沙苑子總黃酮顯色條件及提取工藝優(yōu)選研究

李 婷 汪小玉 稅丕先 張家偉 石厚銀 沈驊睿

1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川瀘州 646000；2.西部醫(yī)藥技術(shù)轉(zhuǎn)移中心臨床研究部，四川成都 610041；3.四川奧邦古得藥業(yè)有限公司制劑部，四川成都 610000；4.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院骨傷科，四川瀘州 646000

沙苑子為豆科扁莖黃芪（Astragalus complanatusR.Br）的干燥成熟種子[1]，可補(bǔ)腎助陽、固精縮尿、養(yǎng)肝明目，常用于遺精早泄、腎虛腰痛、肝腎不足[2]。其主要成分有多糖、黃酮[3]、酚類[4]、甾醇類[5]等，黃酮類是其主要有效成分。藥理研究表明沙苑子總黃酮有抗腫瘤[6]、抗肝損傷[7]、抗炎[8]、抗疲勞、抗衰老[9]、免疫調(diào)節(jié)[10]等作用。本研究為提高總黃酮提取率，進(jìn)一步開發(fā)利用沙苑子，以蘆丁為對(duì)照品，篩選NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 法和AlCl3法兩種黃酮含量測(cè)定方法，比較不同脫脂、提取方法對(duì)總黃酮含量的影響，并采用單因素結(jié)合正交試驗(yàn)的方法優(yōu)選沙苑子總黃酮的最佳顯色條件及提取工藝，以期為其質(zhì)量控制及后期開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

沙苑子中藥飲片（產(chǎn)地：陜西，批號(hào)：180201-1）購(gòu)自瀘州百草堂中藥飲片有限公司；蘆?。兌龋?9.47%，批號(hào)：MUST-19010210）購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV 1700PC 型紫外分光光度計(jì)（上海鳳凰光學(xué)儀器有限公司）；B843662903 型十萬分之一天平（上海梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易上海有限公司）；JOYN-10A型超聲機(jī)（上海喬躍電子科技有限公司）；RE20000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品及標(biāo)準(zhǔn)品溶液配置

沙苑子藥材105℃烘干后粉碎，稱取過40 目篩的粉末1 g 于圓底燒瓶中，加入80%乙醇30 ml，80℃提取2 h，提取2 次，合并提取液定容至100 ml 備用。精密稱取105℃下干燥至恒重的蘆丁標(biāo)品5 mg 于50 ml 容量瓶中以60%乙醇定容，搖勻備用。

2.2 顯色方法考察

2.2.1 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 法 分別吸取2 ml 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25 ml 容量瓶中，分別加入0.3 ml 5%NaNO2溶液搖勻并靜置6 min、0.3 ml 10% Al（NO3）3溶液搖勻并靜置6 min、4 ml 4%的NaOH 溶液，蒸餾水定容，搖勻并靜置15 min。

2.2.2 AlCl3法 分別吸取樣品和標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.8 ml于10 ml 容量瓶中，加入60%乙醇1.2 ml、2% AlCl3溶液0.8 ml、1 mol/L 醋酸-醋酸鈉緩沖液1.2 ml，60%乙醇定容，搖勻，室溫下放置30 min。

紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果見圖1 ～2，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 法僅蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在510 nm 處有最大吸收峰，樣品溶液無相同最大吸收峰；AlCl3法蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液在420 nm 處均有最大吸收峰。因此沙苑子總黃酮含量測(cè)定應(yīng)采用AlCl3法。

圖1 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 法

2.3 顯色條件的優(yōu)化

2.3.1 單因素考察 分別吸取樣品溶液0.8 ml，考察AlCl3溶液用量（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml），AlCl3溶液濃度（1%、2%、3%、4%），顯色時(shí)間（10、20、30、40 min），醋酸-醋酸鈉緩沖液pH 值（3.6、4.5、5.4、7.0），醋酸-醋酸鈉緩沖液用量（0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 ml）對(duì)總黃酮含量的影響。結(jié)果見圖3 ～7。

