足底注射完全弗氏佐劑致疼痛抑郁共病模型大鼠行為學及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)改變

羊璞粟勝勇王甜蘇虹

(1. 廣西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院,南寧 530023;2. 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院針灸科,南寧 530023;3. 廣西中醫(yī)藥防治醫(yī)學分子生物重點實驗室,南寧 530023)

慢性疼痛是指疼痛持續(xù)或間歇性超過12 周,在此過程中,慢性疼痛作為一種長期的應(yīng)激源常導致患者出現(xiàn)抑郁狀態(tài)[1]。 慢性疼痛和抑郁可相互疊加,造成患者功能下降,并影響預(yù)后,增加治療費用[2]。 疼痛和抑郁的共病可導致臨床診斷產(chǎn)生誤差,可能會造成治療時機的延誤,從而進一步增加患者負擔。 臨床上慢性炎性疼痛常與抑郁共存[3],但目前慢性炎性疼痛和抑郁發(fā)生的因果關(guān)系及內(nèi)在機制尚不清楚,因此,建立合理、可靠、易得的動物模型是進一步研究二者關(guān)系的基礎(chǔ)[4]。 基于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說研發(fā)的臨床藥物,如選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑、5-羥色胺去甲腎上腺素再攝取抑制劑,已被證實對疼痛抑郁共病具有療效,顯示出單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在慢性疼痛和抑郁共病中的關(guān)鍵作用[5]。 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)作用分別在疼痛和抑郁中的較多,但涉及慢性炎性疼痛抑郁共病的研究還較為少見,因此本實驗擬通過完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant,CFA)建立慢性炎性疼痛抑郁共病模型大鼠,觀察模型大鼠疼痛、抑郁樣行為學及海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化,為慢性炎性疼痛抑郁共病的基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

8 周齡SPF 級健康SD 雄性大鼠16 只,體重為180 ~ 220 g,購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司【SCXK(湘)2019-0014】,飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學分子生物學實驗室動物房【SYXK(桂)2019-0001】,飼養(yǎng)溫度23 ~ 25℃,相對濕度50% ~ 60%,12 h/12 h 晝夜節(jié)律,自由飲水攝食。本實驗所有操作符合動物福利倫理原則,并通過廣西中醫(yī)藥大學實驗動物福利倫理委員會的批準(DW20220523-106)。

1.1.2 主要試劑與儀器

蘇木素染色液、伊紅染色液(批號:BA-4041,BA-4024,珠海貝索生物技術(shù)有限公司);分化液(批號:C0163M,上海碧云天生物技術(shù)有限公司);5-HT、 DA、 NE (批號: E-EL-0033c, E-EL-0046c,E-EL-0047c, 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant,CFA),(批號:7009,美國Sigma-Aldrich 公司);異氟醚(批號:R510-22,深圳瑞沃德生命科技有限公司)。 40 cm × 23 cm × 15 cm 聚丙烯透明樹脂材料敞箱、48 cm × 34 cm × 39 cm 足底測試平臺、Von Frey 纖維絲(型號:NC12775-79,購自上海玉研科學儀器有限公司); 小動物專用麻醉機(型號:CDS9000,美國Harvard);熱板痛覺測試儀(型號:ⅡTC39, 美國Life Science);自動多功能酶標儀(型號:BioTek-Elx800,美國Thermo Fisher)。

1.2 方法

1.2.1 分組和造模

慢性炎性疼痛抑郁共病大鼠模型造模方法:參考文獻[6-9]的方法,大鼠用2%異氟醚吸入麻醉后,俯臥位固定,使用微量注射器給予大鼠左后爪足底表面注射CFA 100 μL,造模48 h 后,大鼠造模足出現(xiàn)明顯紅腫現(xiàn)象且痛閾值明顯下降,代表造模成功。 對照組注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 機械縮足閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT)

