基于改良大鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法建立血管性癡呆模型探討腦血流量變化規(guī)律及對血管新生相關(guān)蛋白的影響

陳婕,唐鑫,陳盼,謝紫薇,謝?；?張泓,鄒瑩潔,譚潔

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿與康復(fù)學(xué)院,長沙 410208)

血管性癡呆(cascular dementia,VD)是由于各種心腦血管疾病引起的腦組織病理改變進(jìn)而導(dǎo)致的一種慢性神經(jīng)退行性疾病,其特征為腦血流量減少所致的明顯認(rèn)知障礙[1-2],患者可能會出現(xiàn)思維遲鈍、健忘、抑郁、焦慮、定向障礙以及執(zhí)行功能的喪失等,實(shí)驗(yàn)中建立合適的動物模型以模擬慢性腦血量減少的病理狀態(tài),為VD 的病理生理學(xué)機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)[3-6]。

慢性 腦 灌 注 不 足 ( chronic cerebral hypoperfusion,CCH)是導(dǎo)致VD 的主要原因之一,可使其腦血流量(cerebral blood flow,CBF)持續(xù)下降,造成神經(jīng)血管單元失衡,產(chǎn)生氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、脫髓鞘、興奮性毒性、血腦屏障破壞等一系列損害,最終引發(fā)突觸損傷、白質(zhì)病變和腦萎縮等[1,7-8]。 動物實(shí)驗(yàn)中可通過慢性腦灌注不足的方法使腦血流量持續(xù)下降來建立VD 模型[9],改良大鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法是建立該模型方法之一,能較穩(wěn)定地表達(dá)其生理病理指標(biāo),使大鼠出現(xiàn)較明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙,且操作簡單、死亡率低,是較理想的VD 模型建立方法[10]。 因此,探索VD 動物模型腦血流量時間變化規(guī)律及對血管新生相關(guān)蛋白的影響,對評估該病預(yù)防、用藥及康復(fù)的療效很重要。

長期慢性的腦缺血能導(dǎo)致缺氧,暴露于此種環(huán)境會使大鼠腦結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生適應(yīng)性變化,即通過血管新生增加血管密度來緩解缺血缺氧,也許是大腦的一種血管重塑機(jī)制[11-12]。 缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor α,HIF-1α)是參與大腦血管新生和神經(jīng)發(fā)生的重要調(diào)節(jié)劑,能通過調(diào)節(jié)血管新生相關(guān)因子增強(qiáng)血管新生,其下游血管內(nèi)皮生長因子(cascular endothelial growth factor,VEGF)也是促進(jìn)腦缺血后血管新生的重要蛋白,可以高效促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂與增殖[13-15],增加血管新生,而血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)則能在腦缺血損傷中發(fā)揮抗炎以及促血管新生的功能[16-17],三者均可在腦缺血后促進(jìn)血管生成,幫助大腦重建微血管網(wǎng)絡(luò),緩解VD 的慢性腦缺血損傷。本研究以改良的雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法建立VD 大鼠模型,通過激光散斑襯比成像技術(shù)觀察其造模后2 h、 3、7、14、21 d 的腦血流量變化,并檢測造模后21 d 海馬中血管新生相關(guān)蛋白HIF-1α、VEGF、HO-1以及血清中抑炎因子IL-4、IL-10 的含量,為防治VD持續(xù)腦血流下降進(jìn)而引發(fā)的一系列病理損害提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康SPF 級雄性SD 大鼠36 只,6 ~ 8 周齡,體重180 ~ 200 g,購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司【SCXK(湘)2019-0004】,飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心【SYXK(湘)2019-0009】,溫度24~ 26℃,濕度50% ~ 70%,12 h 明暗交替環(huán)境,給予充足的食物和水。 所有操作均符合湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求并經(jīng)批準(zhǔn)(LL-2022101204)。

1.1.2 主要試劑與儀器

2%戊巴比妥鈉(Merck,P3761),IL-4 ELISA 試劑盒(Elabscience,E-EL-R0014c),IL-10 ELISA 試劑盒( Elabscience, E-EL-R0016c ), HIF-1α 抗體( Abcam, ab179483 ), VEGF-A 抗 體 ( ZENBIOSCIENCE,R26073), HO-1 抗體(Proteintech,10701-1-AP),β-tubulin 抗體(Proteintech,10094-1-AP),羊抗兔二抗(Abiowell,AWS0002a)。

激光散斑成像系統(tǒng)(Moor Intruments 公司,型號:Moor FIPI-2,英國),Morris 水迷宮系統(tǒng)(泰盟公司,型號:MT-200,中國),雙臂腦立體定位儀(眾實(shí)公司,型號:ZS-FDC,北京),化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(Bio-Rad 公司,型號:ChemiDocTMXRS + ,美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與造模