圖4 AlCl3 濃度的影響

圖5 時(shí)間的影響

圖6 醋酸-醋酸鈉緩沖液pH 值的影響

圖7 醋酸-醋酸鈉緩沖液用量的影響

2.3.2 顯色條件正交試驗(yàn) 選擇AlCl3用量（A）、AlCl3濃度（B）、顯色時(shí)間（C）、緩沖液用量（D）建立4因素3水平表，見表1。試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見表2。結(jié)果顯示，影響總黃酮含量的主次因素為D＞A＞B＞C，最佳顯色條件為A1B1C1D3，即2% AlCl30.6 ml，pH 4.5的緩沖液2.0 ml，室溫顯色20 min。3 次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示吸光度平均值為0.934 L/（g·cm），RSD為1.16%，重復(fù)性良好。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 正交試驗(yàn)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取蘆丁溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6 ml于6 個(gè)10 ml 容量瓶中。以AlCl3法最優(yōu)條件顯色，于420 nm 處測(cè)定吸光度。以蘆丁濃度和吸光度為橫、縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：A=2.0586C+0.01（r=0.9996）。結(jié)果表明，蘆丁在40 ～160 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 提取方法考察

分別稱取石油醚脫脂后藥材粉末1 g 于3 個(gè)100 ml 圓底燒瓶，加入80% 乙醇20 ml（料液比1 ∶20）分別超聲提取、80℃溫浸、80℃回流提取1.5 h，抽濾，濾液備用。將3 種提取液分別顯色后，于420 nm 處測(cè)吸光度。結(jié)果見表3，其中以回流提取法提取沙苑子總黃酮最佳。

表3 沙苑子總黃酮的含量

2.6 提取條件的優(yōu)化

2.6.1 提取單因素考察 準(zhǔn)確稱取1 g 藥材粉末，考察不同乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%），提取溫度（50、60、70、80、90℃），提取時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5、3 h），料液比（10、15、20、25、30、35、40 g/ml），提取次數(shù)（1、2、3 次）對(duì)提取效率的影響。因素水平結(jié)果見表4。

表4 提取條件因素水平

2.6.2 提取工藝正交試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以及各因素所取水平范圍，選定L9（34）正交表，對(duì)乙醇濃度（A），提取溫度（B），提取時(shí)間（C），料液比（D）4 個(gè)因素進(jìn)行考察。正交試驗(yàn)及方差分析見表5 ～6。結(jié)果表明，影響沙苑子總黃酮提取的4 個(gè)因素均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，主次因素為C＞D＞B＞A，最佳提取條件為A1B3C3D1，即70%乙醇，85℃提取2 h，料液比1 ∶25（g/ml），提取2 次。

表5 提取條件正交試驗(yàn)

表6 方差分析

2.7 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證最佳提取工藝的穩(wěn)定性，進(jìn)行3 次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，見表7。結(jié)果顯示沙苑子平均總黃酮含量為24.50 mg/g，RSD＜2%，可知沙苑子總黃酮提取最佳工藝的重復(fù)性良好，該提取工藝合理且可行。

表7 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用紫外-可見分光光度法，以單因素結(jié)合正交試驗(yàn)法，考察了顯色及提取工藝對(duì)沙苑子總黃酮含量的影響。結(jié)果表明，AlCl3法適用于其含量測(cè)定，最佳顯色條件為0.8 ml 提取液加入1.2 ml 60% 乙醇，2% AlCl3溶液0.6 ml、pH 4.5 的醋酸-醋酸鈉緩沖液2 ml，60%乙醇定容至刻度，室溫靜置20 min。以回流提取法提取效果最佳，最佳工藝為70%乙醇85℃回流提取2 次，每次2 h，料液比1 ∶25（g/ml）。重復(fù)性較好，平均總黃酮含量RSD=1.87%，沙苑子總黃酮含量為24.50 mg/g。

目前黃酮的測(cè)定方法主要有比色法[11]、HPLC法[12]、薄層色譜法[13]等。NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法中，黃酮類物質(zhì)先被NaNO2還原，再與Al（NO3）3生成螯合物，NaOH 使黃酮開環(huán)，溶液變?yōu)榧t橙色[14]。蘆丁中有鄰二酚，3-、5-OH，AlCl3可與之螯合，形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，表現(xiàn)為黃色的顏色反應(yīng)，在410 nm 左右有最大吸收[15]。經(jīng)檢測(cè)，沙苑子黃酮與AlCl3反應(yīng)在420 nm 處有最大吸收，可能與其黃酮中含有鄰二酚、3-和5-OH 等基團(tuán)有關(guān)。紫外-可見分光光度法測(cè)定總黃酮含量具有操作簡(jiǎn)單、測(cè)定快速、對(duì)儀器要求不高等優(yōu)點(diǎn)。本研究方法操作簡(jiǎn)便、可行性高，為沙苑子的進(jìn)一步開發(fā)研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。