組織損傷,傳感器會自動記錄甩尾反射的潛伏期,每只大鼠或小鼠每隔15 s 測量3 次基線和退出潛伏期,其平均值用作測試數(shù)據(jù)[39]。

(2)熱輻射鼠后足法

將大鼠或小鼠置于玻璃表面的再生障礙箱中,并允許其適應環(huán)境20 min,在開始時調整光的強度,使平均基線時間為9 s,截止?jié)摲跒?0 s;使用輻射熱刺激器將焦點精確地對準每只大鼠或小鼠后爪的足底表面中部,并記錄其回縮的潛伏期,每只大鼠或小鼠雙足需要分別連續(xù)測量5 次,每次需要間隔5 s,在這5 個數(shù)值中去除最大和最小值后計算平均值,該平均值即為大鼠或者小鼠的熱痛閾[14]。

2.4.2 熱板實驗法

將大鼠或小鼠單獨放置在熱板上,然后將溫度調節(jié)至(55 ± 1℃),記錄大鼠或小鼠第1 次為避免熱量而出現(xiàn)疼痛感、舔爪或跳躍反應的時間,然后立即將大鼠或小鼠從熱板中取出,要求截止時間是20 s,以避免損壞爪子[65]。

2.4.3 熱水浴鼠尾浸泡實驗

在大鼠或小鼠接受紫杉醇給藥30 min 后,進行熱水浴鼠尾浸泡實驗。 在正式實驗前1 周,對每只大鼠或小鼠進行適應性測試。 在大鼠或小鼠不再掙扎后,將尾巴浸入水浴中,記錄了從浸入到甩尾反應的時間,溫度設定為47℃,大多數(shù)大鼠或小鼠的甩尾時間為10 s。 為了防止高溫傷害,選擇20 s作為截止時間。 每只大鼠或小鼠測試3 次,間隔至少5 min,3 次測試的平均值用于測試數(shù)據(jù)[66]。