將36 只SD 大鼠隨機(jī)分成2 組,即假手術(shù)組(n= 18)和模型組(n= 18),具體操作方法如下:

模型組:術(shù)前禁食12 h,采用改良雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法建立VD 模型[10]。 2%戊巴比妥0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉,大鼠仰臥位,先后于頸正中線左右旁開0.5 cm 切口,逐層分離出雙側(cè)頸總動脈,用4-0 號縫合線分別在兩側(cè)頸總動脈近心和遠(yuǎn)心端結(jié)扎,共2 次,每次打4 次結(jié)以防止線脫落,留出一段動脈以便從兩端線結(jié)中間剪斷頸總動脈,然后逐層縫合切口,注意無菌操作。

假手術(shù)組:僅分離頸總動脈但不結(jié)扎,其他操作與模型組一致。

成模標(biāo)準(zhǔn):計(jì)算假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期平均值(A)、模型組大鼠逃避潛伏期平均值(B),算出B與A 的差并與B 比較得出比值(C),即C = (BA)/B,若C ≥20%,則判斷造模成功[18]。

1.2.2 成模率、死亡率及存活率統(tǒng)計(jì)

造模后第21 天統(tǒng)計(jì)模型組和假手術(shù)組的死亡率、存活率及成模率。

1.2.3 Morris 水迷宮行為學(xué)檢測

采用Morris 水迷宮行為學(xué)檢測在造模前和造模后第14 天[19]分別進(jìn)行大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測試。 水迷宮是一個平分為4 個象限的圓形水池,目標(biāo)象限中放一個無色透明平臺,加水高度為沒過平臺一手指厚度。 測試前在水中加入二氧化鈦粉末,使平臺不易被大鼠發(fā)現(xiàn)。 實(shí)驗(yàn)分為兩部分:(1)定位航行實(shí)驗(yàn)(共5 d):每天固定時間入水,打亂每天4 個象限入水順序,4 個象限分別入水1 次,共4 次(如第1天:1→2→3→4;第2 天:2→3→4→1),每次設(shè)置120 s,以大鼠爬上平臺并停留超過3 s 耗時記作逃避潛伏期,如120 s 內(nèi)未爬上平臺,則引導(dǎo)其上平臺并停留10 s,記其逃避潛伏期為120 s,計(jì)算第3、4、5天的4 個象限的平均耗時,并算出這3 d 平均耗時的平均值,即為最終逃避潛伏期。 (2)空間探索實(shí)驗(yàn)(第6 天): 撤去目標(biāo)象限的平臺,計(jì)時120 s 得出大鼠穿越目標(biāo)象限平臺區(qū)域的次數(shù),記為穿越平臺次數(shù)。

1.2.4 激光散斑襯比成像儀檢測

2%異氟醚呼吸麻醉,使用腦立體定位儀將大鼠頭部固定,于頭頂正中靠近耳前位置將大鼠頭部被毛除凈,碘酒消毒并使用眼科剪將頭頂被皮剪開約1.5 ~ 2.0 cm,以頭顱前囟點(diǎn)和人字點(diǎn)為長度,兩點(diǎn)連線左右旁開約0.5 cm 寬度作為觀察范圍,使用顱鉆將其顱骨磨薄,以肉眼能透過顱骨看到血管為最佳觀察厚度,用棉球蘸取0.9%生理鹽水輕輕涂抹于暴露的顱骨,進(jìn)行激光散斑襯比成像,記錄其腦血流量變化圖像。 使用moorFLPIReviewV50 軟件對圖像進(jìn)行分析,在一側(cè)大腦選擇感興趣的區(qū)域(ROI)計(jì)算出該側(cè)大腦腦流量變化值,左右腦各取一個面積相同的區(qū)域,計(jì)算出兩個區(qū)域的平均值作為最終的腦血流量變化值。

1.2.5 Western Blot 檢測

麻醉方法同1.2.1,大鼠麻醉后,每組隨機(jī)取6只大鼠,取雙側(cè)海馬組織,將海馬充分剪碎,加入裂解液,冰上靜置后使用組織破碎儀破碎;離心后取上清,-80℃冰箱保存。 使用BCA 試劑盒測定濃度并配置上樣緩沖液,蛋白變性、電泳、轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉,一抗4℃孵育過夜、二抗孵育,顯影得到目的條帶,使用Image J 軟件分析目標(biāo)條帶灰度值,用目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-tubulin 比值作為其相對表達(dá)含量變化。