根據(jù)改良Up-down 法計算MWT[10],將大鼠放置于金屬篩網(wǎng)上的聚丙烯樹脂材料敞箱內(nèi),安靜15 min 后,以一系列標準化Von Frey 纖維絲垂直刺其左后肢足底中部皮膚,緩慢增加壓力使纖維絲呈現(xiàn)“C”或“S”型,并保持6 ~ 8 s,大鼠出現(xiàn)抬足、舔足、躲避等反應(yīng)時被視為陽性反應(yīng)。 使用公式MWT =(10[Xf+kδ])/10000 計算具體數(shù)值,其中Xf 為最后一支Von Frey 絲的壓力值;k 為陽性反應(yīng)組合相對應(yīng)的查表值,δ 為所用刺激間的平均差值(0.224)。

1.2.3 熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal lantency,TWL)

將大鼠置入有機玻璃箱中蓋上擋板使其適應(yīng)15 min,后用熱板痛覺刺激儀照射大鼠足底,照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避時間為熱縮足反射潛伏期。同一刺激部位刺激的間隔時間為10 min,記錄時間,每只大鼠連續(xù)測定3 次取平均值。

1.2.4 曠場實驗(open-field test,OFT)

有相關(guān)調(diào)查研究表明，動物及其產(chǎn)品質(zhì)量的高低，與動物的健康狀況有密切的聯(lián)系，與我國疫病控制的效果有較大的關(guān)聯(lián)。加強對動物疫病的監(jiān)測，一方面能降低動物發(fā)生疫病的概率；另一方面還能促使動物的生產(chǎn)以及養(yǎng)殖過程得到控制，進而提升動物及其產(chǎn)品的質(zhì)量。開展動物疫病監(jiān)測工作，能保證安全的動物及其產(chǎn)品進入到市場，使人們都能吃到放心的產(chǎn)品。如對于牛羊布魯氏等一些隱性的病菌，尋常的檢測手段難以發(fā)覺，但是通過動物疫病監(jiān)測以及對采樣的方式，能及時發(fā)現(xiàn)其血液中所存在的病害，警醒防疫機構(gòu)，使其提前做好防疫準備，并及時制止該肉制品流入到市場，有效保護了人們?nèi)罕姷娜松戆踩?/p>

將大鼠放置于黑色敞箱(50 cm × 50 cm × 40 cm)底部中心方格內(nèi)適應(yīng)15 min,設(shè)中心點附近20 cm ×20 cm 方形區(qū)域為中央?yún)^(qū),進行攝像和計時,記錄每只大鼠5 min 的運動總距離和中央?yún)^(qū)停留時間,兩只大鼠實驗之間用75%乙醇清潔曠場箱底部及四壁。

1.2.5 懸尾實驗(tail suspension test,TST)

使用醫(yī)用膠布將大鼠尾部距末端約1/3 處纏繞固定于懸尾儀上,使大鼠呈倒掛狀態(tài),采用攝像頭觀察并記錄大鼠在5 min 內(nèi)的不動時間。

1.2.6 強迫游泳實驗(forced swim test,FST)

將大鼠放入無蓋、透明的有機玻璃圓桶中,水深約30 cm,水溫(20 ± 2)℃,記錄5 min 內(nèi)大鼠累計不動時間(以四肢偶爾微小滑動保持頭部浮在水面露出鼻孔保持呼吸為“不動”標準),每只大鼠實驗后即換水并將大鼠擦干。

以上行為學實驗分別于造模前1 d,造模后3、7、14 d 進行。

1.2.7 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)測定

所有行為學實驗完成24 h 后,大鼠麻醉后開胸,暴露心臟,使用0.9%氯化鈉溶液灌注,待血液流盡后離斷頭部剝離出大腦組織。 4℃蒸餾水沖洗干凈后置于培養(yǎng)皿中,于冰上分離大腦,參照Paxinos-Watson 大鼠腦立體定位圖譜取海馬,鈍性分離出兩側(cè)大腦海馬組織,放入液氮中速凍后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?具體參照文獻[11-12]的方法,取兩組大鼠海馬組織于4℃下2000 r/min 離心10 min,收集上清液,檢測5-HT、DA、NE 的含量,按ELISA 試劑盒說明書的操作步驟進行。

1.2.8 海馬組織病理變化

海馬取材方法同上,海馬組織常規(guī)石蠟包埋后切片,厚度5 μm,脫蠟水洗后,HE 染色,光學顯微鏡觀察海馬組織形態(tài)變化。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計分析。 所有數(shù)據(jù)采用平均值± 標準差(±s)表示,數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊,多個時間點測量的結(jié)局比較采用重復測量方差分析,其余資料采用t檢驗比較組間差異,以P< 0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠疼痛行為學比較