3 大鼠CIPNP 模型在中醫(yī)藥臨床科研中的應用

大鼠CIPNP 模型也是中醫(yī)學者們研究中醫(yī)藥防治紫杉醇誘導的神經(jīng)病理性疼痛機制和療效的一個重要媒介,而且在目前國內(nèi)所能查閱到的文獻中發(fā)現(xiàn),中醫(yī)藥臨床科研中實驗者選擇的大多都是大鼠CIPNP 模型,這與大鼠的行為表現(xiàn)較小鼠更易于觀察有關。 如吳非澤[67]的研究中使用8 mg/kg,每3 d 注射1 次,連續(xù)3 次的造模方式,并在第0、2、4、6、8、10 天進行疼痛行為測試,其在后續(xù)實驗中其發(fā)現(xiàn)復方溫絡通散方外用可有效防治紫杉醇所致周圍神經(jīng)毒性,明顯緩解大鼠機械性痛覺過敏,其機制是溫絡通散通過調節(jié)亞油酸代謝通路、甘油磷脂代謝通路發(fā)揮防治紫杉醇所致CIPNP 的作用。鄒曉玲[68]在實驗研究中對Wistar 雄性大鼠用8 mg/kg, 第1、4、7 天注射的造模方式進行造模,并根據(jù)給藥前后疼痛行為數(shù)據(jù)的變化發(fā)現(xiàn)參附注射液具有減輕紫杉醇化療所致CIPNP 的作用,且高劑量時效果明顯,其作用機制可能是與紫杉醇能夠維持外周神經(jīng)結構的完整性有關,血清中NGF 的高表達可能與該作用機制有一定相關性。 鐘敏鈺[69]在進行實驗研究前為了成功建立紫杉醇所致的大鼠CIPNP 模型,其選擇對SD 雄性大鼠重復腹腔注射紫杉醇1.0 或2.0 mg/(kg·d),經(jīng)過在造模前1 d 和造模后的第3、5、7、12、16、20 天對大鼠進行機械縮足反射閾值(mechanical withdrwal threshold,MWT)和熱縮足潛伏(thermal withdrawal latency,TWL)測試,結果表明重復腹腔注射紫杉醇2.0 mg/(kg·d)可以成功建立化學治療導致的CIPNP 的動物模型;通過對20 d 內(nèi)大鼠機械痛覺過敏和熱痛覺過敏的數(shù)據(jù)改變的觀察,其發(fā)現(xiàn)川芎嗪注射液能有效防治紫杉醇所致的大鼠CIPNP,降低機械刺激性痛覺過敏和熱痛覺過敏,并且其效果不亞于通常用于治療神經(jīng)性疼痛的抗癲癇藥物;這可能與川芎嗪注射液減少了NGF 在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的表達,從而減少神經(jīng)損傷有關。 多位學者在對大鼠進行2 mg/kg, 第1、3、5、7 天注射或2 mg/kg,第0、2、4、6天注射方式下,成功得到了紫杉醇誘導的大鼠CIPNP 模型,在此基礎上通過觀察3 周內(nèi)大鼠第0、7、14、21 天的行為測試數(shù)據(jù)指標發(fā)現(xiàn)黃芪桂枝五物湯水煎液可抑制紫杉醇所致周圍神經(jīng)病變,且不影響紫杉醇的抗腫瘤效果,黃芪桂枝五物湯能夠改善紫杉醇所致周圍神經(jīng)病變的藥理作用可能是通過下調TLR4/NF-κB 和激活PI3K/Akt-Nrf2 通路發(fā)揮抗炎、抗氧化作用所介導的,也有可能是黃芪桂枝五味湯提高了血清和脊髓中的SOD 活性,降低了血清和脊髓中的MDA 含量,發(fā)揮了保護神經(jīng)細胞的直接抗氧化作用[70-71]。 饒志璟[72]在明確了溫經(jīng)化瘀通絡方在臨床試驗中能顯著降低CIPNP 發(fā)生率,且能更有效地降低患者神經(jīng)癥狀評分(total neuropathy score,TNS)的基礎上,為了進一步探求其中的作用機理,其進行了實驗研究,采用了對SD 雌性大鼠進行8 mg/kg,第1、4、7 天注射的造模方式得到CIPNP 模型,并在對比了10 d 內(nèi)大鼠的機械痛閾變化后,得出了化瘀通絡方可顯著緩解紫杉醇誘導化療后周圍神經(jīng)病變大鼠的行為學改變,其機制可能與下調脊髓組織中CCL2 表達,干擾TLR4 蛋白信號通路,減輕炎癥免疫級聯(lián)反應有關的結論,這也間接證明了目前臨床雖然對于中醫(yī)治療紫杉醇誘導的CIPNP 有療效肯定,但對于機制的研究還是處于不明朗的階段,還有很多的機制可能性,所以動物模型作為機制研究的媒介,還是具有重要的研究意義。 韓濱等[73]在研究中對大鼠在第0、7、14、21天進行行為測試,發(fā)現(xiàn)了桃紅四物湯可緩解每隔2 d 注射8 mg/kg 紫杉醇,共注射4 次造成的外周神經(jīng)損傷的SD 雌性大鼠疼痛癥狀,其機制可能與降低炎性反應、誘導自噬清除損傷碎片而促進神經(jīng)損傷恢復有關。 對于CIPNP 的治療,中醫(yī)的一些經(jīng)典方也有很好療效,比如在最新的研究中發(fā)現(xiàn)芍藥甘草湯的治療減輕了用2 mg/kg,第1、3、5、7 天注射紫杉醇的大鼠模型中誘導的慢性疼痛;其中實驗數(shù)據(jù)進一步表明,芍藥甘草湯逆轉了紫杉醇大鼠中TRPV1、TLR4-MyD88 信號的表達[74]。 當然,除了上述的成方,在最新的報道中也提到一些中藥成分的提取物對該病的治療有一定療效,并從實驗數(shù)據(jù)方面對其可能的機制與作用進行了證實,其中槲皮素在中藥側柏葉、高良姜、款冬花、桑寄生中均含有此成分;嚴進紅等[75]通過對大鼠每隔2 d 腹腔注射2 mg/kg 紫杉醇,共注射4 次建立紫杉醇誘導的神經(jīng)痛模型,并通過對第0、2、4、6、8 天大鼠的行為測試數(shù)據(jù)變化分析來明確槲皮素是通過調控Wnt/βcatenin 信號通路來影響脊髓中的炎癥因子水平,進而減少炎癥細胞遷移。 綜合以上國內(nèi)學者對于中醫(yī)藥防治CIPNP 機制實驗研究的造模方式以及結合內(nèi)容來看,選擇雄性SD 大鼠2 mg/kg,第0、 2、4、6 天注射的造模方式無論從安全性還是疼痛行為表現(xiàn)的時間節(jié)點方面,對于中醫(yī)藥防治CIPNP 作用機制的實驗研究和療效實驗研究都是最佳的造模方式,這種方式既保證了實驗過程中動物的安全性也為實驗提供了足夠的觀察指標和可靠的實驗數(shù)據(jù)。另外,表1 ~ 2 中的大鼠和小鼠CIPNP 模型絕大多數(shù)都是非中醫(yī)藥實驗研究中所選擇的CIPNP 模型,所以和中醫(yī)藥實驗研究中的CIPNP 模型選擇還是有一定區(qū)別的,雖然疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律是相同的,但中醫(yī)藥對于疾病的治療還是更趨向于慢性治療,所以即使在相同的造模方式下Wistar 雄性大鼠可以表現(xiàn)出更多的疼痛行為表現(xiàn)或者相同的疼痛行為表現(xiàn)[67-70];但還是選擇SD 雄性大鼠作為中醫(yī)藥實驗研究中CIPNP 模型最適合的大鼠種類選擇,是因為SD 雄性大鼠疼痛行為表現(xiàn)持續(xù)時間更長[67-75],更符合中醫(yī)藥治療的基本規(guī)律,見表4。