1.2.6 ELISA 檢測

造模后21 d,麻醉大鼠,進(jìn)行腹主動脈采血,每只大鼠取5 ~ 10 mL 全血,靜置1 h,離心機(jī)預(yù)冷4℃,2307 r/min 離心15 min,取出上清保存,最后采用ELISA 法檢測大鼠血清中IL-4、IL-10 含量,根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行具體操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。 組間比較采用配對t檢驗(yàn),若滿足正態(tài)齊性和方差齊性則采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),若方差不齊則采用配對t′檢驗(yàn),若不滿足正態(tài)齊性則采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn);指標(biāo)隨時間變化比較采用重復(fù)測量單變量方差分析。 以P< 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成模率、死亡率和存活率統(tǒng)計(jì)

造模后21 d,假手術(shù)組共計(jì)死亡4 只,存活14只,死亡率為22.2%,存活率為77.8%;模型組共計(jì)死亡5 只,存活13 只,死亡率為27.8%,存活率為72.2%;模型組造模18 只,成模10 只,成模率為55.6%,見表1。

表1 各組造模后21 d 死亡、成活和成模數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Death, survival and vascular dementia numbers of each group were counted on 21 days after modeling

2.2 造模前后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較

造模前,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)均無顯著性差異(P> 0.05)。造模后14 d,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠的逃避潛伏期延長、穿越平臺次數(shù)減少,差異具有顯著性(P< 0.05),見表2。

表2 各組造模前后逃避潛伏期及穿越平臺次數(shù)比較(± s, n = 10)Table 2 Comparison of escape latency and platform crossing frequency before and after modeling in each group (± s, n = 10)

表2 各組造模前后逃避潛伏期及穿越平臺次數(shù)比較(± s, n = 10)Table 2 Comparison of escape latency and platform crossing frequency before and after modeling in each group (± s, n = 10)

注:與假手術(shù)組相比,*P < 0.05。 (下圖同)Note. Compared with the sham group, *P < 0.05. (The same in the following figures)

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2.3 造模前后大鼠腦血流量變化比較

組間比較發(fā)現(xiàn),造模前,假手術(shù)組和模型組間大鼠腦血流量變化差異無顯著性(P> 0.05);造模后2 h、3、7 d,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦血流量均降低,差異具有顯著性(P< 0.05);造模后14、21 d, 假手術(shù)組和模型組間大鼠腦血流量變化差異無顯著性(P> 0.05),見圖1。

圖1 各組造模前后腦血流量變化(n = 10)Note. Compared with before modeling, #P < 0.05.Figure 1 Changes of cerebral blood flow before and after modeling in each group(n = 10)

組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組腦血流量在術(shù)后2 h開始上升,于造模后3 d 升至最高,此后開始下降,在造模后14 d 降至基線(術(shù)前)水平,造模后21 d上升至超過基線水平。 模型組腦血流量在造模后2 h 降至最低(P< 0.05),下降了約為基線(造模前)的17.56%,此后開始恢復(fù),恢復(fù)高峰期發(fā)生在造模后3 ~ 7 d 之間,并在造模后14 d 恢復(fù)至基線水平,在造模后21 d 持續(xù)上升至超過基線水平,見圖1。

2.4 造模后21 d 大鼠海馬區(qū)HIF-1α、VEGF 及HO-1 蛋白表達(dá)比較

造模后21 d,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠海馬區(qū)HIF-1α、VEGF 及HO-1 蛋白表達(dá)含量顯著升高,差異具有顯著性(P< 0.05),見圖2。

圖2 各組HIF-1α、VEGF 及HO-1 蛋白表達(dá)水平(n = 6)Figure 2 Protein expression level of HIF-1α, VEGF and HO-1 in each group(n = 6)

2.5 造模后21 d 大鼠血清中IL-4、IL-10 含量比較

造模后21 d,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清中IL-4、IL-10 含量升高,差異具有顯著性(P<0.05),見圖3。

圖3 各組IL-4、IL-10 含量變化比較(n = 10)Figure 3 Comparison of IL-4 and IL-10 contents in each group(n = 10)

3 討論

目前研究表明,腦血流量持續(xù)降低引起的慢性腦低灌注是導(dǎo)致血管性癡呆認(rèn)知能力下降的主要驅(qū)動因素,涉及缺血、缺氧、氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥等病理動態(tài)過程[20-21],與該病的開始和進(jìn)展有關(guān),最終會損害海馬體、腦白質(zhì)和基底神經(jīng)節(jié)等腦組織,造成認(rèn)知功能障礙[22]。 持續(xù)且調(diào)節(jié)良好的血液供應(yīng)是腦維持正常生理代謝的關(guān)鍵,其耗氧量大且只能依賴于血液供氧,即使是慢性的腦血流量下降也可能對腦功能產(chǎn)生無法彌補(bǔ)的影響,因此,檢測VD腦血流量變化非常重要[22],而探究VD 在腦缺血后腦血流量時間變化規(guī)律也將有助于找到其預(yù)防和治療的介入關(guān)鍵時期。