造模前1 d,兩組大鼠的MWT 與TWL 對比,無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。 造模后,模型組大鼠造模3、7、14 d 的MWT 與TWL 均明顯降低,有統(tǒng)計學意義(P< 0.01),表明CFA 足底注射造?？煽焖僭斐纱笫髮C械痛敏和熱痛敏的敏感性增加。 見圖1。

圖1 兩組大鼠MWT 及TWL 比較Note. Compared with control group, **P < 0.01. (The same in the following figures)Figure 1 Comparison of MWT and TWL of rats in two group

2.2 大鼠抑郁樣行為學比較

造模前1 d 及造模3 d,兩組大鼠OFT 運動總距離、中央?yún)^(qū)停留時間對比無統(tǒng)計學意義(P> 0.05),造模后,模型組大鼠在造模7、14 d 的OFT 運動總距離低于對照組,有統(tǒng)計學意義(P< 0.01);模型組大鼠在造模7 d 的OFT 中央?yún)^(qū)停留時間與對照組對比無統(tǒng)計學意義(P> 0.05),但在14 d 的OFT 中央?yún)^(qū)停留時間低于對照組(P< 0.01);造模前1 d 及造模3 d,兩組大鼠的TST、FST 不動時間無統(tǒng)計學意義(P> 0.05),模型組大鼠在造模14 d 的TST 不動時間高于對照組,有統(tǒng)計學意義(P< 0.01),造模7 d 時,TST 不動時間無統(tǒng)計學意義(P> 0.05);模型組大鼠在造模7、14 d 的FST 不動時間增加,有統(tǒng)計學意義(P< 0.05,P< 0.01),說明CFA 造模7 d后即可出現(xiàn)部分絕望行為,在14 d 時癥狀更明顯。見圖2。

圖2 兩組大鼠OFT、TST、FST 指標比較Note. Compared with control group, *P < 0.05.Figure 2 Comparison of OFT, TST and FST of rats between the two groups

2.3 大鼠海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量比較

與對照組相比,模型組大鼠海馬5-HT、DA、NE含量均顯著降低,具有統(tǒng)計學意義(P< 0.01),可以認為CFA 足底注射14 d 后可導致大鼠海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)表達下降。 見圖3。

圖3 兩組大鼠海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量比較Figure 3 Comparison of monoamine neurotransmitters in hippocampus of rats between the two groups

2.4 大鼠海馬組織病理形態(tài)變化

對照組神經(jīng)元排列整齊,結(jié)構(gòu)完整,形態(tài)規(guī)則,染色清晰,細胞間隙均勻;模型組神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則,排列松散、紊亂,細胞間隙增大,部分細胞核模糊,出現(xiàn)部分神經(jīng)元固縮、凋亡。 見圖4。

圖4 大鼠海馬區(qū)病理形態(tài)改變Note. Black arrows. Normal cells. Red arrow. Unclear cell nuclei. Yellow arrow. Intercellular space. Blue arrow. Neuronal contraction and apoptosis.Figure 4 Pathological changes in the hippocampus of rats

3 討論

臨床中眾多炎性疼痛疾病與抑郁具有高度共患性,如膝骨關(guān)節(jié)炎、類風濕關(guān)節(jié)炎、慢性盆腔炎[3,13-14],早期證據(jù)表明,神經(jīng)突觸間隙單胺遞質(zhì)的濃度的高低影響了慢性疼痛與抑郁障礙的發(fā)生發(fā)展[1],研究顯示腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)失衡是疼痛抑郁共病的重要機制之一,針對海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)探討慢性疼痛抑郁共病的發(fā)病機制具有顯著意義[15]。 近年疼痛抑郁共病研究數(shù)量急劇增加,顯示出研究人員對這兩種疾病共病狀態(tài)的高度關(guān)注,建立相關(guān)共病的動物模型有助于進一步探索二者之間關(guān)系,并有助于新治療方式的開發(fā)。 近年慢性疼痛抑郁共病造模方法眾多,可通過神經(jīng)病理性疼痛及炎癥性疼痛誘導[16],也有研究通過腹腔注射利血平快速誘導,各種造模方法產(chǎn)生的疼痛及其誘導的抑郁具有差異,且各有優(yōu)劣,選用適合的造模方法是研究方案制定的前提和基礎(chǔ)[15,17]。