表4 大、小鼠CIPNP 模型在中醫(yī)中的應用Table 4 Rat and mice CIPNP model applied in traditional Chinese medicine

4 結語

根據(jù)國際癌癥研究機構(international agency for research on cancer,IARC)發(fā)布的全球癌癥2020 年統(tǒng)計數(shù)據(jù)中,女性乳腺癌位于2020 年全球惡性腫瘤發(fā)病率的榜首,約有230 萬例新發(fā)病例,占全部新發(fā)病例的11.7%,其次是肺癌,約有180 萬例新發(fā)病例,占全部新發(fā)病例的11.4%[2];而這些惡性腫瘤患者大部分要接受紫杉醇治療,在治療過程中或治療后,患者可能出現(xiàn)感覺障礙或在執(zhí)行特定的手動任務(如按鈕)時出現(xiàn)問題,且這些癥狀隨著劑量的累積,癥狀的程度可能會更嚴重,并可能導致多達25%使用紫杉醇治療的患者改變、減少或停止給藥,甚至有41%的患者在結束治療3 年后仍會出現(xiàn)癥狀,有14%的患者在停止治療13 年后,癥狀持續(xù)存在,上述情況不僅會導致患者生活質量的下降,還會增加醫(yī)療支出[4];而CIPNP 是一種復雜的疾病,依賴于不同化療藥物作用機制的多樣性,根據(jù)化合物的不同,化療藥物可導致各種神經(jīng)病變類型,包括感覺和/或運動、脫髓鞘和軸突、顱骨和自體神經(jīng)病變,所以其發(fā)病機制也尚未完全了解[76]。 為了解決上述疑難問題,選擇理想的動物模型是解決問題的關鍵,而大鼠和小鼠CIPNP 模型具有造模和行為檢測簡單方便、利用率高等優(yōu)點,成為了國內(nèi)外研究人類疾病發(fā)病機制和探索疾病防治原則的優(yōu)秀工具,具有十分廣闊的應用前景,為國內(nèi)外腫瘤學家研究化療后癌痛搭建了一座橋梁;在實驗研究中,可以根據(jù)研究課題的方向和實際情況所需要的模型特點來選擇符合臨床的動物模型,這對實驗數(shù)據(jù)結果的可靠性具有重要意義。 西醫(yī)方面尚無明確的治療方案可用于CIPNP,因為其確切的病理生理學尚不清楚,CIPNP 最常被認為是由于軸突病變導致的神經(jīng)性疼痛,其原因可能是軸突退化,然而,大多數(shù)治療神經(jīng)性疼痛的藥物,包括三環(huán)類抗抑郁藥和抗驚厥藥,都只能是減輕癥狀,且在CIPNP 中的療效最低,還具有不可逆的副作用,而現(xiàn)有的指南在美國臨床腫瘤學會(American Society of Clinical Oncology,ASCO)的指導下僅推薦度洛西汀作為治療CIPNP 的一線藥物治療[4,77]。 中醫(yī)藥因其獨特的辨證論治體系、安全有效且不良反應發(fā)生率低的優(yōu)勢,在紫杉醇化療后誘導的CIPNP 的治療方面得到了認可且被指南推薦,這可能與中醫(yī)藥能夠下調TLR4/NF-κB 和激活PI3K/Akt-Nrf2 通路或調控Wnt/β-catenin 信號通路以及下調脊髓組織中CCL2表達,來減輕炎癥反應有關[70,72,75],為此需要更精準、更符合臨床的動物模型來深入研究和探索具體的發(fā)病機制及治療作用機理。