腦缺血損傷發(fā)生后的3 ~ 7 d 可能是有效治療介入的關(guān)鍵時期[23-25],在此期間腦組織為了應(yīng)對缺血帶來的傷害,會通過增加血管新生相關(guān)蛋白的表達(dá)來促進(jìn)血管生成,增加腦血流量;以往的研究也發(fā)現(xiàn),VD 大鼠的腦血流量在造模后2 ~ 3 h 內(nèi)會降至最低,而在造模后1 d 內(nèi)開始恢復(fù),并于造模后7 ~ 14 d 內(nèi)得到顯著恢復(fù)[26-28],但造模后28 d 的腦血流量仍可能低于假手術(shù)組[29]。 因此,本研究采用改良大鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法立VD 模型,以造模前和造模后2 h、3、7、14、21 d 為觀察時間點(diǎn),通過激光散斑襯比成像系統(tǒng)檢測其腦血流量時間變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較,模型組大鼠的腦血流量變化在術(shù)后2 h、3、7 d 的顯著降低,而術(shù)后第14、21 天的變化無顯著差異,與之前的研究一致[30];組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組大鼠腦血流量在術(shù)后2 h 后開始上升,于造模后3 d 升至最高,此后開始下降,在術(shù)后14 d 降至基線(術(shù)前)水平,此后沿基線波動,這種變化可能是呼吸麻醉吸入異氟烷造成的,因其對大腦血管具有舒張作用,可使腦血流量顯著增加[31-32];模型組大鼠腦血流量在造模后2 h 下降最為明顯,下降值約為基線(造模前)的17.56%,此后開始恢復(fù),恢復(fù)高峰期發(fā)生在造模后的3 ~ 7 d,但仍低于假手術(shù)組,于造模后第14 天恢復(fù)至基線水平,與先前的研究一致[26-28]。

研究發(fā)現(xiàn),血管新生相關(guān)蛋白能在腦缺血后24 h 內(nèi)開始表達(dá),在腦缺血后3 ~ 7 d 便能達(dá)到峰值,其新生的血管也能在腦缺血后3 d 觀察到[25-33],這與本研究的腦血流量恢復(fù)高峰期時間一致;VD 造模后2 h 腦血流量下降至最低值,為了維持正常的腦血流量,血管生成蛋白被激活以產(chǎn)生新的微血管,因此血管重塑能力和血管生成在此過程中被啟動[29-34],腦組織通過上調(diào)VEGF 來激活腦血管生成,同時,作為缺氧基因表達(dá)的開關(guān)HIF-1α[35-36],能進(jìn)一步促進(jìn)VEGF 強(qiáng)大的血管新生作用[37],刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移,促進(jìn)新生血管發(fā)生、分化和穩(wěn)定;腦缺血損傷發(fā)生時,紅細(xì)胞大量破裂釋放游離的血紅素介導(dǎo)炎癥反應(yīng),損傷血管內(nèi)皮,HO-1 則通過分解游離血紅素來降低血紅素的生物利用度,產(chǎn)生抗氧化、抗炎以及促血管新生的效果[16-17],HIF-1α 也能介導(dǎo)HO-1 基因的轉(zhuǎn)錄激活以響應(yīng)缺血缺氧,發(fā)揮其抗炎和促血管新生作用[38];因此,HIF-1α、VEGF 以及HO-1 三者同時參與血管新生過程,能促進(jìn)腦血流量的恢復(fù)。 本研究發(fā)現(xiàn),造模后21 d,模型組大鼠海馬中HIF-1α、VEGF 以及HO-1 蛋白的表達(dá)均高于假手術(shù)組,同時,其血清中IL-4 和IL-10 的含量也出現(xiàn)升高,提示VD 大鼠可能通過自我修復(fù)提高HIF-1α、VEGF、HO-1 的表達(dá)來促進(jìn)血管新生,并抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng),進(jìn)一步證實(shí),腦缺血后,大腦可以通過血管新生蛋白的激活促進(jìn)新的微血管生成[11-12],幫助腦血流量的恢復(fù)。

綜上,本研究表明,改良的雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法建立的VD 大鼠模型腦血流量變化呈現(xiàn)一定時間規(guī)律,能在造模后隨時間自行恢復(fù);造模后21 d 海馬中HIF-1α、VEGF、HO-1 及血清中IL-4、IL-10 的含量增加,提示VD 發(fā)病后,大腦可能通過強(qiáng)大的血管新生能力,促進(jìn)腦血流量恢復(fù),抑制神經(jīng)炎癥,減輕其認(rèn)知功能損害。 VD 造模后血管新生蛋白的表達(dá)是否和腦血流量時間變化規(guī)律一致本文尚不清楚,因此,本課題組將進(jìn)一步展開實(shí)驗(yàn)探索VD 大鼠血管新生與腦血流量變化規(guī)律的關(guān)系。