CFA 是一種含有滅活的結(jié)核分枝桿菌的油包水乳劑,能夠提供刺激性強且持久的免疫反應(yīng)所需的抗原釋放,在足底或脛骨關(guān)節(jié)內(nèi)注射可制作外周慢性炎性疼痛模型[18],導致動物產(chǎn)生機械性痛覺異常及熱痛覺過敏,單次注射后其效果至少可維持以21 d。 也有研究為確保疼痛癥狀的持續(xù),在首次注射10 d 后再次注射CFA[19]。 另有實驗研究選用C57/B6 小鼠,分別在第1 、7 、14 天于后足底表面3 次注射20 μL CFA,此方法適用于較長周期的動物行為學觀察實驗[20]。 在以往研究中,發(fā)現(xiàn)CFA的用量有10 ~ 100 μL 不等,大小鼠品系不同也會影響用量的多少[21]。 本研究探索性的采用足底注射CFA 100 μL 誘導大鼠慢性炎性疼痛癥狀,結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模3 d 后大鼠的MWT 和TWL 即大幅降低,且疼痛效果持續(xù)時間可超過14 d,提示CFA 100 μL足底注射可快速誘導大鼠的機械性痛覺異常及熱痛過敏,這與前期研究[22]結(jié)果一致。 疼痛感覺是相關(guān)情緒和認知功能活動的基礎(chǔ),慢性疼痛可導致大鼠獎賞機制缺陷和快感缺失,OFT、FST、TST 是用于評估動物行為絕望的檢測方法,本研究結(jié)果顯示,造模7 d 后,模型組大鼠出現(xiàn)OFT 運動總距離降低和FST 不動時間增多,造模14 d 后出現(xiàn)了OFT 運動總距離和中央?yún)^(qū)停留時長減少、FST、TST 不動時間增加,提示CFA 100 μL 注射在第7 天即可誘導出動物的部分抑郁行為,這與Wang 等[6]的研究結(jié)果基本類似。

5-HT、DA、NE 是參與情緒活動、疼痛傳遞的重要生化物質(zhì),濃度降低及其受體功能低下可間接導致(下丘腦-垂體-腎上腺)HPA 軸功能亢進,形成慢性疼痛或者情志改變[23],另有研究也顯示在慢性疼痛和抑郁患者體內(nèi)均可發(fā)現(xiàn)5-HT、DA、NE 水平和功能的減退。 以往研究證實CFA 導致的慢性炎性疼痛抑郁共病與炎癥因子有關(guān),但針對單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的研究卻少有提及[24]。 因此本研究以單胺類神經(jīng)遞質(zhì)為切入點進一步研究二者關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),CFA 注射后可導致海馬內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量降低,證實了CFA 誘導的慢性炎性疼痛及共患抑郁樣行為,其機制可能與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)減少密切相關(guān)。

海馬體作為大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分,是炎性疼痛和抑郁聯(lián)系的一個關(guān)鍵部位[22]。 海馬神經(jīng)元的凋亡是介導疼痛抑郁出現(xiàn)的關(guān)鍵病理變化[25]。 本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,模型組大鼠海馬細胞形態(tài)改變,神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則,排列松散、紊亂,細胞間隙增大,部分細胞核模糊,出現(xiàn)部分神經(jīng)元固縮、凋亡。 提示海馬神經(jīng)元損傷情況與行為學實驗結(jié)果相一致。

本研究存在部分局限性:目前CFA 致疼痛抑郁的藥物使用劑量不統(tǒng)一,未對不同梯度劑量CFA 足底注射對大鼠行為學的影響進行研究,以探索建立慢性炎性疼痛抑郁共病模型所需的合適劑量;另外本研究只進行了為期14 d 的行為學觀測,研究周期相對較短,在未來研究中會繼續(xù)延長觀察周期,為后續(xù)干預(yù)措施選擇合理的介入時機提供參考。