目前國內(nèi)外對紫杉醇誘導的大或小鼠CIPNP模型的研究中,大多數(shù)實驗者選擇的觀察周期都不超過3 周(21 d),疼痛行為測試的時間節(jié)點選擇也是以每隔2 d 測試1 次或每周測試1 次為主[67-75],但在新的研究中發(fā)現(xiàn)動物嚴重的痛覺過敏在第3 周才開始,而熱痛覺過敏將持續(xù)8 周以上,機械性異位痛將持續(xù)12 周[78],所以在今后的實驗中建議實驗人員延長疼痛指標的觀察周期以及對行為測試時間間隔進行調整,以增加實驗結果的準確性。 目前動物模型在生物醫(yī)學上常應用于基礎研究、應用研究、發(fā)展性研究3 個實驗研究場景,其中大鼠和小鼠的基因組與人類基因組高度同源,可以模擬人類疾病的發(fā)展、診斷以及類似于人類的治療,所以常用于基礎研究中的機制研究、應用研究中的療效研究以及發(fā)展性研究;就本文來講機制研究是指CIPNP的發(fā)病機制和中醫(yī)藥對于大鼠或小鼠CIPNP 模型的作用機制也就是中醫(yī)藥與CIPNP 模型機體結構組成部分的相互關系,以及其間發(fā)生的某種生理、病理變化;療效研究是指評估中醫(yī)藥作為潛在治療藥物的有效性,發(fā)展性研究是指用應用創(chuàng)新的中醫(yī)藥研究成果和現(xiàn)有的醫(yī)學知識與技術,以發(fā)展創(chuàng)新技術為內(nèi)容而進行的研究實驗[79-81]。 在中醫(yī)藥治療紫杉醇誘導的CIPNP 機制研究及紫杉醇誘導的CIPNP 發(fā)病機制研究模型中,要在保證動物安全的基礎上,根據(jù)所研究的通路需要的觀察指標選擇合適的造模方式而且機制研究不需要很多的疼痛評估和療效的評價,1 ~ 2 種疼痛行為檢測方式就可以進行深入探討,所以SD 大鼠1 ~ 2 mg/kg,第0、2、4、6 天注射或者BALB/c 小鼠2 mg/kg,每天注射1 次, 共 5 次的造模方式最適用于機制研究[11-14,17,20-22,33,71]。 中醫(yī)藥治療紫杉醇誘導的CIPNP 療效研究要模擬臨床多次化療、多次注射形成的CIPNP 臨床情況且需要2 種以上的疼痛閾值評估手段,多種方式的評估更有利于全方面評估中醫(yī)藥療效,這樣就需要選擇能夠使動物出現(xiàn)多種疼痛行為變化而作為觀察指標的造模方式,所以大鼠2,9 mg/kg,第0、2、4、6 天注射或者瑞士白化小鼠2 mg/kg, 每天注射1 次,共5 次的造模方式最適用于中醫(yī)藥治療紫杉醇誘導的 CIPNP 療效研究[19,39,71]。 在中醫(yī)藥治療紫杉醇誘導的CIPNP 發(fā)展性研究模型中,其在于發(fā)展創(chuàng)新中醫(yī)藥可行性的評估,更加側重于研究療效結合機制,所以可以選擇單種或多種疼痛行為檢測,且造模時的注射劑量有多種選擇, 可選擇小劑量的雄性SD 大鼠2 mg/kg, 第1、3、5、7 天的造模方式[28,75],也可以選擇大劑量的雄性SD 大鼠15 ~ 18 mg/kg,第0、3 天的造模方式[41]。 而就目前中醫(yī)藥實驗所涉及的紫杉醇誘導的CIPNP 動物模型的應用來看,大多數(shù)實驗沒有根據(jù)實驗的研究范圍選擇適合的CIPNP 模型,這不僅會影響實驗結果的準確性,還會因不合理使用而浪費動物資源,建議在今后的實驗中,研究者要根據(jù)實驗研究的類型選擇符合實驗目的的CIPNP 模型。 對于現(xiàn)有的作用機制研究,總結起來就是可能與降低了炎癥反應有關,說明中醫(yī)藥治療紫杉醇誘導CIPNP 作用機制的研究還尚未明確,這與國內(nèi)目前缺乏中醫(yī)相關的大、小鼠CIPNP 模型的造模體系和如何將大、小鼠模型與紫杉醇所致CIPNP 中醫(yī)辨證相關的氣虛、血虛、寒凝、血瘀等分型相結合有直接關系,所以建議在今后的實驗中要建立與中醫(yī)相關的動物模型,將造模與中醫(yī)辨證理論相結合,這對于國內(nèi)外學者探索中醫(yī)藥防治CIPNP 的作用機理及CIPNP 的發(fā)病機理更具有指導意義。 并要利用中醫(yī)的獨特優(yōu)勢發(fā)揚中醫(yī)藥治療CIPNP,這還需要學者們進一步完善和建立中醫(yī)大、小鼠CIPNP 模型標準,不斷探索、發(fā)掘與研究,逐步形成療效更加確切的診療體系,從而使其獲得更廣泛的臨床應用。